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Quelle longueur d'onde utiliser pour déterminer les algues à l'aide d'un colorimètre ?

Quelle longueur d'onde utiliser pour déterminer les algues à l'aide d'un colorimètre ?


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Je fais un projet de Biologie impliquant les mesures de la densité des algues (Nannochloropsis) par colorimétrie d'absorbance. Sur quelle longueur d'onde dois-je régler mon colorimètre ?

Le problème est qu'il existe deux types de chlorophylle, chacun avec un optimum d'absorbance différent. Que faire?


De Biotek J'ai appris ce qui suit :

Les balayages spectraux des cultures d'algues démontrent une absorbance significative en dessous de 400 nm ainsi que deux pics d'absorbance distincts à 440 nm et 675 nm (Figure 1). La détermination du nombre de cellules est plus cohérente lorsque la diffusion de la lumière est utilisée plutôt que l'absorbance par les constituants cellulaires. Afin d'éviter l'influence du matériau absorbant 600 nm [est le meilleur] pour surveiller la croissance.


Figure 1. Courbe spectrale d'absorbance des cultures en suspension de Microcystis aeruginosa. Source : Biotek


Concentration et colorimétrie

Vos élèves ont-ils du mal avec le concept de concentration? Ont-ils du mal à prendre M1V1 = M2V2 au-delà de la mémorisation par cœur à l'application réelle? Essayez d'expérimenter avec des solutions colorées ! L'intensité de la couleur fournit un excellent repère pour aider les élèves à visualiser le concept, et le colorimètre PASPORT permet aux élèves de quantifier l'activité.

Tout d'abord, préparez une solution mère de colorant bleu et étiquetez-la « 1,0 M ». Demandez aux élèves de préparer différentes concentrations à partir de la solution mère. Application de M1V1 = M2V2 est nécessaire pour compléter le tableau et préparer les solutions.

Concentration à préparer (M) Volume de solution mère 1,0 M (mL) Volume d'eau (mL) Volume total de nouvelle solution (mL)
0.0 0 10 10
0.2 10
0.4 10
0.6 10
0.8 10
1.0 10 0 10

A partir de là, ils pourront distinguer visuellement les concentrations des solutions, et ils pourront également quantifier cet effet à l'aide du Colorimètre.

Étant donné que le colorimètre peut mesurer simultanément le % de transmission et l'absorbance à quatre longueurs d'onde, les élèves seront en mesure de déterminer la relation entre la couleur de la solution qu'ils voient et la couleur de la lumière qui est affectée par la solution.

Videz le colorimètre en appuyant sur le bouton vert avec de l'eau distillée dans la cuvette, puis créez des affichages numériques des données de % de transmission et d'absorbance des quatre longueurs d'onde. Passez à l'échantillonnage manuel et insérez la solution 1,0 M dans le colorimètre.

La solution bleue transmet principalement la lumière bleue. C'est pourquoi il apparaît bleu à nos yeux. La solution bleue absorbe principalement la lumière orange car l'orange est la couleur complémentaire. La lumière orange étant la plus affectée, l'analyse doit être effectuée à la longueur d'onde de 610 nm.

Maintenant que les élèves ont déterminé la meilleure longueur d'onde à étudier, ils peuvent commencer à quantifier les différentes concentrations de la solution. Mais comment savent-ils s'il faut regarder l'absorbance ou le % de transmission ? Ils peuvent faire les deux et comparer !

Créez une page avec un tableau et un graphique contenant la concentration (axe des x) et le % de transmission orange (axe des y). Entrez maintenant les concentrations des solutions que vous avez préparées. Une fois saisies, placez chaque cuvette dans le colorimètre et conservez la valeur.

Répétez le processus en utilisant l'absorbance orange au lieu du % de transmission orange. En utilisant la fonction d'axe y multiple de SPARKvue ® vous pouvez comparer les deux mesures sur un seul graphique.

Les données d'absorbance fournissent une ligne beaucoup plus droite. Cette relation entre absorbance et concentration est à la base de la loi de Beer. Les élèves peuvent appliquer cette relation nouvellement construite pour déterminer la concentration de solutions bleues inconnues en fonction des données d'absorbance.

Cette activité simple avec du colorant bleu et un colorimètre a permis à vos élèves de visualiser et de quantifier la concentration en voyant les différences dans les solutions et en mesurant avec le colorimètre PASPORT. En même temps, ils construisent des concepts fondamentaux de colorimétrie/spectroscopie, y compris comment sélectionner la longueur d'onde appropriée et la loi de Beer.


Quelle longueur d'onde utiliser pour déterminer les algues à l'aide d'un colorimètre ? - La biologie

UNE spectrophotomètre est un instrument qui fait passer une longueur d'onde sélectionnée de rayonnement électromagnétique à travers une solution et mesure la quantité de rayonnement électromagnétique que la solution absorbe (ne laisse pas passer) ou transmet (laisse passer). Référez-vous un instant au spectre électromagnétique indiqué sur la page liée, (à partir de La vie, la science de la biologie, par Purves et al., 5 e éd., 1998). Un type de spectrophotomètre utilise des longueurs d'onde ultraviolettes (UV), ce sont les longueurs d'onde qui provoquent les coups de soleil, par exemple. Un autre type utilise des longueurs d'onde infrarouges (IR), qui sont plus connues sous le nom de chaleur. Vous aurez peut-être l'occasion d'en utiliser un dans un autre cours. Le troisième type de spectrophotomètre, que nous utiliserons dans ce cours, utilise les longueurs d'onde visibles, que nous considérons comme les différentes couleurs de la lumière, allant du violet au rouge. Comme ce sont les couleurs familières, ce type de spectrophotomètre est appelé « colorimètre ». Le modèle particulier que nous utiliserons est le colorimètre Spectronic 20.

Puisque vous utiliserez le colorimètre Spectronic 20 dans trois types d'activités de laboratoire assez différents ce semestre, vous devez comprendre comment il fonctionne et comment l'utiliser correctement. Colorimétrie est une procédure dans laquelle un colorimètre est utilisé pour analyser la composition des solutions, de l'une des deux manières décrites ci-dessous. On pourrait aussi appeler ça spectrophotométrie visible, puisque nous utilisons des longueurs d'onde visibles. Spectrophotométrie UV et Spectrophotométrie IR utiliseraient des longueurs d'onde ultraviolettes ou infrarouges, respectivement bien sûr, celles-ci nécessiteraient des instruments différents, puisque le Spectronic 20 est conçu pour produire et détecter uniquement les longueurs d'onde visibles.

Le phénomène d'absorption du rayonnement électromagnétique vous est déjà familier à bien des égards. Par exemple, l'exposition de la peau au soleil assez longtemps produit un « coup de soleil ». C'est le résultat de molécules dans les cellules de la peau absorbant le rayonnement UV de la lumière du soleil. Le but d'un écran solaire frotté sur la peau est de fournir d'autres molécules pour absorber ce rayonnement UV avant qu'il n'atteigne la peau. Le point? Les molécules absorbent le rayonnement électromagnétique, et cette absorption peut être détectée . un coup de soleil fait mal ! Dans un autre exemple familier, les molécules d'eau dans les aliments absorbent le rayonnement micro-ondes (longueurs d'onde à l'extrémité longue de l'infrarouge) dans un four à micro-ondes. Le résultat facilement détectable est que la nourriture devient chaude !

Supposons que nous ajoutions une goutte de colorant alimentaire vert à une tasse d'eau et une goutte de colorant alimentaire jaune à une autre tasse d'eau. Chacun de ces colorants alimentaires (colorants) est un type différent de molécule organique. Imaginez mettre ces deux solutions dans des tubes à essai séparés et les tenir contre la lumière de la fenêtre. Vous les voyez comme des couleurs différentes parce que les molécules de colorant en solution absorbent (c'est-à-dire filtrent) différentes longueurs d'onde de lumière et transmettent (c'est-à-dire laissent passer) différentes longueurs d'onde à votre œil. La solution verte apparaît verte car ce type de molécule de colorant absorbe principalement les longueurs d'onde autre que vert. De même, la solution jaune apparaît jaune car ce sont les longueurs d'onde dans la partie jaune du spectre que les molécules en solution ne pas absorber ce sont donc principalement les longueurs d'onde jaunes qui atteignent votre œil après avoir traversé la solution. Ainsi, le qualité de la lumière (qualité signifie type, type) qui est absorbée dépend de la taper de molécule dissoute dans le solvant. Différents types de molécules, tels que le colorant vert par rapport au colorant jaune, absorberont différents types (longueurs d'onde) de lumière.

