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2.4.3 : Microscopie d'interférence - Biologie

2.4.3 : Microscopie d'interférence - Biologie


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OBJECTIFS D'APPRENTISSAGE

  • Décrire les principes et les différents types de microscopie interférentielle

Source de lumière stéréo

La microscopie par interférence utilise un prisme pour diviser la lumière en deux faisceaux légèrement divergents qui traversent ensuite l'échantillon. Elle repose donc sur la mesure des différences d'indice de réfraction lors de la recombinaison des deux faisceaux. Une interférence se produit lorsqu'un faisceau lumineux est retardé ou avancé par rapport à l'autre.

Il existe trois types de microscopie interférentielle : classique, à contraste différentiel et à contraste de fluorescence. Depuis son introduction à la fin des années 1960, la microscopie à contraste d'interférence différentielle (DIC) est populaire dans la recherche biomédicale car elle produit des images haute résolution de structures fines en améliorant les interfaces contrastées. L'image produite est d'une section optique mince et apparaît en trois dimensions, avec une ombre autour d'elle. Cela crée un contraste à travers le spécimen qui est brillant d'un côté et plus sombre de l'autre.

Le Microscope Interférentiel

Le microscope est un microscope optique à champ clair auquel sont ajoutés les éléments suivants : un polariseur entre la source lumineuse et le condenseur, un prisme de division de faisceau DIC, un prisme de combinaison de faisceau DIC et un analyseur. La manipulation du prisme modifie la séparation des faisceaux, ce qui modifie le contraste de l'image. Lorsque les deux faisceaux traversent le même matériau à travers l'échantillon, ils ne produisent aucune interférence. Lorsque les deux faisceaux traversent un matériau différent sur l'échantillon, par exemple sur les bords, ils produisent une altération lorsqu'ils sont combinés.

La microscopie à contraste d'interférence différentielle à fluorescence (FLIC) a été développée en combinant la microscopie à fluorescence avec le DIC pour minimiser les effets du photoblanchiment sur les fluorochromes liés à l'échantillon coloré. Le même microscope est équipé pour imager simultanément un échantillon à l'aide d'un DIC et d'un éclairage par fluorescence.

Points clés

  • La microscopie d'interférence est supérieure à la microscopie à contraste de phase dans sa capacité à éliminer les halos et la lumière supplémentaire.
  • En microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC), la différence de chemin optique est déterminée par le produit de la différence d'indice de réfraction (entre l'échantillon et son milieu environnant) et l'épaisseur traversée par un faisceau lumineux entre deux points sur le chemin optique.
  • Les images produites par DIC ont un aspect distinctif d'ombre portée.

Mots clés

  • photoblanchiment: La destruction d'une fluorescence photochimique par une lumière de haute intensité
  • fluorochrome: L'un des divers colorants fluorescents utilisés pour colorer le matériel biologique avant l'examen microscopique

2.4.3 : Microscopie d'interférence - Biologie


De toutes les techniques utilisées en biologie, la microscopie est probablement la plus importante. La grande majorité des organismes vivants sont trop petits pour être vus en détail avec l'œil humain, et les cellules et leurs organites ne peuvent être vus qu'à l'aide d'un microscope. Les cellules ont été vues pour la première fois en 1665 par Robert Hooke (qui les a nommées d'après les cellules de moines dans un monastère) et ont été étudiées plus en détail par Leeuwehoek à l'aide d'un microscope primitif.

Unités de mesure

Grossissement et résolution [retour au sommet]

En utilisant plus de lentilles, les microscopes peuvent grossir davantage, mais cela ne signifie pas toujours que plus de détails peuvent être vus. La quantité de détails dépend de la pouvoir de résolution d'un microscope, qui est la plus petite séparation à laquelle deux objets séparés peuvent être distingués (ou résolus).

Le pouvoir de résolution d'un microscope est finalement limité par la longueur d'onde de la lumière (400-600 nm pour la lumière visible). Pour améliorer le pouvoir de résolution, une longueur d'onde de lumière plus courte est nécessaire, et parfois les microscopes ont des filtres bleus à cette fin (car le bleu a la longueur d'onde la plus courte de la lumière visible).

Grossissement c'est à quel point un échantillon semble être plus gros au microscope qu'il ne l'est dans la vraie vie.

Grossissement global = lentille d'objectif x lentille d'oculaire

Résolution est la capacité de distinguer deux points sur une image, c'est-à-dire la quantité de détails

  • La résolution d'une image est limitée par la longueur d'onde du rayonnement utilisé pour visualiser l'échantillon.
  • En effet, lorsque les objets dans l'échantillon sont beaucoup plus petits que la longueur d'onde du rayonnement utilisé, ils n'interrompent pas les ondes et ne sont donc pas détectés.
  • La longueur d'onde de la lumière est beaucoup plus grande que la longueur d'onde des électrons, donc la résolution du microscope optique est beaucoup plus faible.
  • L'utilisation d'un microscope avec un grossissement plus puissant ne pas augmentez encore cette résolution. Cela augmentera la taille de l'image, mais les objets à moins de 200 nm ne seront toujours vus que comme un seul point.

2.3 Instruments de microscopie

Les premiers pionniers de la microscopie ont ouvert une fenêtre sur le monde invisible des micro-organismes. Mais la microscopie a continué à progresser dans les siècles qui ont suivi. En 1830, Joseph Jackson Lister a créé un microscope optique essentiellement moderne. Le 20e siècle a vu le développement de microscopes utilisant la lumière non visible, comme la microscopie à fluorescence, qui utilise une source de lumière ultraviolette, et la microscopie électronique, qui utilise des faisceaux d'électrons à courte longueur d'onde. Ces progrès ont conduit à des améliorations majeures en termes de grossissement, de résolution et de contraste. En comparaison, les microscopes relativement rudimentaires de van Leeuwenhoek et de ses contemporains étaient bien moins puissants que les microscopes les plus basiques utilisés aujourd'hui. Dans cette section, nous examinerons le large éventail de technologies microscopiques modernes et les applications courantes pour chaque type de microscope.

Microscopie optique

De nombreux types de microscopes appartiennent à la catégorie des microscopes optiques, qui utilisent la lumière pour visualiser des images. Des exemples de microscopes optiques comprennent les microscopes à fond clair, les microscopes à fond noir, les microscopes à contraste de phase, les microscopes à contraste interférentiel différentiel, les microscopes à fluorescence, les microscopes laser à balayage confocal et les microscopes à deux photons. Ces différents types de microscopes optiques peuvent être utilisés en complémentarité dans le diagnostic et la recherche.

Microscopes à fond clair

Le microscope à fond clair, peut-être le type de microscope le plus couramment utilisé, est un microscope composé avec deux lentilles ou plus qui produisent une image sombre sur un fond clair. Certains microscopes à fond clair sont monoculaires (ayant un seul oculaire), bien que la plupart des microscopes à fond clair plus récents soient binoculaires (ayant deux oculaires), comme celui illustré à la figure 2.12 dans les deux cas, chaque oculaire contient une lentille appelée lentille oculaire. Les lentilles oculaires grossissent généralement les images 10 fois (10⨯). À l'autre extrémité du tube du corps se trouve un ensemble de lentilles d'objectif sur une tourelle nasale rotative. Le grossissement de ces lentilles d'objectif varie généralement de 4⨯ à 100⨯, le grossissement de chaque lentille étant désigné sur le boîtier métallique de la lentille. Les lentilles oculaires et objectives travaillent ensemble pour créer une image agrandie. Le grossissement total est le produit du grossissement oculaire par le grossissement de l'objectif :

Par exemple, si un objectif de 40⨯ est sélectionné et que la lentille oculaire est de 10⨯, le grossissement total serait

L'élément en cours de visualisation est appelé un spécimen. L'échantillon est placé sur une lame de verre, qui est ensuite clipsée en place sur la platine (une plate-forme) du microscope. Une fois la lame fixée, l'échantillon sur la lame est positionné au-dessus de la lumière à l'aide des boutons de la platine mécanique x-y. Ces boutons déplacent la glissière sur la surface de la scène, mais ne soulèvent ni n'abaissent la scène. Une fois que l'échantillon est centré sur la lumière, la position de la scène peut être relevée ou abaissée pour focaliser l'image. Le bouton de mise au point grossier est utilisé pour les mouvements à grande échelle avec des objectifs de 4⨯ et 10⨯, le bouton de mise au point fine est utilisé pour les mouvements à petite échelle, en particulier avec des objectifs de 40⨯ ou 100⨯.

Lorsque les images sont agrandies, elles deviennent plus sombres car il y a moins de lumière par unité de surface d'image. Les images fortement agrandies produites par les microscopes nécessitent donc un éclairage intense. Dans un microscope à fond clair, cette lumière est fournie par un illuminateur , qui est généralement une ampoule à haute intensité sous la platine. La lumière de l'illuminateur traverse la lentille du condenseur (située sous la platine), qui concentre tous les rayons lumineux sur l'échantillon pour maximiser l'éclairage. La position du condenseur peut être optimisée à l'aide du bouton de mise au point du condenseur attaché une fois que la distance optimale est établie, le condenseur ne doit pas être déplacé pour régler la luminosité. Si des niveaux de lumière inférieurs au maximum sont nécessaires, la quantité de lumière frappant l'échantillon peut être facilement ajustée en ouvrant ou en fermant un diaphragme entre le condenseur et l'échantillon. Dans certains cas, la luminosité peut également être réglée à l'aide du rhéostat , un gradateur qui contrôle l'intensité de l'illuminateur.

Un microscope à fond clair crée une image en dirigeant la lumière de l'illuminateur vers l'échantillon, cette lumière est transmise, absorbée, réfléchie ou réfractée de manière différentielle par différentes structures. Différentes couleurs peuvent se comporter différemment car elles interagissent avec les chromophores (pigments qui absorbent et réfléchissent des longueurs d'onde particulières de la lumière) dans certaines parties du spécimen. Souvent, des chromophores sont ajoutés artificiellement à l'échantillon à l'aide de colorants, qui servent à augmenter le contraste et la résolution. En général, les structures de l'échantillon apparaîtront plus sombres, à divers degrés, que l'arrière-plan clair, créant des images d'une netteté maximale à des grossissements allant jusqu'à environ 1000 ⨯. Un grossissement supplémentaire créerait une image plus grande, mais sans augmentation de la résolution. Cela nous permet de voir des objets aussi petits que des bactéries, qui sont visibles à environ 400⨯ environ, mais pas des objets plus petits tels que des virus.

À des grossissements très élevés, la résolution peut être compromise lorsque la lumière traverse la petite quantité d'air entre l'échantillon et l'objectif. Cela est dû à la grande différence entre les indices de réfraction de l'air et du verre, l'air diffuse les rayons lumineux avant qu'ils ne puissent être focalisés par la lentille. Pour résoudre ce problème, une goutte d'huile peut être utilisée pour remplir l'espace entre l'échantillon et une lentille à immersion d'huile, une lentille spéciale conçue pour être utilisée avec des huiles à immersion. Étant donné que l'huile a un indice de réfraction très similaire à celui du verre, elle augmente l'angle maximal auquel la lumière sortant de l'échantillon peut frapper la lentille. Cela augmente la lumière collectée et, par conséquent, la résolution de l'image (Figure 2.13). Une variété d'huiles peut être utilisée pour différents types de lumière.

Micro-connexions

Maintenance des microscopes : meilleures pratiques

Même un microscope très puissant ne peut pas fournir d'images haute résolution s'il n'est pas correctement nettoyé et entretenu. Étant donné que les lentilles sont soigneusement conçues et fabriquées pour réfracter la lumière avec un degré élevé de précision, même une lentille légèrement sale ou rayée réfractera la lumière de manière involontaire, dégradant l'image de l'échantillon. De plus, les microscopes sont des instruments assez délicats, et il faut faire très attention pour éviter d'endommager les pièces et les surfaces. Entre autres choses, l'entretien approprié d'un microscope comprend les éléments suivants :

  • nettoyer les lentilles avec du papier pour lentilles
  • ne pas permettre aux lentilles d'entrer en contact avec la diapositive (par exemple, en changeant rapidement la mise au point)
  • protéger l'ampoule (s'il y en a une) de la casse
  • ne pas pousser un objectif dans une diapositive
  • ne pas utiliser le bouton de mise au point grossier lors de l'utilisation d'objectifs de 40⨯ ou plus
  • utiliser uniquement de l'huile d'immersion avec un objectif à huile spécialisé, généralement l'objectif 100⨯
  • huile de nettoyage des lentilles à immersion après utilisation du microscope
  • nettoyer toute huile transférée accidentellement d'autres lentilles
  • couvrir le microscope ou le placer dans une armoire lorsqu'il n'est pas utilisé

Lien vers l'apprentissage

Visitez la ressource en ligne liée ci-dessous pour des simulations et des démonstrations impliquant l'utilisation de microscopes. Gardez à l'esprit que l'exécution de techniques et de procédures spécifiques peut varier en fonction de l'instrument spécifique que vous utilisez. Ainsi, il est important d'apprendre et de pratiquer avec un microscope réel dans un laboratoire sous la supervision d'un expert.

Microscopie à fond noir

Un microscope à fond noir est un microscope à fond clair qui présente une modification petite mais significative du condenseur. Un petit disque opaque (d'environ 1 cm de diamètre) est placé entre l'illuminateur et la lentille du condenseur. Cet arrêt de lumière opaque, comme on appelle le disque, bloque la majeure partie de la lumière de l'illuminateur lorsqu'elle passe à travers le condenseur sur son chemin vers l'objectif, produisant un cône de lumière creux qui est focalisé sur l'échantillon. La seule lumière qui atteint l'objectif est la lumière qui a été réfractée ou réfléchie par les structures de l'échantillon. L'image résultante montre généralement des objets lumineux sur un fond sombre (Figure 2.14).

La microscopie sur fond noir peut souvent créer des images à contraste élevé et à haute résolution d'échantillons sans utiliser de colorants, ce qui est particulièrement utile pour visualiser des échantillons vivants qui pourraient être tués ou autrement compromis par les taches. Par exemple, les spirochètes minces comme Treponema pallidum , l'agent causal de la syphilis, peut être mieux visualisé à l'aide d'un microscope à fond noir (Figure 2.15).

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Orientation clinique

Partie 2

Les infections des plaies comme celle de Cindy peuvent être causées par de nombreux types de bactéries, dont certaines peuvent se propager rapidement avec de graves complications. L'identification de la cause spécifique est très importante pour sélectionner un médicament qui peut tuer ou arrêter la croissance de la bactérie.

Après avoir appelé un médecin local au sujet du cas de Cindy, l'infirmière du camp envoie l'échantillon de la plaie au laboratoire médical le plus proche. Malheureusement, comme le camp est situé dans une région éloignée, le laboratoire le plus proche est petit et mal équipé. Un laboratoire plus moderne utiliserait probablement d'autres méthodes pour cultiver, cultiver et identifier les bactéries, mais dans ce cas, le technicien décide de faire une monture humide à partir de l'échantillon et de l'observer sous un microscope à fond clair. Dans une monture humide, une petite goutte d'eau est ajoutée à la lame et une lamelle est placée sur le spécimen pour le maintenir en place avant qu'il ne soit placé sous l'objectif.

Sous le microscope à fond clair, le technicien peut à peine voir les cellules bactériennes car elles sont presque transparentes sur le fond clair. Pour augmenter le contraste, le technicien insère un stop lumineux opaque au-dessus de l'illuminateur. L'image en fond noir qui en résulte montre clairement que les cellules bactériennes sont sphériques et regroupées en grappes, comme les raisins.

  • Pourquoi est-il important d'identifier la forme et les schémas de croissance des cellules dans un échantillon ?
  • Quels autres types de microscopie pourraient être utilisés efficacement pour visualiser cet échantillon ?

Passez à la prochaine case Clinical Focus. Revenez à la case Clinical Focus précédente.

Microscopes à contraste de phase

Les microscopes à contraste de phase utilisent la réfraction et les interférences causées par les structures d'un échantillon pour créer des images à contraste élevé et à haute résolution sans coloration. C'est le type de microscope le plus ancien et le plus simple qui crée une image en modifiant les longueurs d'onde des rayons lumineux traversant l'échantillon. Pour créer des chemins de longueur d'onde modifiés, une butée annulaire est utilisée dans le condenseur. La butée annulaire produit un cône de lumière creux qui est focalisé sur l'échantillon avant d'atteindre l'objectif. L'objectif contient une plaque de phase contenant un anneau de phase. En conséquence, la lumière provenant directement de l'illuminateur traverse l'anneau de phase tandis que la lumière réfractée ou réfléchie par l'échantillon traverse la plaque. Cela fait que les ondes traversant l'anneau sont déphasées d'environ la moitié d'une longueur d'onde par rapport à celles traversant la plaque. Comme les ondes ont des pics et des creux, elles peuvent s'additionner (si elles sont en phase ensemble) ou s'annuler (si elles ne sont pas en phase). Lorsque les longueurs d'onde sont déphasées, les creux d'onde annulent les pics d'onde, ce qui est appelé interférence destructive. Les structures qui réfractent la lumière apparaissent alors sombres sur un fond clair de lumière non réfractée uniquement. Plus généralement, les structures qui diffèrent par des caractéristiques telles que l'indice de réfraction différeront par les niveaux d'obscurité (figure 2.16).

Parce qu'elle augmente le contraste sans nécessiter de coloration, la microscopie à contraste de phase est souvent utilisée pour observer des spécimens vivants. Certaines structures, telles que les organites dans les cellules eucaryotes et les endospores dans les cellules procaryotes, sont particulièrement bien visualisées en microscopie à contraste de phase (Figure 2.17).