Les quantité de la lumière absorbée dépend de la concentration du soluté dissous qui absorbe la lumière. Plus de lumière d'une longueur d'onde donnée sera absorbée si vous augmentez la concentration du soluté. Pour reprendre l'exemple du colorant alimentaire, deux gouttes de colorant vert par tasse d'eau produiront une solution qui apparaîtra d'un vert légèrement plus foncé qu'une solution faite avec une seule goutte de colorant vert. Les deux solutions absorbent les mêmes longueurs d'onde non vertes, mais la quantité de lumière non verte absorbée est plus importante dans la solution plus concentrée. Cette distinction entre la qualité et la quantité de lumière absorbée (ou transmise) par une solution est importante en biologie : propriétés qualitatives ou phénomènes (quel genre ou type) versus propriétés quantitatives ou phénomènes (combien/nombreux).

Dans certains types de tests de laboratoire, l'investigateur veut savoir quelles longueurs d'onde du spectre sont absorbées par les solutés dans une solution. Cela peut aider à identifier un soluté, car différents types de molécules absorbent différentes longueurs d'onde. Reportez-vous aux spectres d'absorption (spectres au pluriel de spectre) des pigments photosynthétiques indiqués sur la page liée (à partir de La vie, la science de la biologie, par Purves et al., 5 e éd., 1998). A noter que chaque pigment a un profil de longueurs d'onde différent qu'il absorbe plus ou moins fortement. Ce profil est une trace de « pics » et de « vallées » et certains pics peuvent avoir des « épaulements » sur leurs pentes. Comprenez qu'un spectre d'absorption est un graphique de l'absorption de la lumière (variable dépendante) en fonction de la longueur d'onde (variable indépendante). Encore une fois, il peut être possible d'identifier un type de molécule sur la base de son profil caractéristique (motif) de longueurs d'onde absorbées. Vous allez produire un tel spectre d'absorption dans le laboratoire d'aujourd'hui, pour voir avec quelle facilité cela peut être fait.

Dans d'autres types de tests de laboratoire, l'investigateur souhaite déterminer la concentration d'un soluté spécifique dans une solution. Dans ce type d'application de la colorimétrie, le spectre d'absorption du soluté d'intérêt a déjà été déterminé. Ainsi, sur le colorimètre, nous sélectionnons une longueur d'onde que le soluté est connu pour absorber fortement. En se référant à nouveau au graphique des spectres d'absorption, pour le pigment appelé phycoérythrine, 565 nm serait la meilleure longueur d'onde. On pourrait dire que c'est l'emplacement de la longueur d'onde du "pic" le plus élevé dans le spectre d'absorption de la phycoérythrine. Pour utiliser à nouveau cet exemple de colorant vert, une série de tubes à essai contenant différentes concentrations de colorant apparaîtraient tous verts mais avec différentes profondeurs de vert. Cela signifie que les solutions absorberaient toutes les mêmes longueurs d'onde mais différentes quantités de lumière. Votre œil pourrait voir des différences relatives dans la profondeur du vert entre les tubes, mais le colorimètre quantifierait ces différences pour vous, c'est-à-dire attribuerait des valeurs numériques à combien de la lumière entrant dans la solution a été absorbée et quelle quantité a été transmise. La quantité relative de lumière d'une longueur d'onde donnée qui est absorbée par une solution est appelée absorbance (A), tandis que la fraction de lumière entrant dans la solution qui traverse sans entrave est appelée pourcentage de transmission (%T). Vous utiliserez cet aspect quantitatif de la colorimétrie la semaine prochaine en laboratoire lorsque vous effectuerez la procédure du biuret pour mesurer les concentrations en protéines des solutions.

Observation du spectre visible à l'intérieur du colorimètre Spectronic 20

1. Tournez le interrupteur dans le sens des aiguilles d'une montre pour allumer l'instrument, vous entendrez / sentirez le clic. Les témoin lumineux devrait briller et vous entendrez peut-être le doux bruit du ventilateur de refroidissement à l'intérieur. Si la lampe témoin ne s'allume pas sur l'un de ces instruments, ne vous inquiétez pas. Pour le moment vous pouvez ignorer les autres utilisations des deux boutons en façade de l'instrument.

2. Reportez-vous à l'illustration de l'instrument ci-dessous. Chaque solution que vous testerez est placée dans un petit tube à essai, appelé tube de colorimètre, qui est inséré dans le porte-échantillon. Le faisceau lumineux, quelle que soit la longueur d'onde choisie, traverse le tube dans le support de droite à gauche.

3. Dans votre support de tubes à essai se trouve un tube de colorimètre contenant une bande rectangulaire de papier blanc qui est un peu plus courte que la longueur du tube et juste assez large pour s'adapter parfaitement au tube du colorimètre. Insérez ce tube dans le support (en le poussant complètement vers le bas) faites pivoter le tube de sorte que le faible faisceau lumineux entrant dans le tube par la droite frappe la surface plane du papier.

4. Placez votre main autour du haut du porte-échantillon ouvert et regardez attentivement dans le tube pour voir le faible lumière réfléchie sur le papier. Vous devrez avoir votre œil près de votre main en coupe (près du haut du tube) car la lumière est faible. Si la lumière de la pièce est trop vive, l'instructeur éteint les lumières de la pièce pendant un moment.

5. Lorsque vous tournez le bouton de commande de longueur d'onde, vous verrez la lumière réfléchie par le papier passer du violet/bleu (environ 400 nm) au vert au jaune à l'orange et enfin au rouge (environ 700 nm). La lampe à l'intérieur de l'instrument produit une lumière blanche (un mélange de toutes les longueurs d'onde), mais le bouton de commande de longueur d'onde filtre tout sauf celui que vous sélectionnez. En fonctionnement normal (c'est-à-dire sans papier dans le tube du colorimètre), la lumière que vous voyez réfléchie entrerait dans le tube contenant une solution à tester et une partie de celle-ci passerait de l'autre côté (gauche) du tube pour frapper un détecteur, qui convertirait cette lumière en un signal électrique qui s'enregistre sur le échelles de transmission et d'absorbance.

6. Retirez le tube de la chambre d'échantillon et replacez-le dans le support de tubes à essai.

7. En fonctionnement normal, le couvercle du porte-échantillon est toujours fermé après l'insertion du tube d'échantillon, avant d'enregistrer les mesures, pour empêcher la lumière parasite.

Standardisation du colorimètre pour déterminer le spectre d'absorption de la riboflavine, la vitamine

Lorsque la lumière traverse une solution dans un tube colorimétrique, une petite fraction de cette lumière peut être absorbée par le verre du tube et par le solvant dans lequel la molécule d'intérêt est dissoute. De plus, comme vous le verrez dans votre prochain exercice de laboratoire (le test du biuret pour mesurer les protéines dans les solutions), la solution dans le tube peut contenir d'autres substances nécessaires pour produire la couleur que vous mesurez. Étant donné que de nombreux types de molécules ne sont pas colorées, elles doivent réagir avec quelque chose qui produira une couleur avant de pouvoir utiliser le colorimètre pour les mesurer. N'importe quoi traversée par la lumière peut absorber une partie de la lumière et influencer les mesures. Étant donné qu'il s'agit de mesurer l'absorption d'un type particulier de molécule dans une solution, il est nécessaire de corriger (pour « soustraire ») l'absorption de la lumière par tout le reste (le verre du tube à essai, le solvant, réactifs présents). Pour ce faire, vous standardiser l'instrument avant de faire vos mesures.

La riboflavine est une vitamine hydrosoluble. La solution jaune dans l'un des tubes de votre portoir contient de la riboflavine dissoute dans de l'eau, 0,017 mg/mL, rien d'autre n'est présent. Afin d'obtenir les données les plus précises possibles pour déterminer le spectre d'absorption de la riboflavine, vous devez standardiser le colorimètre pour corriger l'absorption lumineuse par le verre et le solvant (l'eau dans ce cas). Par conséquent, vous avez un autre tube contenant uniquement de l'eau, c'est-à-dire, tout sauf la molécule d'intérêt, la riboflavine ce deuxième tube est appelé le Vide. Vous utilisez le blanc pour standardiser l'instrument. En effet, vous « direz à l'instrument d'ignorer » l'absorption de la lumière par tout sauf la molécule d'intérêt, la riboflavine.

Les étapes de la normalisation sont peu nombreuses et simples, mais il faut les faire correctement et soigneusement pour obtenir des données fiables.

1. Si l'instrument n'était pas déjà allumé, vous utiliseriez le interrupteur pour allumer l'instrument et laissez-le chauffer pendant environ 15 minutes.

2. Utilisez le contrôle de la longueur d'onde bouton pour sélectionner la longueur d'onde souhaitée les valeurs de longueur d'onde affichées dans le cadran de longueur d'onde fenêtre d'affichage sont gradués en nanomètres (nm). NOTEZ BIEN que dans le travail de la semaine prochaine, vous n'utiliserez qu'une seule longueur d'onde aujourd'hui, cependant, vous mesurerez l'absorption de la lumière à de nombreuses longueurs d'onde afin de déterminer le spectre d'absorption de la riboflavine. Donc, nous allons commencer par 340 nm pour la longueur d'onde. Réglez cela maintenant.