Microscopes à contraste d'interférence différentielle

Les microscopes à contraste d'interférence différentiel (DIC) (également connus sous le nom d'optique Nomarski) sont similaires aux microscopes à contraste de phase en ce sens qu'ils utilisent des motifs d'interférence pour améliorer le contraste entre les différentes caractéristiques d'un échantillon. Dans un microscope DIC, deux faisceaux de lumière sont créés dans lesquels la direction du mouvement des ondes (polarisation) diffère. Une fois que les faisceaux ont traversé l'échantillon ou l'espace sans échantillon, ils sont recombinés et les effets des échantillons provoquent des différences dans les diagrammes d'interférence générés par la combinaison des faisceaux. Il en résulte des images très contrastées d'organismes vivants avec une apparence tridimensionnelle. Ces microscopes sont particulièrement utiles pour distinguer des structures dans des spécimens vivants non colorés. (Figure 2.18)

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Microscopes à fluorescence

Un microscope à fluorescence utilise des chromophores fluorescents appelés fluorochromes, qui sont capables d'absorber l'énergie d'une source lumineuse, puis d'émettre cette énergie sous forme de lumière visible. Les fluorochromes comprennent des substances naturellement fluorescentes (telles que les chlorophylles) ainsi que des colorants fluorescents qui sont ajoutés à l'échantillon pour créer un contraste. Les colorants tels que le rouge Texas et le FITC sont des exemples de fluorochromes. D'autres exemples incluent les colorants d'acide nucléique 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l'orange d'acridine.

Le microscope transmet une lumière d'excitation, généralement une forme d'EMR avec une courte longueur d'onde, telle que la lumière ultraviolette ou bleue, vers l'échantillon, les chromophores absorbent la lumière d'excitation et émettent de la lumière visible avec des longueurs d'onde plus longues. La lumière d'excitation est ensuite filtrée (en partie parce que la lumière ultraviolette est nocive pour les yeux) de sorte que seule la lumière visible traverse la lentille oculaire. Cela produit une image du spécimen dans des couleurs vives sur un fond sombre.

Les microscopes à fluorescence sont particulièrement utiles en microbiologie clinique. Ils peuvent être utilisés pour identifier des agents pathogènes, pour trouver des espèces particulières dans un environnement ou pour trouver l'emplacement de molécules et de structures particulières dans une cellule. Des approches ont également été développées pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes à l'aide de la microscopie à fluorescence selon qu'elles absorbent ou non des fluorochromes particuliers. Parfois, plusieurs fluorochromes sont utilisés sur le même spécimen pour montrer différentes structures ou caractéristiques.

L'une des applications les plus importantes de la microscopie à fluorescence est une technique appelée immunofluorescence, qui est utilisée pour identifier certains microbes pathogènes en observant si les anticorps se lient à eux.(Les anticorps sont des molécules protéiques produites par le système immunitaire qui se fixent à des agents pathogènes spécifiques pour les tuer ou les inhiber.) Il existe deux approches de cette technique : le test d'immunofluorescence directe (DFA) et le test d'immunofluorescence indirecte (IFA) . Dans le DFA, des anticorps spécifiques (par exemple, ceux qui ciblent le virus de la rage) sont colorés avec un fluorochrome. Si l'échantillon contient l'agent pathogène ciblé, on peut observer les anticorps se liant à l'agent pathogène au microscope à fluorescence. C'est ce qu'on appelle une coloration d'anticorps primaire parce que les anticorps colorés se fixent directement sur l'agent pathogène.

Dans l'IFA, les anticorps secondaires sont colorés avec un fluorochrome plutôt que des anticorps primaires. Les anticorps secondaires ne se fixent pas directement à l'agent pathogène, mais ils se lient aux anticorps primaires. Lorsque les anticorps primaires non colorés se lient à l'agent pathogène, les anticorps secondaires fluorescents peuvent être observés se liant aux anticorps primaires. Ainsi, les anticorps secondaires sont liés indirectement à l'agent pathogène. Étant donné que plusieurs anticorps secondaires peuvent souvent se lier à un anticorps primaire, l'IFA augmente le nombre d'anticorps fluorescents attachés à l'échantillon, ce qui facilite la visualisation des caractéristiques de l'échantillon (Figure 2.19).

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Microscopes confocaux

Alors que d'autres formes de microscopie optique créent une image focalisée au maximum à une seule distance de l'observateur (la profondeur ou le plan z), un microscope confocal utilise un laser pour balayer successivement plusieurs plans z. Cela produit de nombreuses images bidimensionnelles à haute résolution à différentes profondeurs, qui peuvent être construites en une image tridimensionnelle par un ordinateur. Comme avec les microscopes à fluorescence, les colorants fluorescents sont généralement utilisés pour augmenter le contraste et la résolution. La clarté de l'image est encore améliorée par une ouverture étroite qui élimine toute lumière qui ne provient pas du plan z. Les microscopes confocaux sont donc très utiles pour examiner des spécimens épais tels que des biofilms, qui peuvent être examinés vivants et non fixés (Figure 2.20).

Lien vers l'apprentissage

Explorez une vue tridimensionnelle rotative d'un biofilm observé au microscope confocal. Après avoir navigué sur la page Web, cliquez sur le bouton « lecture » ​​pour lancer la vidéo.

Microscopes à deux photons

Alors que les microscopes à fluorescence et confocaux d'origine permettaient une meilleure visualisation des caractéristiques uniques des spécimens, il y avait encore des problèmes qui empêchaient une visualisation optimale. La sensibilité effective de la microscopie à fluorescence lors de la visualisation d'échantillons épais était généralement limitée par la lumière parasite hors foyer, ce qui entraînait une mauvaise résolution. Cette limitation a été considérablement réduite dans le microscope confocal grâce à l'utilisation d'un sténopé confocal pour rejeter la fluorescence de fond hors foyer avec des sections optiques minces (<1 m), non floues. Cependant, même les microscopes confocaux n'avaient pas la résolution nécessaire pour visualiser des échantillons de tissus épais. Ces problèmes ont été résolus avec le développement du microscope à deux photons, qui utilise une technique de balayage, des fluorochromes et une lumière à grande longueur d'onde (comme l'infrarouge) pour visualiser les spécimens. La faible énergie associée à la lumière à grande longueur d'onde signifie que deux photons doivent frapper un endroit en même temps pour exciter le fluorochrome. La faible énergie de la lumière d'excitation est moins dommageable pour les cellules, et la longue longueur d'onde de la lumière d'excitation pénètre plus facilement dans les échantillons épais. Cela rend le microscope à deux photons utile pour examiner des cellules vivantes dans des tissus intacts - des tranches de cerveau, des embryons, des organes entiers et même des animaux entiers.

Actuellement, l'utilisation des microscopes à deux photons est limitée aux laboratoires cliniques et de recherche avancés en raison des coûts élevés des instruments. Un seul microscope à deux photons coûte généralement entre 300 000 $ et 500 000 $, et les lasers utilisés pour exciter les colorants utilisés sur les spécimens sont également très coûteux. Cependant, à mesure que la technologie s'améliore, les microscopes à deux photons peuvent devenir plus facilement disponibles dans les milieux cliniques.

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Microscopie électronique

La résolution théorique maximale des images créées par les microscopes optiques est finalement limitée par les longueurs d'onde de la lumière visible. La plupart des microscopes optiques ne peuvent grossir que 1000⨯, et quelques-uns peuvent grossir jusqu'à 1500⨯, mais cela ne commence pas à approcher le pouvoir grossissant d'un microscope électronique. (EM), qui utilise des faisceaux d'électrons à courte longueur d'onde plutôt que de la lumière pour augmenter le grossissement et la résolution.

Les électrons, comme le rayonnement électromagnétique, peuvent se comporter comme des ondes, mais avec des longueurs d'onde de 0,005 nm, ils peuvent produire une bien meilleure résolution que la lumière visible. Un EM peut produire une image nette qui est agrandie jusqu'à 100 000 ⨯. Ainsi, les EM peuvent résoudre les structures subcellulaires ainsi que certaines structures moléculaires (par exemple, des brins simples d'ADN), cependant, la microscopie électronique ne peut pas être utilisée sur du matériel vivant en raison des méthodes nécessaires pour préparer les spécimens.

Il existe deux types de base de ME : le microscope électronique à transmission (MET) et le microscope électronique à balayage (MEB) (figure 2.21). Le MET est quelque peu analogue au microscope optique à fond clair en termes de fonctionnement. Cependant, il utilise un faisceau d'électrons au-dessus de l'échantillon qui est focalisé à l'aide d'une lentille magnétique (plutôt qu'une lentille en verre) et projeté à travers l'échantillon sur un détecteur. Les électrons traversent l'échantillon, puis le détecteur capture l'image (Figure 2.22).

Pour que les électrons traversent l'échantillon dans un MET, l'échantillon doit être extrêmement fin (20 à 100 nm d'épaisseur). L'image est produite en raison de l'opacité variable dans diverses parties de l'échantillon. Cette opacité peut être améliorée en colorant l'échantillon avec des matériaux tels que des métaux lourds, qui sont denses aux électrons. La MET exige que le faisceau et l'échantillon soient sous vide et que l'échantillon soit très mince et déshydraté. Les étapes spécifiques nécessaires à la préparation d'un échantillon pour observation sous EM sont discutées en détail dans la section suivante.

Les SEM forment des images de surfaces d'échantillons, généralement à partir d'électrons qui sont éjectés des échantillons par un faisceau d'électrons. Cela peut créer des images très détaillées avec une apparence tridimensionnelle qui sont affichées sur un moniteur (Figure 2.23). En règle générale, les spécimens sont séchés et préparés avec des fixateurs qui réduisent les artefacts, tels que le flétrissement, qui peuvent être produits par séchage, avant d'être recouverts par pulvérisation d'une fine couche de métal tel que l'or. Alors que la microscopie électronique à transmission nécessite des coupes très fines et permet de voir les structures internes telles que les organites et l'intérieur des membranes, la microscopie électronique à balayage peut être utilisée pour visualiser les surfaces d'objets plus gros (comme un grain de pollen) ainsi que les surfaces de très petits échantillons (figure 2.24). Certains EM peuvent agrandir une image jusqu'à 2 000 000 ⨯. 1

Vérifie ta compréhension

  • Quels sont les avantages et les inconvénients de la microscopie électronique, par opposition à la microscopie optique, pour l'examen d'échantillons microbiologiques ?
  • Quels types d'échantillons sont mieux examinés à l'aide de la MET ? SEM ?

Micro-connexions

Utiliser la microscopie pour étudier les biofilms

Un biofilm est une communauté complexe d'une ou plusieurs espèces de micro-organismes, formant généralement un revêtement visqueux attaché à une surface en raison de la production d'une substance extrapolymère (EPS) qui se fixe à une surface ou à l'interface entre les surfaces (par exemple, entre l'air et de l'eau). Dans la nature, les biofilms sont abondants et occupent fréquemment des niches complexes au sein des écosystèmes (Figure 2.25). En médecine, les biofilms peuvent recouvrir les dispositifs médicaux et exister dans le corps. Parce qu'ils possèdent des caractéristiques uniques, telles qu'une résistance accrue contre le système immunitaire et aux médicaments antimicrobiens, les biofilms intéressent particulièrement les microbiologistes et les cliniciens.

Parce que les biofilms sont épais, ils ne peuvent pas être très bien observés à l'aide de la microscopie optique. Le découpage d'un biofilm pour créer un échantillon plus mince pourrait tuer ou perturber la communauté microbienne. La microscopie confocale fournit des images plus claires des biofilms car elle peut se concentrer sur un plan z à la fois et produire une image tridimensionnelle d'un échantillon épais. Les colorants fluorescents peuvent être utiles pour identifier les cellules dans la matrice. De plus, des techniques telles que l'immunofluorescence et l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), dans lesquelles des sondes fluorescentes sont utilisées pour se lier à l'ADN, peuvent être utilisées.

La microscopie électronique peut être utilisée pour observer les biofilms, mais seulement après avoir déshydraté l'échantillon, ce qui produit des artefacts indésirables et déforme l'échantillon. En plus de ces approches, il est possible de suivre les courants d'eau à travers les formes (telles que les cônes et les champignons) des biofilms, en utilisant la vidéo du mouvement des billes enduites de fluorescence (Figure 2.26).

Microscopie à sonde à balayage

Un microscope à sonde à balayage n'utilise pas de lumière ni d'électrons, mais plutôt des sondes très pointues qui passent sur la surface de l'échantillon et interagissent directement avec lui. Cela produit des informations qui peuvent être assemblées en images avec des grossissements allant jusqu'à 100 000 000 ⨯. De tels grossissements peuvent être utilisés pour observer des atomes individuels sur des surfaces. À ce jour, ces techniques ont été utilisées principalement pour la recherche plutôt que pour le diagnostic.

Il existe deux types de microscope à sonde à balayage : le microscope à effet tunnel (STM) et le microscope à force atomique (AFM). Un STM utilise une sonde qui passe juste au-dessus de l'échantillon car une tension de polarisation constante crée le potentiel d'un courant électrique entre la sonde et l'échantillon. Ce courant se produit par effet tunnel quantique d'électrons entre la sonde et l'échantillon, et l'intensité du courant dépend de la distance entre la sonde et l'échantillon. La sonde est déplacée horizontalement au-dessus de la surface et l'intensité du courant est mesurée. La microscopie à effet tunnel peut cartographier efficacement la structure des surfaces à une résolution à laquelle les atomes individuels peuvent être détectés.

Semblable à un STM, les AFM ont une sonde fine qui passe juste au-dessus de l'échantillon. Cependant, plutôt que de mesurer les variations du courant à une hauteur constante au-dessus de l'échantillon, un AFM établit un courant constant et mesure les variations de la hauteur de la pointe de la sonde lorsqu'elle passe sur l'échantillon. Lorsque la pointe de la sonde passe sur l'échantillon, les forces entre les atomes (forces de van der Waals, forces capillaires, liaison chimique, forces électrostatiques et autres) provoquent son déplacement vers le haut et vers le bas. La déviation de la pointe de la sonde est déterminée et mesurée à l'aide de la loi d'élasticité de Hooke, et cette information est utilisée pour construire des images de la surface de l'échantillon avec une résolution au niveau atomique (Figure 2.27).

La figure 2.28, la figure 2.29 et la figure 2.30 résument les techniques de microscopie pour les microscopes optiques, les microscopes électroniques et les microscopes à sonde à balayage, respectivement.

Vérifie ta compréhension

  • Lequel a un grossissement plus élevé, un microscope optique ou un microscope à sonde à balayage ?
  • Nommez un avantage et une limitation de la microscopie à sonde à balayage.

Notes de bas de page

    « Microscope électronique à transmission JEM-ARM200F », JEOL USA Inc, http://www.jeolusa.com/PRODUCTS/TransmissionElectronMicroscopes%28TEM%29/200kV/JEM-ARM200F/tabid/663/Default.aspx#195028-specifications. Consulté le 28/08/2015.

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    • Auteurs : Nina Parker, Mark Schneegurt, Anh-Hue Thi Tu, Philip Lister, Brian M. Forster
    • Éditeur/site Web : OpenStax
    • Titre du livre : Microbiologie
    • Date de parution : 1 novembre 2016
    • Lieu : Houston, Texas
    • URL du livre : https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction
    • URL de la section : https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-3-instruments-of-microscopy

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    Processus d'auto-assemblage aux interfaces

    3.3.6 Microscopies optiques à champ proche et spectroscopie à balayage

    Le SNOM (chapitre 3.2.4) a été utilisé pour irradier des films de protéines sur silicium et obtenir leurs spectres IR moyen avec une résolution spatiale d'environ 10 nm obtenue par optique de champ proche. Tout d'abord, les spectres IR des molécules de ferritine individuelles et ceux du virus de la mosaïque du tabac (TMV) ont été comparés et se sont avérés identiques au spectre IR obtenu en champ lointain sous irradiation à incidence rasante. La technique a ensuite été utilisée pour différencier les agrégats d'insuline riches en feuillets du TMV riche en hélices mélangées entre elles. La résolution spatiale offerte par la technique a permis de distinguer le TMV de l'insuline, qui apparaissaient toutes deux sous forme de filaments dans l'image SNOM [182] .


    Microscope : Types de microscope

    Les points suivants mettent en évidence les treize principaux types de microscopes. Certains des types sont : Microscope simple 2. Microscope composé 3. Microscope de recherche 4. Microscope binoculaire à dissection 5. Microscope à contraste de phase 6. Microscope à interférence 7. Microscope à contraste d'interférence différentielle 8. Microscope à fluorescence 9. Microscope électronique 10. Microscope électronique à transmission et autres.

    Taper # 1. Microscope simple :

    1. Un microscope simple est une lentille convexe de courte focale.

    2. Il est utilisé pour former une image virtuelle d'un objet placé juste à l'intérieur de son foyer principal.

    3. Il est composé d'une seule lentille convexe ou d'une combinaison de lentilles qui fonctionne comme une lentille convexe.

    4. La lentille convexe agrandit l'objet et aide également à produire une image agrandie d'un objet proche qui semble être à distance de vision distincte.

    5. Au microscope simple, l'image agrandie (Fig. 143) de l'objet se forme sur la rétine de l'œil du spectateur.

    6. Une simple lentille ne peut grossir un objet que trois fois OX). Pour obtenir un grossissement de plus de 3X, une combinaison de plusieurs objectifs est utilisée. Une telle combinaison de plusieurs lentilles (appelées éléments) fonctionne comme une seule lentille convexe, et un grossissement d'environ 20X peut être obtenu.

    7. Des microscopes simples améliorés, utilisés par les biologistes pendant le travail sur le terrain, peuvent agrandir un objet jusqu'à 100 fois. Dans de tels microscopes, des lentilles à éléments multiples sont utilisées. Il se compose d'une combinaison d'une double lentille concave de verre couronne montée entre deux doubles lentilles convexes de verre silex. C'est ce qu'on appelle un aplanarlens ou un triplet achromatique. Trois de ces lentilles aplanaires sont collées ensemble et fonctionnent comme une seule lentille.