3. Avec le porte-échantillon vide et son couvercle fermé, utilisez le contrôle "0" (identique au bouton de commande de puissance) pour régler l'aiguille de l'indicateur à zéro pour cent sur l'échelle de transmission, 0 %T. Sans tube dans la chambre, aucune lumière n'entre dans la chambre (il fait noir là-dedans), donc aucune lumière ne frapperait le détecteur. En effet, vous dites à l'instrument que s'il y avait un tube avec une solution dans la chambre, c'est ce que vous verriez si absolument aucune lumière entrant dans le tube ne passait de l'autre côté, soit 0 % de la la lumière est passée.

4. Insérez le tube vierge dans le support et fermez le couvercle. L'aiguille va balayer vers le haut sur l'échelle %T. Partout où l'aiguille s'arrête, utilisez le contrôle de la lumière bouton maintenant pour déplacer l'aiguille à 100 %T sur l'échelle. En effet, vous dites à l'instrument qu'avec un échantillon dans la chambre, mais pas de riboflavine présente, c'est ce que vous verriez si toute la lumière (100%) entrant dans le tube passait de l'autre côté. Étant donné que le verre et le solvant seront également présents avec votre échantillon de riboflavine, cette étape indique à l'instrument d'ignorer l'absorption de la lumière par ces facteurs. Maintenant, si vous voyez des valeurs %T inférieures à 100 %, cela doit être dû à l'absorption de la lumière par la riboflavine avec la riboflavine présente, moins de 100 % de la lumière entrant dans le tube passera à travers.

5. Retirez le blanc du porte-échantillon et fermez le couvercle. L'aiguille doit retomber à zéro %T.

6. L'instrument est maintenant normalisé pour une longueur d'onde de 340 nm. Si vous deviez faire des mesures sur de nombreux échantillons à cette seule longueur d'onde, vous ne toucheriez pas au contrôle de la lumière bouton ou le contrôle "0" bouton ci-après.

Détermination du spectre d'absorption de la riboflavine

Un spectre d'absorption trace absorbance (UNE), et non le % de transmission, sur l'axe des y, en fonction de la longueur d'onde sur l'axe des x. L'absorbance est l'autre échelle de votre colorimètre. Notez que les échelles d'absorbance et de %T vont dans des directions opposées, ce qui signifie qu'elles sont réciproquement liées lorsque l'une augmente, l'autre diminue. Mais notez aussi les espacements entre divisions sur les échelles %T a une échelle linéaire alors que l'absorbance a une échelle logarithmique (log commun, c'est-à-dire log base 10). Spécifiquement, A = log (1 / T), où T est l'équivalent décimal de %T. Exemple : si %T = 50 %, alors T = 0,5 et (1 / T) = 2,0, et A = 0,301. Assurez-vous de bien comprendre cette relation algébrique.

Pour collecter des données sur le spectre d'absorption de la riboflavine maintenant, vous devez enregistrer les valeurs d'absorbance à de nombreuses longueurs d'onde, pas une seule, à travers le spectre visible. Il suffira de prendre des mesures par incréments de 5 nm. Cependant, chaque fois que la longueur d'onde est modifiée, le réglage 100 %T doit être refait car le verre et le solvant peuvent ne pas absorber la lumière au même degré à des longueurs d'onde différentes. Mais cette étape supplémentaire prend peu de temps. Alors, procédez comme suit.

1. Avec le colorimètre déjà standardisé pour une longueur d'onde de 340 nm, insérez votre tube de riboflavine, fermez le couvercle de la chambre et enregistrez la lecture d'absorbance. Ne modifiez pas encore les réglages des boutons. Retirez ensuite le tube de riboflavine et fermez le couvercle. L'aiguille retombera à 0 %T, soit A = "infini" (l'absorbance maximale possible). Vous définissez le 0%T juste une fois.

2. Réinitialisez la longueur d'onde à 5 nm au-dessus du dernier réglage. Insérez le Vide tube, fermez le couvercle et notez que l'aiguille ne remonte pas à 100 % T. C'est parce que le verre du tube et l'eau absorbent différentes quantités de lumière à différentes longueurs d'onde. Donc, réinitialisez l'aiguille à 100 %T avec le contrôle de la lumière bouton maintenant. La machine est maintenant normalisée pour la nouvelle longueur d'onde.

3. Retirez le tube vierge et vérifiez que l'aiguille retombe à 0 %T (= absorbance maximale). Insérez le tube de riboflavine dans le porte-échantillon, fermez le couvercle et enregistrez l'absorbance à la nouvelle longueur d'onde. N'ajustez aucun bouton avec l'échantillon de riboflavine dans la chambre. Retirez ensuite le tube de riboflavine et fermez le couvercle.

4. Répétez maintenant les étapes #2 et #3 : augmentez la longueur d'onde par pas de 5 nm, réinitialisez le 100 %T avec le blanc à chaque fois, et enregistrer une nouvelle valeur d'absorbance pour la solution de riboflavine. Votre dernier réglage de longueur d'onde sera de 530 nm. Ce processus va vite, mais il doit être fait avec soin.

5. Remettez le tube vierge et le tube de riboflavine dans le portoir pour tubes à essai. Ne jamais laisser d'échantillon dans l'instrument. Éteignez l'instrument en tournant le interrupteur dans le sens inverse des aiguilles d'une montre, vous entendrez/sentirez le clic.

6. Tracez vos données sur du papier millimétré qui a les deux axes avec des échelles linéaires : absorbance sur l'axe des y et longueur d'onde sur l'axe des x. Quelle est la longueur d'onde maximale d'absorption de la riboflavine ? Combien de « pics » possède le spectre d'absorption ? Vérifiez vos résultats avec votre instructeur de laboratoire.


Activité I

Pour mieux comprendre l'eutrophisation, vous effectuerez une expérience en laboratoire (partie 1) et utiliserez le modèle informatique de Silver Springs (partie 2)

Partie 1

Un moyen potentiel de réduire l'eutrophisation culturelle consiste à faire consommer les algues par des organismes de niveau trophique supérieur. Nous étudierons cette possibilité en utilisant Daphnie, un zooplancton qui se nourrit d'algues vertes et une espèce d'algue appelée Chorella. Bien que les informations que nous tirons de cette activité soient utiles, il s'agit d'une simplification excessive de ce qui pourrait réellement se produire dans l'environnement aquatique.

Nous utiliserons un colorimètre pour mesurer la population d'algues. Un colorimètre mesure l'absorbance, la quantité de lumière qui est absorbée par une solution plutôt que la quantité de lumière qui peut la traverser. Au fur et à mesure que la population d'algues augmente (nombre de cellules d'algues), l'absorbance augmentera également. C'est une relation directe.

Procédure

  1. Obtenir deux cuvettes et une pipette de transfert.
  2. Remplir une cuvette d'eau distillée. Cette cuvette est le blanc
  3. Placer le blanc dans le colorimètre et le mettre à zéro. Cela fournit une mesure de base pour l'expérience. Conservez la cuvette vierge pour une utilisation ultérieure.
  4. À l'aide de la pipette jetable, remplissez la deuxième cuvette avec le Chorella algues. Utilisez la pipette pour essayer de disperser les algues uniformément dans la cuvette.
  5. Ajouter 10 daphnie dans la cuvette et mesurer immédiatement l'absorbance à l'aide du colorimètre. Notez votre lecture dans le tableau ci-dessous.
  6. Retirez la cuvette du colorimètre et laissez-la reposer sans la toucher pendant 30 minutes.
  7. Après 30 minutes, replacez la cuve à blanc (avec de l'eau distillée) dans le colorimètre. Utilisez le blanc pour remettre à zéro la machine.
  8. Retirer la cuvette vierge et mettre les algues/Daphnie cuvette dans le colorimètre. Mesurez l'absorbance et notez votre lecture dans le tableau ci-dessous.

Des questions

  1. Comment l'absorbance a-t-elle changé du temps 0 au temps 30 minutes ? L'absorbance a-t-elle augmenté, diminué ou est-elle restée la même ?
  2. Qu'est-ce que la variation de la valeur d'absorbance vous dit sur la concentration du Chorella? A-t-il augmenté, diminué ou est-il resté le même ?
  3. Que vous dit la chance de la valeur d'absorbance sur le comportement du Daphnie? ont-ils consommé Chorelle ? Comment savez-vous?
  4. Dans un véritable écosystème aquatique, pensez-vous que le zooplancton pourrait diminuer l'impact de l'eutrophisation culturelle et des proliférations d'algues ? expliquez pourquoi ou pourquoi pas.