    Un microscope à dissection (Fig.144) est un exemple de microscope simple utilisé soit pour disséquer le matériau, soit pour visualiser l'image agrandie du matériau. Il se compose d'une seule lentille. Cette unité d'objectif peut même être une loupe ordinaire.

    Il est utilisé soit pour disséquer le matériau, soit pour des grossissements moindres, c'est-à-dire seulement 6X, 12X ou rarement 20X. Il est principalement utilisé pour la séparation des embryons, les études taxonomiques, etc. Il a un pied basal et un membre. L''étage', constitué d'une simple plaque de verre, est fixé au membre.

    Pour le réglage de la lumière, un miroir est fixé au membre sous la scène. Le miroir peut être déplacé verticalement à l'aide d'une vis de réglage. A l'extrémité du membre est présent un bras replié, sur lequel est montée une lentille de grossissement défini (6X, 12X, etc.). Le bras plié est déplacé pour maintenir l'objectif dans la position souhaitée sur la scène.

    Le matériel à voir ou à disséquer sous un microscope à dissection est placé sur la scène. L'œil est placé près du cristallin. Le bras plié est incliné pour amener la lentille sur le matériau. La lumière est ajustée par le mouvement du miroir. La mise au point se fait à l'aide de la vis de réglage de ce microscope.

    Taper # 2. Microscope composé :

    Un microscope composé (Fig.145) comprend soit deux (objectifs et oculaire) soit trois (condenseur, objectifs et oculaire ou oculaire) types de lentilles. Le condenseur, situé au-dessus du miroir et au-dessous de la scène, recueille et focalise les rayons lumineux dans le plan de l'objet.

    Les objectifs (10X, 40X, 100X) sont montés sur une tourelle porte-objectifs. Chaque objectif se compose d'un ensemble d'éléments fusionnés pour fonctionner comme une seule lentille. Les objectifs recueillent les rayons lumineux de l'objet et forment une image réelle agrandie à une certaine distance au-dessus d'eux (Fig. 146).

    Les oculaires ou oculaires sont situés au sommet du tube du corps. L'oculaire a généralement des lentilles 5X, 10X ou 15X. L'oculaire grossit l'image formée par l'objectif (Fig. 146). Un microscope avec un oculaire ou un oculaire est appelé microscope monoculaire tandis que celui avec deux oculaires est appelé microscope binoculaire.

    1. L'instrument est ainsi nommé car il se compose de deux ou plusieurs systèmes de lentilles (Fig. 145).

    2. Au sommet se trouve la lentille oculaire. Il peut être retourné ou retiré. Au sommet de la lentille oculaire est écrit 5X ou 10X signifiant respectivement le grossissement 5 fois ou 10 fois.

    3. Juste en dessous de l'oculaire se trouve un tube corporel dont l'extrémité inférieure contient une pièce circulaire appelée pièce nasale. Il contient trois lentilles appelées lentilles d'objectif. Le nez peut être tourné pour changer la position des objectifs.

    4. La plate-forme plate présente sous les objectifs est appelée scène.

    5. Sur le bras du microscope sont présents deux boutons nommés bouton de réglage grossier et bouton de réglage fin.

    6. Sur les trois objectifs, le plus court est l'objectif à faible puissance. Il a l'objectif le plus grand mais son pouvoir grossissant est inférieur à celui des objectifs. Sur l'objectif peut également être écrit 10X comme sur la lentille oculaire. Cela signifie que si une lentille oculaire 10X est utilisée, le grossissement est de 10 X 10 – 100 fois.

    7. L'autre objectif est l'objectif à haute puissance. Son grossissement est égal au nombre écrit dessus multiplié par la puissance de l'oculaire c'est-à-dire 5X ou 10X (objectif x oculaire).

    8. Le troisième objectif est l'immersion dans l'huile. Généralement, il contient une bande noire autour de l'extrémité inférieure. Une goutte d'huile est utilisée sur la lame lors de l'étude avec l'objectif à immersion d'huile. Son grossissement peut être estimé comme objectif x oculaire.

    L'utilisation d'huile est indispensable afin de maintenir les rayons lumineux correctement alignés avec le petit objectif.

    9. Juste en dessous de la scène se trouve le condenseur. Sa fonction est de recueillir la lumière du miroir et de la diriger vers l'objectif. Le condenseur peut être abaissé ou relevé par un bouton présent sur un côté du microscope sous la platine.

    10. Le condenseur contient un obturateur appelé diaphragme à iris.

    11. Juste en dessous du condenseur se trouve un miroir dont une surface est plate et l'autre concave ? Utilisez la surface concave à la lumière du jour. La surface plane du miroir est utilisée lorsque la lampe électrique est utilisée.

    1. Nettoyez les lentilles oculaires et les objectifs avec du papier pour lentilles et ne les retirez pas.

    2. Pendant que vous étudiez un objet, apprenez à garder une main sur le bouton de mise au point fine et faites la mise au point continuellement de haut en bas.

    3. Pendant l'étude de tout type de préparation, n'inclinez pas le microscope.

    4.Laissez l'objectif de faible puissance en place après avoir terminé toutes les observations.

    5. Pour examiner un objet, utilisez toujours d'abord les objectifs à faible puissance, puis les autres objectifs.

    6. Ne laissez jamais un objectif heurter la platine ou une lame pendant la mise au point.

    7. Utilisez toujours le réglage fin avec un objectif à haute puissance.

    8. Toutes les préparations humides doivent être préalablement recouvertes d'une lamelle.

    9. Évitez l'habitude d'enlever les pièces du microscope.

    10. N'utilisez pas d'objectif à immersion d'huile sans huile.

    11. La membrane doit être grande ouverte lors de l'utilisation de l'objectif à immersion dans l'huile.

    Taper # 3. Microscope de recherche :

    1. Il s'agit d'un microscope composé doté de lentilles de très bonne qualité et de quelques équipements supplémentaires tels qu'une lentille à immersion dans l'huile, un éclairage intégré, une vision binoculaire et un accessoire pour appareil photo.

    2. L'objectif 100X est appelé objectif à immersion dans l'huile. Il ne peut être utilisé qu'en introduisant une goutte d'huile à immersion entre l'objectif et la lamelle. Si l'huile n'est pas utilisée, l'image de l'objet apparaîtra floue. La gravité spécifique de l'huile d'immersion est équivalente au verre.

    3. Dans le dispositif d'éclairage intégré, le miroir du microscope est remplacé par une ampoule électrique logée dans une chambre munie d'un diaphragme.

    4. L'observation binoculaire signifie qu'au lieu d'un œil, le chercheur peut utiliser les deux yeux ensemble pour l'observation. Pour cette installation, ce microscope est équipé de deux oculaires au lieu d'un.

    5. Les microscopes avec fixation pour appareil photographique sont fournis avec des tubes trinoculaires. Sur ces trois tubes, deux sont munis de deux oculaires pour une vision binoculaire tandis que le troisième tube accueille un appareil photo pour prendre des photos.

    6. En utilisant un objectif oculaire 15X et un objectif 100X, un grossissement maximum de 1500 fois peut être obtenu sous un microscope de recherche.

    Taper # 4. Microscope de dissection binoculaire :

    1. Dans ce microscope, deux systèmes microscopiques sont montés à côté (Fig. 147).

    2. Les deux ensembles d'oculaires et d'objectifs de ce microscope produisent deux images qui sont érigées par deux prismes présents à l'intérieur du corps.

    3. Un espace suffisant est présent entre l'objectif et la scène. Cela aide à la dissection facile et à une étude appropriée du matériel.

    4. Ce microscope est utilisé pour faire des dissections fines des spécimens et pour étudier leurs montures brutes car une image tridimensionnelle est disponible grâce à la possibilité de visualisation binoculaire.

    5. Le grossissement maximum obtenu par ce microscope est de 150X.

    Taper # 5. Microscope à contraste de phase :

    1. Il a été découvert par le professeur Frits Zernike des Pays-Bas. Sa production commerciale a commencé en Allemagne en 1942. Pour la reconnaissance de sa découverte du contraste de phase, Zernike a reçu le prix Noble de physique en 1953.

    2. Seules les cellules vivantes et non colorées sont étudiées au microscope à contraste de phase. Il en est ainsi parce que les cellules vivantes ne sont généralement pas colorées (c'est-à-dire qu'elles sont des objets en phase pure), mais la lumière transmise par leurs différentes structures aura des différences de phase causées à la fois par des variations d'indice de réfraction résultant de changements de concentration protoplasmique et par des différences d'épaisseur. .

    3. Il s'agit d'un microscope optique spécialement conçu dans lequel une plaque de phase annulaire et un diaphragme annulaire (Fig. 148) sont installés.

    4. Le diaphragme annulaire est situé sous le condenseur. Il est constitué d'un disque circulaire présentant une gorge annulaire circulaire. Les rayons lumineux peuvent traverser la rainure annulaire. A travers la rainure annulaire du diaphragme annulaire, les rayons lumineux tombent sur l'échantillon ou l'objet à étudier.