Partie 2

Maintenant que vous avez observé les interactions trophiques et l'eutrophisation culturelle dans une expérience de laboratoire, appliquez ces connaissances au modèle informatique. Utilisez le modèle pour analyser la sensibilité de l'écosystème de Silver Springs à l'eutrophisation culturelle. Rappelez-vous que l'algue est un producteur photosynthétique au premier niveau trophique. Les Daphnie serait l'un des herbivores de l'environnement au deuxième niveau trophique. Modifiez les niveaux dans le modèle pour simuler une situation d'eutrophisation. Affichez les graphiques pour voir comment les différentes populations de niveaux trophiques changent au cours de la simulation.

Des questions

Sur la base de vos découvertes avec le modèle, répondez aux questions suivantes :

  1. Quel est le nombre maximum de producteurs que l'écosystème peut supporter avant que les niveaux trophiques supérieurs ne commencent à décliner ?
  2. Qu'arrive-t-il à la respiration de la communauté dans la prolifération d'algues simulée ? Augmente-t-il, diminue-t-il ou reste-t-il le même?
  3. Qu'arrive-t-il à la population de décomposeurs dans la prolifération d'algues simulée ? Augmente-t-il, diminue-t-il ou reste-t-il le même? Pourquoi?
  4. Quel groupe de carnivores (quel niveau trophique) est le plus impacté par la prolifération d'algues ? Pourquoi pensez-vous que ce soit le cas?

Surveillance de la croissance des algues à l'aide de leurs propriétés intrinsèques

Le coût croissant du carburant, ainsi que l'impact du changement climatique, ont considérablement accru l'intérêt pour les sources de carburant alternatives. La production de biocarburants à partir d'algues est un domaine de recherche intense en cours. Un élément clé de cette recherche consiste à surveiller la croissance des algues dans diverses conditions au fil du temps. Nous décrivons ici l'utilisation du lecteur de microplaques multimode Synergy&trade H4 pour surveiller différentes souches d'algues en utilisant soit les propriétés de diffusion de la lumière (turbidité) des algues en solution ou l'excitation de fluorescence de la chlorophylle algale.

Introduction

La croissance d'organismes unicellulaires en culture en suspension peut être surveillée à l'aide de mesures de turbidité ou de diffusion de la lumière. Au fur et à mesure que le nombre de cellules augmente, la solution devient de plus en plus trouble ou trouble car la lumière qui la traverse est diffusée par les micro-organismes présents [1]. Bien qu'il n'obéisse pas à la loi de Beer, à mesure que la diffusion de la lumière augmente, le pourcentage du faisceau lumineux total atteignant le détecteur diminue et est enregistré comme absorbance. La quantification des suspensions cellulaires basée sur la diffusion de la lumière a été décrite pour la première fois par Lord Rayleigh vers 1900. La lumière n'est pas absorbée, mais plutôt les molécules à l'intérieur de la cellule diffractent la lumière incidente. Une grande partie de la lumière diffractée sera déviée du chemin optique vers le détecteur et sera enregistrée en tant que densité optique par le lecteur. Le degré de perte de lumière due à la diffusion de la lumière est influencé à la fois par la particule en suspension, ainsi que par la configuration de l'optique de l'instrument. Les effecteurs spécifiques cellulaires comprennent : la taille des cellules, la composition de la membrane, l'anatomie interne des organites cellulaires et la densité cellulaire. Les dimensions optiques de l'instrument telles que la distance entre le matériau absorbant et le détecteur, la présence ou l'absence de lentilles de focalisation et la taille du faisceau influencent toutes le signal de "diffusion de la lumière". Les organismes photosynthétiques tels que les algues peuvent également être surveillés à l'aide de la chlorophylle. Bien qu'il existe plusieurs structures chlorophylliennes différentes, la chlorophylle a est uniformément répartie entre toutes les espèces végétales. Plusieurs autres formes de chlorophylle ont été trouvées dans les cyanobactéries et les algues qui diffèrent par les chaînes latérales de la structure annulaire centrale. Quel que soit le type, la chlorophylle est une molécule qui peut être détectée par absorbance ou fluorescence. Dans cette note d'application, nous démontrerons l'utilisation efficace de la diffusion de la lumière à 600 nm et de la fluorescence à base de chlorophylle pour surveiller la croissance des algues sans avoir besoin de réactifs ajoutés, en utilisant uniquement les propriétés intrinsèques des cellules.

Matériaux et méthodes

Des cultures de Chlorella vulgaris (2714) et deux isolats différents de souches de Microcystis aeruginosa (LB2238 et LB2061) ont été obtenues auprès de la UTEX Culture Collection of Algae de l'Université du Texas à Austin. Les cellules ont été cultivées dans des milieux BG11, TAP et TP selon les besoins.

Des cultures de cellules d'algues dans des milieux BG11, TAP ou TP ont été cultivées sur une période de plusieurs jours dans des flacons Erlenmeyer stériles de 250 ml. Les cultures en suspension ont été maintenues à température ambiante et agitées à l'aide d'un agitateur rotatif à 100 tr/min avec un éclairage constant. Des aliquotes (200 pL) ont été prélevées et pipetées dans des plaques à fond transparent à parois noires Corning 3603. Les mesures d'absorbance et de fluorescence ont été effectuées à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Synergy H4 (BioTek Instruments, Winooski, VT) en utilisant la fonction de cinétique discontinue [2] du logiciel d'analyse de données Gen5&trade (BioTek Instruments, Winooski, VT) pour gérer les données.

Les courbes d'étalonnage de la diffusion de la lumière et de la fluorescence de chaque type cellulaire ont été produites en diluant en série des cultures cellulaires de densités connues (cellules/mL) qui avaient été déterminées par comptage cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre. Les courbes d'étalonnage ont ensuite été interpolées pour fournir des informations concernant le nombre de cellules en utilisant des mesures d'absorbance à 600 nm.

Des balayages spectraux de fluorescence et d'absorbance ont été effectués en utilisant les monochromateurs d'un lecteur de microplaques multimode Synergy&trade H4. L'absorbance des cultures de M. aeruginosa 2061 a été mesurée de 300 nm à 700 nm par incréments de 1 nm et tracée à l'aide du logiciel d'analyse de données Gen5. Les spectres de fluorescence ont également été déterminés en utilisant les mêmes cultures. Le spectre d'émission a été déterminé de 500 nm à 850 nm par incréments de 1 nm en utilisant une longueur d'onde d'excitation fixe de 440 nm. Pour l'analyse spectrale d'excitation, la longueur d'onde d'émission a été fixée à 685 nm et les longueurs d'onde d'excitation variaient de 300 nm à 500 nm par incréments de 1 nm. Les données des deux analyses ont été normalisées à une valeur maximale de 10 000 RFU et tracées à l'aide du logiciel d'analyse de données Gen5&trade (BioTek Instruments).

Résultats

Les balayages spectraux des cultures d'algues démontrent une absorbance significative en dessous de 400 nm ainsi que deux pics d'absorbance distincts à 440 nm et 675 nm (Figure 1). La détermination du nombre de cellules est plus cohérente lorsque la diffusion de la lumière est utilisée plutôt que l'absorbance par les constituants cellulaires. Afin d'éviter l'influence du matériau absorbant, 600 nm a été choisi comme longueur d'onde pour surveiller la croissance.

Figure 1. Courbe spectrale d'absorbance des cultures en suspension de Microcystis aeruginosa.

Les suspensions cellulaires ont été quantifiées à l'aide d'un hémocytomètre et diluées en série. Les mesures d'absorbance, reflétant l'étendue de la diffusion de la lumière par les cellules, lorsqu'elles sont tracées en fonction du nombre de cellules, démontrent une relation linéaire pour les trois lignées cellulaires d'algues testées (figure 2). Des courbes d'étalonnage telles que celles-ci peuvent ensuite être utilisées pour déterminer le nombre de cellules en fonction de la lecture de l'absorbance. Nous avons noté une différence marquée dans la réponse d'absorbance sur une base par cellule avec l'absorbance entre différentes souches et organismes (Figure 2).

Figure 2. Courbe d'étalonnage pour les souches d'algues cultivées en milieu BG11 basée sur la mesure de l'absorbance induite par la diffusion de la lumière.

Des balayages spectraux fluorescents ont également été effectués sur des cultures d'algues. Comme le montre la figure 3, des pics d'excitation et d'émission significatifs ont été observés qui correspondent aux pics attendus pour la fluorescence de la chlorophylle a. Un pic d'excitation a été observé à 434 nm, tandis qu'un pic d'émission à 684 nm a été trouvé. Les déterminations de fluorescence ultérieures ont utilisé une longueur d'onde d'excitation de 440 nm et une longueur d'onde d'émission de 685 nm. Des mesures de fluorescence ont également été effectuées avec des dilutions de cellules d'algues. La réponse fluorescente s'est également avérée linéaire par rapport au nombre de cellules pour les trois espèces d'algues testées (figure 4). L'observation que l'absorbance basée sur la diffusion de la lumière et la fluorescence de la chlorophylle sont toutes deux linéaires et que la réponse des trois souches d'algues avait la même relation suggère que l'une ou l'autre méthode de détermination pourrait être utilisée pour évaluer la croissance cellulaire.

Figure 3. Excitation de fluorescence et analyse spectrale d'émission de cultures en suspension de Microcystis aeruginosa.

Ceci est corroboré lorsque l'on trace la fluorescence à 685 nm (excitation de 440 nm) par rapport à l'absorbance à 600 nm à partir de puits de microplaque individuels de dilutions de Chlorella vulgaris. Une corrélation directe entre les deux mesures est observée avec un coefficient de corrélation élevé (> 0,97) lorsqu'une régression linéaire est effectuée sur un nuage de points (Figure 5).

Figure 4. Courbes d'étalonnage pour les souches d'algues cultivées dans des milieux BG11 basées sur l'excitation de fluorescence de la chlorophylle.

These data suggest that under the constant light illumination growth conditions used for these experiments either 600 nm absorbance based light scatter or fluorescence based chlorophyll determinations can potentially be used to monitor algal culture growth in suspension.

Figure 5. Correlation between absorbance and fluorescence measurements of Chlorella vulgaris dilutions.

When the growth of different algal strains in BG11 media is compared using absorbance at 600 nm in conjunction with the cell calibration curve strain to strain differences are observed (Figure 6). All three strains exhibit classical sigmoidal shaped growth patterns. An initial lag phase after inoculation where cells are adapting to the new environment and growing slowly, which is followed by a log-phase were cells are rapidly growing and dividing and as nutrients become scarce and metabolic by-products increase the cells enter a stationary phase.

As demonstrated in Figure 6 aliquots of all three strains increased in 600 nm absorbance until reaching stationary or plateau phase at approximately 10 days. C. vulgaris and M. aeruginosa 2383 resulted in very similar absorbance values, while M. aeruginosa 2061 plateaus at cell densities about one third of the other two strains of algae (Figure 6).

Figure 6. Comparison of cell number from different algal strains grown in BG11 media.

When fluorescence is measured in the same cultures a different pattern of cell growth than what was seen with absorbance is observed. As shown in Figure 7 cell density of the green algae C. vulgaris appeared to increase rapidly with little evidence of a lag phase. M. aeruginosa 2383 required a significantly longer period of time to reach maximal levels, while M. aeruginosa 2061 lagged behind even after 15 days. Despite the patterns being significantly different the basic relationship between the three strains was similar. M. aeruginosa 2061 signal for both absorbance and fluorescence was significantly less than the other two strains at the end of 15 days, while the maximal levels of M. aeruginosa 2383 and C. vulgaris were similar (Figure 7).

Figure 7. Comparison of fluorescence of Algal strains grown in BG11 media.

When cell number and fluorescence from the same cultures are plotted together and compared differences between the strains become apparent. With C. vulgaris cultures increases in chlorophyll as measured by fluorescence closely parallel increases in cell number as interpolated from 600 nm absorbance (Figure 8). This suggests that the amount of chlorophyll per cell remains relatively constant through the growth cycle.

Figure 8. Cell density (from absorbance measurements) and Fluorescence of Chlorella vulgaris culture in BG11 media.

In the M. aeruginosa cultures increases in fluorescence lagged behind increases in cell number (Figure 9). This suggests that the number of cells initially increases faster than the amount of chlorophyll resulting in less chlorophyll per cell. Only when the change in cell number rate begins to slow does the rate of chlorophyllincrease match that of cell number. Eventually both cell number and chlorophyll reach a steady state.

Graphique 9. Cell density (from absorbance measurements) and Fluorescence of Microcystis aeruginosa 2383 culture in BG11 Media.

The nutritional effects of different media formulations can markedly influence the growth rate and final cell density of the algal cultures. C. vulgaris cultures grown in different media formulations, with varying amounts of total carbon, have markedly different final cell densities as measured by absorbance at 600 nm (Figure 10). Cultures grown in TAP, which has high amounts of carbon, grow to an absorbance density approximately 10 fold greater than cultures grown in BG11, which is carbon poor. Cultures grown in TP media, which has less carbon than TAP, have an intermediate final density. Interestingly, while maximal absorbance is less with TP media log phase growth of C. vulgaris begins sooner in TP media than TAP despite having less carbon initially (Figure 10).

Figure 10. Comparison of A600 growth curves of Chlorella vulgaris grown in different complete media formulations.

Carbon content is not the only critical constituent of algal growth media. C. vulgaris cultures grown in TAP media deficient in either nitrogen or sulfur grow at considerably slower rates and much lower final densities (Figure 11).

Figure 11. Comparison of A600 growth curves of Chlorella vulgaris grown in complete TAP media or TAP deficient in nitrogen or sulfur.

Discussion

These data demonstrate the utility of monitoring algal cell growth using either absorbance of fluorescence. Assessment of cell density and growth state is a critical element in algae-based biodiesel production. The use of light scatter to measure suspended objects, such as cells, has been used for decades. While most often associated with bacterial cell growth, it has also been used for mammalian cells [1]. The basis of which is the diffraction of light by suspended moieties. A number of variables affect the amount of measured absorbance from a known concentration of cells. The size, shape and interior structure of the cells being monitored will affect the amount of light scatter. The physical make up of the microplate reader&rsquos optical path will also influence the absorbance reading when making light scatter measurements. Differences in light beam diameter, focal distance and detector size between different readers makes direct comparison of light scatter results difficult.

As such, for the most accurate results, it is necessary to generate calibration curves not only for each algal cell type, but for different instrument types. There are marked differences in the response between absorbance and cell number for different algal strains and species. As such, comparisons should employ the use of calibration curves to normalize the data on cell number. Comparisons of results within the same species can be accomplished without normalization on cell number. Any conversion would be the same for all data sets.

The constituents of the growth media are a critical variable in defining not only growth rate, but final cell density of algal cultures. Media formulations, such as TAP and TP containing relatively high carbon content are much better able to support rapid and dense algal cell growth than carbon poor media formulations such as BG11. Likewise, carbon rich growth conditions that lack other key elements such as nitrogen or sulfur also suffer from poor growth. These nutritional restrictions often result in decreases in protein or DNA synthesis as a result of the lack of key building block components [3].

Microalgae strains can have different growth patterns when inoculated at low concentration. C. vulgaris responds to inoculation by increasing cell number and chlorophyll content in parallel. This suggests that these cells maintain a constant amount of chlorophyll per cell. M. aeruginosa cultures increase in cell number much quicker than chlorophyll content, which indicates that initially the amount of chlorophyll per cell decreases. Only as the rate of increase in cell number slows does the amount of chlorophyll per cell increase. This suggests that M. aeruginosa uses media components rather than light as it preferred means to provide energy.

Quantitation of total protein has been used as a means to normalize cellular reactions for several decades based on the premise that on average, each cell has the same amount of protein Unlike animal cells in culture, most algae contains significant amounts of chlorophyll, which can easily be detected in vivo by its inherent fluorescence and can be used in lieu of measuring total cellular protein. Using this specific protein has the marked advantage of being non-invasive and nondestructive. As is the case with total cellular protein, cellular chlorophyll levels are not constant. Chlorophyll levels can change not only as cells grow and divide, but also in response to changes in light levels. Care should be taken when comparison of chlorophyll levels between cultures in different growth conditions are made.

There are advantages and disadvantages for the use of either light scatter absorbance-based or chlorophyll protein fluorescence-based measurements as a means to generate calibration curves in order to determine cell numbers from experimental cultures Light scatter measurements require separate curves for each cell type and each different reader. The calibration curves need only be made once or at most periodically to identify instrument drift over time. Values generated for each cell density will represent an average cell size from a spectrum in the specimen. Because absorbance measurements have a defined unit, comparisons from experiment to experiment are easily made. Fluorescence based calibration is often used if the instrument being used only has one read-mode and can provide greater resolution in terms of signal-change than absorbance, but suffers a number of drawbacks. Protein fluorescence is an average of not only cell size (larger cells will have more protein), but also that of cell expression (some cells have expressed more protein). In addition many algal cell types will express very little chlorophyll when grown in a high carbon environment. In addition, the lack of a defined standard for fluorescence makes all measurements relative rather than absolute. In essence, any comparison requires a calibration curve for each experiment. These issues have made the use of light scatter using 600 nm optical density measurements the preferred method to normalize and compare algal experimental data.