    Au plan focal arrière de l'objectif se développe une image. La lame de phase annulaire est placée au niveau de ce plan focal arrière. Cette plaque de phase est soit une plaque de phase négative ayant une zone circulaire épaisse, soit une plaque de phase positive ayant une rainure circulaire mince. Cette zone épaisse ou mince dans la plaque de phase est appelée zone conjuguée. La plaque de phase est un disque transparent.

    5. A l'aide du diaphragme annulaire et de la plaque de phase, le contraste de phase est obtenu dans ce microscope. Ceci est obtenu en séparant les rayons directs des rayons diffractés. Les rayons lumineux directs traversent la rainure annulaire tandis que les rayons lumineux diffractés traversent la région à l'extérieur de la rainure.

    6. En fonction des différents indices de réfraction des différents composants cellulaires, l'objet à étudier présente différents degrés de contraste dans ce microscope.

    7. Aucune préparation spéciale de fixation ou de coloration, etc. n'est nécessaire pour étudier un objet au microscope à contraste de phase. Cela fait gagner beaucoup de temps au chercheur car une image claire des cellules non colorées ou vivantes est facilement visible sous ce microscope.

    8. Les applications de la microscopie à contraste de phase dans la recherche biologique sont nombreuses.

    Par cela, on peut étudier :

    (i) Les processus réels de mitose et de méiose dans les cellules vivantes

    (ii) Les effets réels de plusieurs produits chimiques sur les cellules vivantes

    (iii) Le comportement de plusieurs organismes microscopiques (par exemple les protozoaires) vis-à-vis de divers facteurs chimiques et physiques et

    (iv) Processus liés à la perméabilité de la membrane plasmique, etc.

    Taper # 6. Microscope d'interférence :

    1. Il s'agit d'un type amélioré de microscope à contraste de phase qui affiche l'interférence entre la lumière transmise et celle non transmise à travers un échantillon.

    2. Les couleurs d'interférence produites dans ce microscope indiquent des différences d'indice de réfraction.

    3. La lumière dans ce microscope est divisée en deux faisceaux, dont l'un traverse l'échantillon et l'autre un faisceau de référence. Les deux faisceaux sont alors amenés à interférer au niveau du plan image. Des zones de l'échantillon ayant des chemins optiques similaires apparaissent dans l'image de la même couleur ou de la même luminosité.

    4. A la différence du microscope à contraste de phase, dans le microscope interférentiel, l'onde centrale et l'onde diffractée sont complètement séparées lors du passage à travers la plaque de phase.

    5. Dans ce microscope, la plaque de phase annulaire est fixée au-dessous du condenseur de sous-étage tandis que la plaque de phase est fixée au-dessus de la lentille d'objectif dans l'objectif. La lentille oculaire est utilisée pour observer l'image.

    6. Ce microscope peut être utilisé pour mesurer l'épaisseur de la cellule et de ses composants. Il est également utilisé pour déterminer le poids sec d'objets microscopiques tels que des protéines, des acides nucléiques, etc.

    Taper # 7. Micro & shyscope à contraste d'interférence différentielle :

    1. Également appelé microscope DIC ou microscope Nomarski, il s'agit d'une version améliorée du microscope à interférence.

    2. Dans le système optique de ce microscope, un seul faisceau lumineux est utilisé.

    3. En passant à travers l'objet, l'objectif et un prisme biréfringent spécial, le faisceau lumineux unique est divisé en faisceaux interférents.

    4. Un polariseur, des filtres d'analyse et un prisme de compensation sont également présents dans ce microscope.

    5. Un excellent contraste des bords des cellules et de leurs organites est observé sous ce microscope, et leur effet visuel est tridimensionnel.

    6. Semblable au microscope à contraste de phase, seules les cellules ou les matériaux non colorés sont étudiés par ce microscope.

    Taper # 8. Microscope à fluorescence :

    1. Il s'agit d'un type avancé de microscope optique dans lequel l'échantillon est irradié à des longueurs d'onde qui excitent les fluorochromes naturels ou introduits artificiellement. Un filtre optique de ce microscope absorbe les longueurs d'onde d'excitation mais transmet l'image fluorescente qui peut être étudiée normalement.

    2. C'est un microscope utilisé pour observer la fluorescence dans les cellules et les tissus. (La fluorescence est un phénomène dans lequel la longueur d'onde de la lumière ultraviolette invisible est convertie en une longueur d'onde de la lumière dans la gamme visible).

    3. Un microscope à fluorescence se compose (i) d'une lampe, (ii) du système optique et (iii) d'un système d'observation.

    4. La lumière ultraviolette (UV) est utilisée comme source d'éclairage dans ce microscope. Pour obtenir les rayons UV, on utilise des lampes à arcs au mercure à haute pression, des lampes à arcs au xénon ou des lampes halogènes au tungstène. Une paire d'adaptateurs (filtres complémentaires) y sont également installés. Étant donné que les rayons UV sont nocifs pour l'œil humain, la lentille oculaire utilisée dans ce microscope est en verre ordinaire. Cela aide à empêcher les rayons UV d'atteindre l'œil, mais la fluorescence peut être observée facilement.

    5. Ce microscope peut détecter facilement des matériaux fluorescents (par exemple des colorants) dans les cellules, même s'ils sont présents à l'état de traces.

    6. Il est également utilisé dans l'étude de l'ADN, de l'ARN, des protéines et des bandes chromosomiques, la localisation du chromosome Y chez l'homme, la détection de l'hétérochromatine et dans plusieurs études d'immunologie.

    Taper # 9. Microscope électronique :

    1. Le microscope électronique est un instrument qui utilise la courte longueur d'onde d'un faisceau d'électrons, plutôt que des ondes lumineuses, pour obtenir un grossissement et une résolution très élevés de structures minuscules pour lesquelles un microscope optique est inadéquat. Il contient un canon électrique dont le faisceau est réfracté et focalisé sur un échantillon par un système de lentilles électroniques. L'image de l'échantillon est agrandie et projetée sur une scène ou un écran fluorescent.

    2. Sur la base de plusieurs recherches antérieures en physique, Knoll et Ruska (1931) de Berlin ont été les premiers à développer un microscope électronique. À l'aide de leur microscope électronique, ils pouvaient grossir des objets jusqu'à 12 000 fois.

    Grâce à un type amélioré de microscope électronique développé par Borries et Ruska (1938), ils pouvaient obtenir des images d'un grossissement de 20 000 fois. Dans cette matrice, le grossissement de la bobine d'objectif était de 100 et la bobine du projecteur était de 200. La résolution de ce microscope était de 100 Â.

    Les microscopes électroniques avec une résolution de 4-1 OÅ ou même meilleure sont maintenant disponibles.

    3. Un grossissement pouvant atteindre 1, 60 000 fois peut être obtenu en observant des bobines intermédiaires entre les bobines de l'objectif et du projecteur du microscope électronique.

    4. Certaines des différences fondamentales (Fig. 149) entre un microscope optique et un microscope électronique sont mentionnées dans le tableau 13.1.

    Quelques différences entre le microscope optique et le microscope électronique :

    1. La lumière visible est utilisée dans ce microscope.

    2. La source d'illumination est située en bas.

    3- Pour le grossissement dans ce microscope, le système de lentilles se compose de lentilles en verre,

    4. Les lentilles arc oculaire, objectif et condensateur.

    5. L'image est soit vue à l'œil nu, soit enregistrée sur un film photographique avec une caméra dans ce microscope.

    1. Les électrons sont utilisés au microscope électronique.

    2. La source d'éclairage est située en haut de ce microscope.

    3. Le système de lentilles se compose de bobines électromagnétiques dans ce microscope.

    4. Ce microscope a des bobines de projecteur, un objectif et un condenseur.

    5. L'image au microscope électronique est soit enregistrée sur un écran fluorescent, soit enregistrée sur un film photographique.

    Un microscope électronique se compose d'un canon électrique, d'une colonne de microscope, de bobines électromagnétiques, d'un écran fluorescent et de quelques autres accessoires décrits ci-dessous :

    (a) Le canon à électrons est situé au sommet du corps du microscope. C'est la source des électrons. Il est composé d'un filament de tungstène entouré d'un blindage polarisé négativement avec une ouverture. Le faisceau d'électrons est aspiré à travers cette ouverture.

    (b) La colonne du microscope ou colonne centrale est constituée d'un tube métallique sous vide. Il protège la personne qui utilise le microscope des rayons X générés lorsque les électrons frappent la surface du tube métallique.

    (c) Les bobines ou lentilles électromagnétiques comprennent les bobines du projecteur, l'objectif et le condenseur. Dans chaque bobine, les bobines de fil électrique sont enroulées sur un cylindre métallique creux. Le champ magnétique, produit en faisant passer le courant électrique à travers la bobine magnétique, fonctionne comme une loupe.

    (d) L'écran fluorescent est utilisé pour observer l'image agrandie de l'objet. Il reste enduit d'un produit chimique qui, en étant excité, forme l'image comme sur l'écran de télévision.

    (e) Certains autres accessoires essentiels du microscope électronique comprennent des transformateurs haute tension (pour développer un courant haute tension pour le canon à électrons et les bobines électromagnétiques), des pompes à vide (pour maintenir un vide élevé à l'intérieur de la colonne du microscope), un système de refroidissement par eau (pour la prévention de la surchauffe de diverses pièces), une pompe de circulation, une installation de réfrigération et également un système de filtration.

    Toutes ces pièces nécessitent des agencements élaborés et contribuent à la taille massive du microscope électronique.

    6. La formation de l'image dans ce microscope se produit par la diffusion d'électrons. Les électrons frappent les noyaux atomiques et se dispersent. Ces électrons dispersés forment l'image électronique. En projetant sur un écran fluorescent ou un film photographique, cette image électronique est convertie en une image visible de l'objet.

    7. Le faisceau d'électrons dans ce microscope est produit en accélérant des électrons à travers une différence de potentiel de 1 à 1500 kV dans un canon à électrons.

    8. Seuls les spécimens séchés sont étudiés au microscope électronique. Les cellules vivantes ne peuvent pas être étudiées avec ce microscope car elles possèdent de l'eau qui provoque une diffusion à grande échelle des électrons.

    9. Des coupes ultrafines (10-50 nm d'épaisseur), qui sont plus de 200 fois plus fines que celles couramment utilisées pour la microscopie optique, sont découpées pour la microscopie électronique. Ceux-ci sont taillés à l'aide de couteaux en diamant ou en verre d'un ultra-microtome.

    Taper # 10. Microscope électronique à transmission ou MET :

    1. Le microscope électronique à transmission ou MET (Fig. 8) est une forme de microscope électronique dans laquelle les électrons peuvent être transmis à travers les objets.

    2. L'échantillon à étudier est éclairé uniformément par un large faisceau d'électrons à 40-100kV, et l'image est formée directement en focalisant les électrons qui passent plus ou moins non diffusés à travers l'échantillon soit sur un écran fluorescent, soit sur un film photographique.

    3. Ce microscope a une résolution fine de 0,3 nm ou moins mais n'est généralement pas adapté aux spécimens vivants.

    Taper # 11. Microscope électronique à balayage ou MEB :

    1. Il s'agit également d'une forme de microscope électronique dans laquelle un faisceau d'électrons extrêmement fin est produit à 3-30 kV pour balayer une zone sélectionnée ou spécifique de l'échantillon. Il s'agit en fait d'une combinaison de la technologie de la microscopie électronique et de l'électronique de télévision.

    2. L'échantillon à examiner est généralement un objet solide. Les électrons secondaires, qui sont émis depuis ou près de la surface, sont collectés et analysés. Après analyse, ils forment un signal qui module le faisceau d'un tube cathodique (Fig. 151) balayé en synchronisme avec un faisceau secondaire.

    3. Les images, formées dans ce microscope, ressemblent à celles vues dans une loupe. Ils peuvent être agrandis environ 100 000 fois.

    4. Ce microscope est extrêmement utile pour étudier les structures de surface d'échantillons épais, de cellules, de tissus et de membranes.

    5. Étant donné que les électrons de ce microscope forment l'image en étant émis par la surface de l'échantillon, l'image donne un aspect tridimensionnel. Cette image tridimensionnelle est formée par des électrons secondaires qui sont d'abord collectés, amplifiés puis utilisés pour la formation d'images sur l'écran luminophore d'un tube cathodique.

    6. Au moins deux tubes cathodiques sont présents dans ce microscope, dont l'un est utilisé pour l'observation visuelle de l'échantillon et l'autre est utilisé pour la photographie.

    Taper # 12. Microscope électronique à transmission à balayage ou STEM :

    1. Dans le microscope électronique à transmission à balayage ou STEM, l'échantillon est numérisé de la même manière qu'au microscope électronique à balayage ou SEM, mais les électrons transmis sont collectés et utilisés pour la formation d'une image sur l'écran.

    2. Le principal avantage de ce microscope électronique est qu'il est équipé de systèmes de détection. Grâce à cette facilité, il peut détecter séparément les électrons diffusés, les électrons non diffusés, ainsi que les électrons qui s'y trouvent en raison de la combinaison d'électrons diffusés et non diffusés.

    Taper # 13. Microscope de polarisation :

    1. Il s'agit d'un type spécial de microscope optique équipé d'un polariseur et d'un analyseur.

    2. La lumière à polarisation plane est utilisée dans ce microscope pour étudier la présence de constituants orientés préférentiellement, leur forme, la direction de leur orientation et leur indice de réfraction dans les cellules et les tissus.

    3. Le principe de ce microscope est basé sur le comportement de certains composants de la cellule lorsqu'ils sont observés sous lumière polarisée.

    4. Le polariseur et l'analyseur, les deux composants principaux de ce microscope, sont soit constitués d'un prisme nicol ou d'un disque polaroïd. Au-dessus du polariseur est monté le condenseur. L'analyseur est situé au-dessus de l'objectif. Un compensateur ou une plaque de plâtre est également inséré entre le polariseur et l'analyseur.

    5. Ce microscope est également utilisé pour des études quantitatives et qualitatives dans plusieurs disciplines biologiques, notamment la cytologie, l'anatomie, l'histologie et la pathologie.


    4.3 Cellules eucaryotes

    À la fin de cette section, vous serez en mesure d'effectuer les opérations suivantes :

    • Décrire la structure des cellules eucaryotes
    • Comparer les cellules animales avec les cellules végétales
    • Énoncer le rôle de la membrane plasmique
    • Résumer les fonctions des principaux organites cellulaires

    Avez-vous déjà entendu l'expression « la forme suit la fonction ? » C'est une philosophie que de nombreuses industries suivent. En architecture, cela signifie que les bâtiments doivent être construits pour soutenir les activités qui seront menées à l'intérieur de ceux-ci. Par exemple, un gratte-ciel devrait comprendre plusieurs rangées d'ascenseurs. Un hôpital doit avoir sa salle d'urgence facilement accessible.

    Notre monde naturel utilise également le principe de la fonction suivant la forme, en particulier en biologie cellulaire, et cela deviendra clair à mesure que nous explorerons les cellules eucaryotes (Figure 4.8). Contrairement aux cellules procaryotes, les cellules eucaryotes ont : 1) un noyau lié à la membrane 2) de nombreux organites liés à la membrane tels que le réticulum endoplasmique, l'appareil de Golgi, les chloroplastes, les mitochondries et autres et 3) plusieurs chromosomes en forme de bâtonnet. Parce qu'une membrane entoure le noyau de la cellule eucaryote, elle a un "vrai noyau". Le mot « organelle » signifie « petit organe » et, comme nous l'avons déjà mentionné, les organites ont des fonctions cellulaires spécialisées, tout comme les organes de votre corps ont des fonctions spécialisées.

    À ce stade, il devrait être clair pour vous que les cellules eucaryotes ont une structure plus complexe que les cellules procaryotes. Les organites permettent de compartimenter différentes fonctions dans différentes zones de la cellule. Avant de passer aux organites, examinons d'abord deux composants importants de la cellule : la membrane plasmique et le cytoplasme.

    Connexion visuelle

    Si le nucléole n'était pas en mesure de remplir sa fonction, quels autres organites cellulaires seraient affectés ?

    La membrane plasmique

    Comme les procaryotes, les cellules eucaryotes ont une membrane plasmique (figure 4.9), une bicouche phospholipidique avec des protéines incorporées qui sépare le contenu interne de la cellule de son environnement environnant. Un phospholipide est une molécule lipidique avec deux chaînes d'acides gras et un groupe contenant du phosphate. La membrane plasmique contrôle le passage des molécules organiques, des ions, de l'eau et de l'oxygène dans et hors de la cellule. Les déchets (tels que le dioxyde de carbone et l'ammoniac) quittent également la cellule en passant à travers la membrane plasmique.

    Les membranes plasmiques des cellules spécialisées dans l'absorption se replient en projections en forme de doigt que nous appelons microvillosités (singulier = microvillosités) (Figure 4.10). Ces cellules tapissent généralement l'intestin grêle, l'organe qui absorbe les nutriments des aliments digérés. C'est un excellent exemple de fonction de suivi de forme.Les personnes atteintes de la maladie cœliaque ont une réponse immunitaire au gluten, qui est une protéine du blé, de l'orge et du seigle. La réponse immunitaire endommage les microvillosités et, par conséquent, les personnes atteintes ne peuvent pas absorber les nutriments. Cela conduit à la malnutrition, des crampes et de la diarrhée. Les patients souffrant de maladie cœliaque doivent suivre un régime sans gluten.