The Synergy&trade H4 Multi-Mode Microplate Reader is an ideal detection platform to monitor algal cell growth. The Synergy H4 has optics modules for absorbance, fluorescence and luminescence. Absorbance maxima, as well as fluorescence excitation and emission peaks can be identified using spectrum analysis. The ability to measure both absorbance and fluorescence on the same sample at the same time provides unique measurement flexibility. Cells number can be assessed using light scatter absorbance measurements at 600 nm or with chlorophyll detection by fluorescence. Because both measurements are non-invasive both can be performed on the same samples in microplates. In addition, microplates not only offer the ability to measure samples in small volumes, but the flexible array of wells density (6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384-, and 1536-) allows the researcher to choose the best reaction volume and sample number combination to suit their needs. Because microplates have industry defined and accepted geometries, automation can easily be employed for many routine measurements.


Enzymes in Action- Quantifying Milk Proteins

Trypsin is an enzyme which hydrolyses proteins into peptides, ready for other enzymes to cut them further down to their amino acids for use in the body. Enzymes are catalysts, which means they help or cause a reaction to occur without being consumed themselves. Trypsin works in the small intestine, after acid and pepsin in the stomach have commenced the work of breaking down the proteins.

This experiment uses milk which contains the protein casein. As the casein in milk break down, the smaller molecules become soluble, thereby reducing the opacity of the fluid. The time taken to break down the molecules can be measured and comparison of known values against unknown values will allow the unknowns to be calculated. As the milk will not become entirely clear due to the inevitable presence of fat, some error will be introduced by varying decisions of the endpoint, not only amongst the class but each student may have their own inconsistencies. A colorimeter in transmittance mode may be used instead to reduce this type of error, however the visual assessment should be enough to demonstrate the basic principle. This experiment starts with known concentrations of skim milk powder. The concentration of protein itself can be calculated if you wish, from the information on the packet of milk we have found skim milk generally contains around 9g of protein per 25g of powder (36%).

PREPARATION : LAB TECHNICIAN

  1. Dissolve 30g of milk powder in 250mL of distilled water (dH2O)
  2. Add distilled water to make 300mL for a 10% stock solution. (Adjust as appropriate for your class size &ndash 300mL of stock should be enough for 12 groups with allowance for spillage). Dilute as follows:
        • 5% standard &ndash 75mL of stock in 75mL of dH2O
        • 4% standard &ndash 60mL of stock in 90mL of dH2O
        • 3% standard &ndash 45mL of stock in 105mL of dH2O
        • 2% standard &ndash 30mL of stock in 120mL of dH2O
        • 1% standard &ndash 15mL of stock in 135mL of dH2O
        1. Use the remaining milk to create two unknown samples (X and Y) within the range 1-5% eg 47mL of stock in 103mL of dH2O and 28mL of stock in 122mL of dH2O. Keep note of the concentration but do not reveal to students.

        Trypsin stock solution:

        1. Dissolve 1g Trypsin in 100mL dH2O to make a 1% solution.
        2. Run a quick assay (see method below) to make sure that the 5% protein standard will take about 2-3 minutes to the end point.
        3. If the timing is appropriate, dissolve 4g Trypsin in 400mL dH2O to make the remainder of your 1% solution. If it&rsquos too fast or too slow, adjust the dilution appropriately.

        METHOD: STUDENT ACTIVITY

        1. Label your test tubes 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, X and Y.
        2. To each tube add 10mL of the appropriate milk solution.
        3. Mark a black cross, approximately the size of the diameter of your test tubes, on the white paper.
        4. To the first tube (1%) add 5mL Trypsin solution. Start the timer and shake gently to mix. If you are wearing gloves, you may prefer to hold your thumb over the top of the tube and mix by inverting the tube, taking very good care that you have covered the top completely.
        5. Hold the cross behind the test tube and record the time it takes for it to become just visible.
        6. Repeat with the remaining tubes &ndash keep consistent the point at which you determine the cross to be visible.
        7. Plot your results for the standards on your graph paper to more easily check for anomalies. If any result seems out of place and you need to re-run that standard, it is best to use clean test tubes as the enzyme can be difficult to clean out. If you need to re-use a tube, first place the 5mL of Trypsin and start your timer from when you add the milk.
        8. Once you are satisfied that your calibration curve makes sense, plot the results for your two unknowns to estimate the concentration of milk in each.
        9. The class results are to be collated and averaged out to make an aggregate calibration curve and estimate. Consider what you expect to see from aggregate results compared to individual.

        OBSERVATIONS AND RESULTS

        Below is an example of expected results. It is a guide only as individual results will vary.


        The bluest of blue: A new algae-based switch is lighting up biological research

        Several organisms possess "ion channels" (gateways that selectively allow charged particles called ions to enter the cells and are integral for cell function) called "channelrhodopsins," that can be switched on and off with the help of light. Different channelrhodopsins respond to different wavelengths in the light spectrum. These channels can be expressed in foreign organisms (animals even in human) by means of genetic engineering, which in turn finds applications in optogenetics, or the application of light to modulate cellular and gene functions. So far, the shortest wavelength that a channelrhodopsin responds to was blue.

        However, recently, a group of scientists from the Nagoya Institute of Technology, Japan, and Jawaharlal Nehru University, India, have identified a channelrhodopsin that responds to an even shorter indigo blue wavelength of light. In their study published in Nature's Communications Biology, the group of researchers, led by Professor Hideki Kandori and Associate Professor Satoshi P. Tsunoda, identified a novel channelrhodopsin, which they named KnChR, from a species of terrestrial alga called Klebsormidium nitens. "We chose this alga, because it is known to be responsive to light, but its photoreceptor domain has not been established," reports Prof. Kandori. Unlike other discovered channelrhodopsins, KnChR was found to respond to indigo blue light.

        It is known that KnChR is made up of a seven-cell membrane spanning region, which forms the pore that allows the entry and exit of different ions. This region is followed by a protein moiety including a peptidoglycan binding domain. In order to investigate the properties of KnChR, the researchers performed extensive genetic and electrophysiological experiments.

        What was perhaps the most exciting result was that they could identify the role of the "cytoplasmic domain." All known channelrhodopsins have a large "cytoplasmic domain," or region that is located in the internal area of the cell. As Prof. Kandori explains, "All currently known channelrhodopsins comprise a large cytoplasmic domain, whose function is elusive. We found that the cytoplasmic domain of KnChR modulates the ion channel properties."

        Accordingly, the results of the experiments showed that changing the lengths of the cytoplasmic domain caused the changes in ion channel closure. Particularly, the shortening of the domain resulted in increased channel 'open time' by more than ten-fold. In addition, the researchers also identified two arginine amino acid residues, namely R287 and R291, in the same region, which played an important role in the properties of generated light currents. They found that KnChR exhibited maximal sensitivity at 430 nm and 460 nm, making it the 'bluest' channelrhodopsin.

        Overall, the researchers have faith in the KnChR being helpful in biological systems requiring specific excitation parameters. When asked about the implications of these findings, Prof. Tsunoda, who is the corresponding author of the study suggests, "KnChR would expand the optogenetics tool kit, especially for dual light applications when short-wavelength excitation is required." What this means is that the light-operated property of KnChR can be applied in targeted manipulation of an organism's biological functions, in a research setting. A few examples would include manipulation of neuronal and myocyte activities.


        Expérimental

        Preparation of the Original Fe Solution

        To an accuracy of ± 0.1 mg weigh out enough ferrous ammonium sulfate, Fe(NH 4 ) 2 (DONC 4 ) 2 6H 2 O, gfw = 392.14, to prepare 250 mL of a solution which is 0.00200 M with respect to that compound. Quantitatively transfer the salt into a 250 mL volumetric flask, add sufficient water to dissolve the salt, add 8 mL of 3 M H 2 DONC 4 , dilute to the mark with distilled water and mix well. We shall call this the Stock Fe Solution. Pipet 10 mL of this solution into a 100 mL volumetric flask, add 4 mL of 3 M H 2 DONC 4 and dilute to the mark with distilled water and mix well. Label this solution as Original Fe Solution and calculate the concentration of Fe, in ppm, in this solution.

        Measurement of the Absorbance Spectrum

        In order to determine the wavelength of maximum absorbance it is necessary to obtain the absorbance spectrum of the iron-bipyridyl complex. Readings taken at 10 nm intervals are sufficient to outline an absorbance spectrum except perhaps at absorbance peaks where additional points may be required to characterize the curve more completely. Pipet 10 mL of the Original Fe Solution into a 50 mL volumetric flask. Into a second 50 mL volumetric flask do not add any of the iron solution, but add about 10 drops of 3 M H 2 DONC 4 . Then, in the order stated, add to each flask 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and 4 mL of 10% sodium acetate solution. The purpose of the sodium acetate is to buffer the mixture. The sodium acetate plus the sulfuric acid already present gives an acetic acid-acetate buffer in the pH region of about 4.5 to 5. Be sure to mix well after the addition of each reagent. Then fill each flask to the mark with distilled water and mix well by inverting and shaking. The flask containing iron has the same concentration as the Standard Fe Solution which will be prepared in the next section. Now take absorbance readings for this solution from 400 nm to 600 nm, in intervals of 10 nm, except where additional points are needed better to define the shape of the curve. Use the solution not containing Fe as a blank. Neatly plot the absorbance (vertical axis) against wavelength (horizontal axis) on a piece of millimeter graph paper. Use the long side of the paper as the horizontal axis. From this graph select the wavelength which exhibits the maximum absorbance. That is the wavelength to be used for the measurement of the unknown solution. It is called lambda (max).

        Determination of the Absorbance of the Standard Fe Solution.

        Before beginning this part of the procedure be sure to record the number of the colorimeter that you are using for this part of the analysis. The number of the colorimeter is found on a small blue tag on the front of the colorimeter. A11 further absorbance measurements must be made with the same colorimeter and the same cuvettes in order for this method to work. Discard both of the solutions in the 50 mL volumetric flasks. Thoroughly rinse both volumetric flasks and then prepare a new set of solutions from the Original Fe Solution using the same amounts according to the previous procedure. Label the solution containing the Fe as Standard Fe Solution and calculate its Fe concentration in ppm. Determine the absorbance of this solution at the wavelength of maximum absorbance previously determined. For a blank use the solution which does not contain Fe. Make at least three measurements. In each case reset the zero and the 100% transmission. Record both the percent transmission and absorbance values. Empty your cuvette and refill it with another portion of the same solution and again determine the absorbance value. Calculate the average of all six absorbance values.

        Analysis of the Fe Unknown

        Clean a 100 mL volumetric flask, place your initials on the ground glass area and hand it to your instructor who will pipet 10 mL of unknown solution into it and who will also give you an unknown number for it. Then add 4 mL of 3 M H 2 DONC 4 , mix well and then make up to the calibration mark with distilled water. Mix well by inverting and shaking the stoppered flask. Label this solution as First Unknown Dilution (FUD). Pipet 10 mL of this solution into a 50 mL volumetric flask and then in this exact order add 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and 4 mL of 10% sodium acetate solution. Be sure to mix well after the addition of each reagent, by gently shaking or swirling, but not inverting, the flask. After all reagents have been added fill the flask to the mark with distilled water and mix well by inverting and shaking. This solution will be called the Second Unknown Dilution (SUD). Determine the absorbance of the this solution using the previous blank solution as the reference and the wavelength of maximum absorbance determined earlier. Measure the absorbance at least three times. Empty the cuvette and refill it with another portion of solution and again determine the absorbance.

        Analysis of city tap water

        If samples of city tap water are supplied in this experiment, you will determine the iron concentration in two samples. The concentration of iron in city tap water approaches the level of precision of this method because the concentration of iron in most water of southern California is very low. Iron pipes offer the most abundant source for the iron in our water. The K sp of Fe(OH) 3 is 4.0 x 10 -38 . Calculation yields a concentration of Fe 3+ in neutral water to be so low as to be undetectable -- on the order of one part iron per one quintillion parts of water (10 -18 ). Still, whatever iron that finds its way into our water supply may end up in the form of a colloidal precipitate of ferric hydroxide. To bring that small amount of iron into solution we acidify tap water and boil it for two minutes, cool it to room temperature in ice and carry out the procedure now familiar to you.

        Procédure

        The absorbance you observe may be lower than that which you observed for your known and unknown samples. If you have really low absorbance readings, a slight difference in the shape of two cuvettes is enough to make detection of the presence of any iron impossible unless a correction for the systematic error between the two cuvettes is taken into account. Clean two cuvettes and fill both with the blank solution. Calibrate the spectrophotometer using one, then take an absorbance reading with the other. Make sure that the vertical line on the cuvettes is adjacent to the mark on the plastic cuvette holder in the spectrophotometer for both the calibration and all future readings. If the vertical line is in a different position during any reading, the absorance will change slightly. The second cuvette will be the one in which you place your sample. We will call this absorbance A systematic error . The absorbance you measure is the systematic error between the two cuvettes, using the first cuvette as the blank. This absorbance will be subtracted from the readings you get using the iron samples, as follows: Using a 50 mL graduated cylinder, obtain two samples of city tap water, 50 mL each, from two different cities. Place each sample in a clean 250 mL beaker. Add 10 drops of 3 M H2SO4 to each. Boil each sample on a hot plate for 2 minutes. Cool the two samples in ice until they are no longer warm to the touch. Pour each in turn back into the 50 mL graduated cylinder and add enough distilled water to bring each back to 50 mL volume. Pour contents of each into the same 250 mL beakers to mix. Pipet 35 mL of the first sample into a 50 mL volumetric flask (use a 25 mL volumetric pipet and a 10 mL volumetric pipet), then in this exact order add 1 mL of 10% hydroxylamine hydrochloride solution, 10 mL of 0.1% bipyridyl solution and then finally, using an eye dropper, add up to 4 mL of 10% sodium acetate solution to the mark. Be sure to mix well after the addition of each reagent, by gently inverting the flask. This sample will be called the city reaction flask in the description of calculations below. Determine the absorbance of this solution using the previous blank solution as the reference at the wavelength of maximum absorbance determined earlier. Measure the absorbance at least three times. Repeat this section with the second boiled sample of tap water from a différent ville. Subtract the absorbance which represents the systematic error between the cuvettes from each of these experimental values.

        The calculation of the Fe concentration of the unknown can be made by a comparison method. This, however, can only be done if the system adheres to Beer's Law in the range of concentrations involved. In the case of the iron-bipyridyl complex that range is 0.5 to 8 ppm. The appropriate relationship for the calculation of the Fe concentration in the Second Unknown Dilution est:

        "A" is the absorbance, the subscript "S" refers to the absorbance and concentration, respectively, of the Standard Fe Solution while the subscript "SUD" refers to the absorbance and concentration of the Second Unknown Dilution. For the absorbance value of the unknown solution use the average of the three readings obtained for each sample taken. From the value obtained for [Fe] SUD , calculate the concentration of iron, in parts per million, of the original unknown Fe solution given to you by your instructor.

        If city water was provided for this experiment, the equation above is used to determine [Fe] for the solution whose absorbance you measured. Since this solution was made to 50 mL but in the process you used 15 mL of reagents prepared with distilled water, [Fe] for the city water can be found through a simple modification of the equation above:


        Colorimetry, turbidity, and spectrophotometry meters for water analysis

        You can choose from 134 preprogrammed methods to measure the concentrations of sample components with our colorimetry meters. These portable meters can go with you anywhere to test drinking water or wastewater

        Take your portable turbidity meter to the source for on-site measuring. Our turbidity meters feature white and infrared light sources allowing you to meet regulatory methods.

        Achieve simple and efficient water and wastewater analysis with our UV-Vis and Vis spectrophotometers. These meters include over 260 preprogrammed methods using common reagent chemistries, making them the ideal instruments to include in your laboratory.


        Activity I

        To understand more about eutrophication, you will conduct a laboratory experiment (Part 1) and use the Silver Springs computer model (Part 2)

        Partie 1

        One potential way to decrease cultural eutrophication is by having higher trophic level organisms consume the algae. We will investigate this possibility using Daphnia, a zooplankton that feeds on green algae, and an alga species called Chorella. Although the information we gain from this activity is useful, it is an over simplification as to what might really occur in the aquatic environment.

        We will use a colorimeter to measure the algae population. A colorimeter measures absorbance, the amount of light that is absorbed by a solution rather than the amount of light that can pass through. As the algae population increases (number of algae cells), the absorbance will also increase. It is a direct relationship.

        Procédure

        1. Obtain two cuvettes and a transfer pipette.
        2. Fill one cuvette with distilled water. This cuvette is the blank
        3. Place the blank into the colorimeter and zero it. This provides a baseline measure for the experiment. Save the blank cuvette for later use.
        4. Using the disposable pipette, fill the second cuvette with the Chorella algues. Use the pipette to try and disperse the algae evenly throughout the cuvette.
        5. Add 10 daphnie to the cuvette and immediately measure the absorbance using the colorimeter. Record your reading in the table below.
        6. Remove the cuvette from the colorimeter and allow it to sit, undisturbed for 30 minutes.
        7. After 30 minutes, place the blank cuvette (with distilled water) back into the colorimeter. Use the blank to re-zero the machine.
        8. Remove the blank cuvette and put the algae/Daphnia cuvette into the colorimeter. Measure the absorbance and record your reading in the table below.

        Des questions

        1. How did the absorbance change from time 0 to time 30 minutes? Did the absorbance increase, decrease, or stay the same?
        2. What does the absorbance value change tell you about the concentration of the Chorella? Did it increase, decrease, or stay the same?
        3. What does the absorbance value chance tell you about the behavior of the Daphnia? Did they consume Chorella? How do you know?
        4. In a real aquatic ecosystem, do you think zooplankton could decrease the impact of cultural eutrophication and algae blooms? Explain why or why not.

        Partie 2

        Now that you have observed trophic interactions and cultural eutrophication in a lab experiment, apply that knowledge to the computer model. Use the model to analyze the sensitivity of the Silver Springs ecosystem to cultural eutrophication. Remember that alga is a photosynthetic producer on the first trophic level. Les Daphnia would be one of the herbivores in the environment on the second trophic level. Change the levels in the model to simulate a eutrophication situation. View the graphs to see how the different trophic level populations change through the simulation.

        Des questions

        Based on your findings with the model, answer the following questions:

        1. What is the maximum number of producers the ecosystem can support before higher trophic levels begin to decline?
        2. What happens to community respiration in the simulated algae bloom? Does it increase, decrease, or stay the same?
        3. What happens to the decomposer population in the simulated algae bloom? Does it increase, decrease, or stay the same? Pourquoi?
        4. Which group of carnivores (which trophic level) is more greatly impacted by the algae bloom? Pourquoi pensez-vous que ce soit le cas?

        Algal Ball Photosynthesis

        In eukaryotic cells, specialised organelles facilitate biochemical processes of photosynthesis, cellular respiration, the synthesis of complex molecules (including carbohydrates, proteins, lipids and other biomacromolecules), and the removal of cellular products and wastes (ACSBL049)

        CONTEXTE:

        During photosynthesis, radiant energy is converted into organic substances that can be stored within the plant to support growth, reproduction, and metabolism. Plants metabolise the sugars that form as a result of sunlight, Carbon Dioxide, and water reacting. Reliably studying photosynthesis first hand can be difficult and require precise setting up. Algal ball photosynthesis kits offer an easier, more accurate method of studying photosynthesis that is perfect for use within the classroom. Algal balls are stored in small vials filled with Hydrogen Carbonate indicator solution. When exposed to light, the encapsulated algae absorb the CO2 from the solution they are stored in during the process of photosynthesis. As a result of the lowered CO2 levels, the pH of the solution will rise. When no light is available, respiration will dominate and the pH will decrease through the release of CO2. Changes in the levels of carbonic acid can be monitored via the colour changes that occur due to the hydrogen carbonate indicator.

        In this practical, students have the opportunity to tangibly observe photosynthesis. They are tasked with observing how the colour changes from yellow/orange to purple when the algal balls and solution are placed under a light source as photosynthesis takes up dissolved CO2 and the pH rises. Additionally, students create a light filter to test whether the wavelength of light affects their photosynthetic rate. This is a great practical to introduce students to the basic principles of photosynthesis in a fun, simple and interactive way.

        PREPARATION- LAB TECHNICIAN

        Making Algal Balls (If making your own algal balls)

        1. To make a 3% solution of sodium alginate, add 3g sodium alginate to 100mL of distilled water in an Erlenmyer flask. Stir continuously for at least 4 hours, or overnight using a magnetic stirrer. Do not apply any heat.
        2. To make 500mL of 2% calcium chloride, add 10g of calcium chloride to 500mL of distilled water and stir to dissolve.
        3. To prepare chlorella culture: Once your chlorella culture has grown enough to be a bright to darkish-green, siphon out as much of the denser areas into a measuring cylinder. Leave the culture to rest overnight to allow the algae to settle to the bottom of the cylinder. After this time, there should be a dark &ldquoplug&rdquo of dense algae at the bottom.
        4. To prepare chlorella alginate solution, take note of the volume of the plug, then carefully remove the supernatant until it accounts for 2/3 of the total volume in the measuring cylinder, with 1/3 dense alginate. For example, if you have 10mL of chlorella down the bottom, remove all but 20mL of supernatant so that you are left with 30mL in total. Keep the supernatant aside. If the mixture is too thick later to drop easily through the syringe, then you can use this to thin it out a little. Mix the remaining chlorella and supernatant in the measuring cylinder and add to an equal volume of your sodium alginate, e.g., 30mL of chlorella and 30mL of alginate to make 60mL altogether.
        5. To set up retort stand apparatus, attach a 30mL syringe barrel to the retort stand clamp so that the outlet is pointing downwards. Position the syringe barrel over a beaker of calcium chloride solution.
        6. To make algal balls, transfer your algae/alginate mix to the syringe, and allow it to drop through into the solution. Check the rate of the drops and the shape of the balls as they fall to the bottom.
                • If the rate is slower than a drop or two per second, add a small amount of the supernatant.
                • If the balls flatten on entering the liquid, the syringe is too high and should be lowered.
                • If the mixture comes through the syringe is too low, you may end up with &ldquosausages&rdquo of algae rather than balls.
        7. Algal Ball Culture Care (If you purchase the algal balls)

          1. The algal balls will arrive stored in a container of distilled water.
          2. The Chlorella within the balls is alive and therefore needs light to stay active. We recommend that you leave the balls in the container that they arrive in, and that you place this vial in a well lit area until required. Do not place in direct sunlight, nor expose to hot light sources, as the heat will be detrimental.
          3. It will also help to loosen the lid of the container to allow air access.
          4. Use the algal balls as early as you can otherwise, they are best used within 2 weeks.

          Vial Preparation

          Rinse the vials for your experiment using hydrogen carbonate indicator solution. To do this, add

          METHOD-STUDENT ACTIVITY

          1. Separate the algal balls from the surrounding liquid using the strainer. To do this, pour the algal balls into a strainer over a small beaker.
          2. Use the spoon to place an equal number of balls into each dram vial.
          3. Using a plastic pipette, fill all the vials with the hydrogen carbonate indicator. Make sure the caps are secured.
          4. Keep one vial to act as your control.
          5. Wrap a different piece of coloured cellophane around the other three vials.
          6. Place each vial approximately 10 cm away from your light source. Make sure the vials do not get hot.
          7. Copy the results table into your logbook and complete column A by comparing the colour of the hydrogen carbonate indicator to the set of pH standard solutions. You can use the image below (Figure 1) as a guide if standards are not available, however comparing the colour of the liquid in your vials to actual pH standard solutions will provide the most accurate results.
          8. After 40 minutes complete column B of the results table by comparing the colour of the hydrogen carbonate indicator to the set of standard references.
          9. Complete the final column of the results table by subtracting the amount in column A from the amount in column B.

          OBSERVATION AND RESULTS

          After exposing the vial to a light source, the colour in the solution should change from yellow/orange to purple as photosynthesis absorbs the CO2 and the pH rises. The pH of vials wrapped red, blue or purple cellophane will experience a greater rise than vials wrapped orange, yellow or green. This is due to the way the algae absorb light - we observe them as green because that is the colour that bounces off them out of the spectrum that makes up white light and so that is the colour that is not used in photosynthesis. Some change should be expected by the end of the class, however if it is too slight to notice you can return at the end of the day or the next day to check your vials.

          ENQUÊTE

          • Carbon dioxide dissolved in water forms carbonic acid. Hydrogen carbonate indicator is used to measure the acidity of a system. The pH of the system is low (yellow) when there is a lot of dissolved CO2. En tant que CO2 is removed, the pH rises and the colour becomes purple. Use this information to construct a bar graph of CO2 changes as a function of wavelength.
          • Why do we include a control in the experiment? What does this control represent in term of light wavelength?
                • The control represents all of the wavelengths of light, as it is not obscured by a colour filter. This control is used to compare the level of photosynthesis that takes place in the vials. All three vials are placed under the same conditions, to see whether the colour filters slow down photosynthesis or block usable wavelengths entirely.
                    • Both photosynthesis and respiration are happening all of the time, with photosynthesis dominating when light is available and respiration dominating in the absence of light. During photosynthesis, carbon dioxide and water plus the energy from light synthesise glucose and oxygen. As carbon dioxide is used up, carbonic acid in the water is converted to carbon dioxide, raising the pH of the water.
                    • During respiration, glucose is broken down along with oxygen to make carbon dioxide and water. As carbon dioxide enters the water, excess molecules are converted to carbonic acid, lowering the pH of the water.

                    EXTENSION EXERCISE

                    • Light availability is another factor that affects photosynthesis. Design an experiment to test how distance from light effects the rate of photosynthesis.

                    TEACHER TIP

                    Exigences de temps
                    Material List
                    Safety Requirements
                    1. Wear appropriate personal protective equipment (PPE).
                    2. Know and follow all regulatory guidelines for the disposal of laboratory wastes.

                    Avoid direct contact with any culture.

                    Reference Kits


                    Voir la vidéo: Millist liimi kasutada ülitugevaks ühendamiseks? (Mai 2022).