    Le cytoplasme

    Le cytoplasme est la région entière de la cellule entre la membrane plasmique et l'enveloppe nucléaire (une structure dont nous parlerons bientôt). Il est composé d'organites en suspension dans le cytosol en forme de gel, le cytosquelette et divers produits chimiques (figure 4.8). Même si le cytoplasme se compose de 70 à 80 pour cent d'eau, il a une consistance semi-solide, qui provient des protéines qu'il contient. Cependant, les protéines ne sont pas les seules molécules organiques du cytoplasme. Le glucose et autres sucres simples, les polysaccharides, les acides aminés, les acides nucléiques, les acides gras et les dérivés du glycérol sont également présents. Les ions de sodium, de potassium, de calcium et de nombreux autres éléments se dissolvent également dans le cytoplasme. De nombreuses réactions métaboliques, y compris la synthèse des protéines, ont lieu dans le cytoplasme.

    Le noyau

    Typiquement, le noyau est l'organite le plus important dans une cellule (Figure 4.8). Le noyau (pluriel = noyaux) abrite l'ADN de la cellule et dirige la synthèse des ribosomes et des protéines. Regardons-le plus en détail (Figure 4.11).

    L'enveloppe nucléaire

    L'enveloppe nucléaire est une structure à double membrane qui constitue la partie la plus externe du noyau (figure 4.11). Les membranes interne et externe de l'enveloppe nucléaire sont des bicouches phospholipidiques.

    L'enveloppe nucléaire est ponctuée de pores qui contrôlent le passage des ions, des molécules et de l'ARN entre le nucléoplasme et le cytoplasme. Le nucléoplasme est le fluide semi-solide à l'intérieur du noyau, où se trouvent la chromatine et le nucléole.

    Chromatine et chromosomes

    Pour comprendre la chromatine, il est utile d'explorer d'abord les chromosomes , les structures au sein du noyau qui sont constituées d'ADN, le matériel héréditaire. Vous vous souvenez peut-être que chez les procaryotes, l'ADN est organisé en un seul chromosome circulaire. Chez les eucaryotes, les chromosomes sont des structures linéaires. Chaque espèce eucaryote a un nombre spécifique de chromosomes dans le noyau de chaque cellule. Par exemple, chez l'homme, le nombre de chromosomes est de 46, alors que chez les mouches des fruits, il est de huit. Les chromosomes ne sont visibles et distinguables les uns des autres que lorsque la cellule s'apprête à se diviser. Lorsque la cellule est dans les phases de croissance et d'entretien de son cycle de vie, les protéines s'attachent aux chromosomes et elles ressemblent à un tas de fils enroulés et enchevêtrés. Nous appelons ces complexes protéine-chromosome déroulés la chromatine (Figure 4.12). La chromatine décrit le matériel qui compose les chromosomes à la fois lorsqu'ils sont condensés et décondensés.

    Le Nucléole

    On sait déjà que le noyau dirige la synthèse des ribosomes, mais comment fait-il cela ? Certains chromosomes ont des sections d'ADN qui codent pour l'ARN ribosomique. Une zone de coloration sombre dans le noyau appelée nucléole (pluriel = nucléoles) agrège l'ARN ribosomique avec les protéines associées pour assembler les sous-unités ribosomiques qui sont ensuite transportées à travers les pores de l'enveloppe nucléaire vers le cytoplasme.

    Ribosomes

    Les ribosomes sont les structures cellulaires responsables de la synthèse des protéines. Lorsque nous les regardons au microscope électronique, les ribosomes apparaissent soit sous forme d'amas (polyribosomes) soit sous forme de petits points uniques qui flottent librement dans le cytoplasme. Ils peuvent être attachés au côté cytoplasmique de la membrane plasmique ou au côté cytoplasmique du réticulum endoplasmique et à la membrane externe de l'enveloppe nucléaire (Figure 4.8). La microscopie électronique nous montre que les ribosomes, qui sont de gros complexes de protéines et d'ARN, sont constitués de deux sous-unités, une grande et une petite (figure 4.13). Les ribosomes reçoivent leurs « commandes » pour la synthèse des protéines du noyau où l'ADN se transcrit en ARN messager (ARNm). L'ARNm se déplace vers les ribosomes, qui traduisent le code fourni par la séquence des bases azotées de l'ARNm en un ordre spécifique d'acides aminés dans une protéine. Les acides aminés sont les éléments constitutifs des protéines.

    Parce que la synthèse des protéines est une fonction essentielle de toutes les cellules (y compris les enzymes, les hormones, les anticorps, les pigments, les composants structurels et les récepteurs de surface), il y a des ribosomes dans pratiquement chaque cellule. Les ribosomes sont particulièrement abondants dans les cellules qui synthétisent de grandes quantités de protéines. Par exemple, le pancréas est responsable de la création de plusieurs enzymes digestives et les cellules qui produisent ces enzymes contiennent de nombreux ribosomes. Ainsi, nous voyons un autre exemple de fonction suivant la forme.

    Mitochondries

    Les scientifiques appellent souvent les mitochondries (singulier = mitochondrie) « centrales électriques » ou « usines d'énergie » des cellules végétales et animales, car elles sont responsables de la fabrication de l'adénosine triphosphate (ATP), la principale molécule porteuse d'énergie de la cellule. L'ATP représente l'énergie stockée à court terme par la cellule. La respiration cellulaire est le processus de fabrication de l'ATP en utilisant l'énergie chimique du glucose et d'autres nutriments. Dans les mitochondries, ce processus utilise de l'oxygène et produit du dioxyde de carbone comme déchet. En fait, le dioxyde de carbone que vous expirez à chaque respiration provient des réactions cellulaires qui produisent du dioxyde de carbone comme sous-produit.

    En accord avec notre thème de la forme suivant la fonction, il est important de souligner que les cellules musculaires ont une très forte concentration de mitochondries qui produisent de l'ATP. Vos cellules musculaires ont besoin d'une énergie considérable pour maintenir votre corps en mouvement. Lorsque vos cellules ne reçoivent pas assez d'oxygène, elles ne produisent pas beaucoup d'ATP. Au lieu de cela, la production d'acide lactique accompagne la petite quantité d'ATP qu'ils produisent en l'absence d'oxygène.

    Les mitochondries sont des organites à double membrane de forme ovale (figure 4.14) qui ont leurs propres ribosomes et ADN. Chaque membrane est une bicouche phospholipidique enrobée de protéines. La couche interne a des plis appelés crêtes. Nous appelons la zone entourée par les plis la matrice mitochondriale. Les crêtes et la matrice ont des rôles différents dans la respiration cellulaire.

    Peroxysomes

    Les peroxysomes sont de petits organites ronds entourés de membranes simples. Ils effectuent des réactions d'oxydation qui décomposent les acides gras et les acides aminés. Ils détoxifient également de nombreux poisons qui peuvent pénétrer dans le corps. (Beaucoup de ces réactions d'oxydation libèrent du peroxyde d'hydrogène, H2O2, ce qui serait dommageable pour les cellules cependant, lorsque ces réactions sont confinées aux peroxysomes, les enzymes décomposent en toute sécurité le H2O2 dans l'oxygène et l'eau.) Par exemple, les peroxysomes dans les cellules du foie détoxifient l'alcool. Les glyoxysomes, qui sont des peroxysomes spécialisés dans les plantes, sont responsables de la conversion des graisses stockées en sucres. Les cellules végétales contiennent de nombreux types différents de peroxysomes qui jouent un rôle dans le métabolisme, la défense contre les agents pathogènes et la réponse au stress, pour n'en citer que quelques-uns.

    Vésicules et vacuoles

    Les vésicules et les vacuoles sont des sacs liés à la membrane qui fonctionnent dans le stockage et le transport. Outre le fait que les vacuoles sont un peu plus grosses que les vésicules, il existe une distinction très subtile entre elles. Les membranes vésiculaires peuvent fusionner avec la membrane plasmique ou d'autres systèmes membranaires à l'intérieur de la cellule. De plus, certains agents tels que les enzymes dans les vacuoles végétales décomposent les macromolécules. La membrane de la vacuole ne fusionne pas avec les membranes des autres composants cellulaires.

    Cellules animales versus cellules végétales

    À ce stade, vous savez que chaque cellule eucaryote a une membrane plasmique, un cytoplasme, un noyau, des ribosomes, des mitochondries, des peroxysomes et, dans certaines, des vacuoles, mais il existe des différences frappantes entre les cellules animales et végétales. Alors que les cellules animales et végétales ont des centres d'organisation des microtubules (MTOC), les cellules animales ont également des centrioles associés au MTOC : un complexe que nous appelons le centrosome. Les cellules animales ont chacune un centrosome et des lysosomes alors que la plupart des cellules végétales n'en ont pas. Les cellules végétales ont une paroi cellulaire, des chloroplastes et d'autres plastes spécialisés, ainsi qu'une grande vacuole centrale, contrairement aux cellules animales.

    Le Centrosome

    Le centrosome est un centre d'organisation des microtubules situé près des noyaux des cellules animales. Il contient une paire de centrioles, deux structures perpendiculaires l'une à l'autre (figure 4.15). Chaque centriole est un cylindre de neuf triplets de microtubules.

    Le centrosome (l'organite d'où proviennent tous les microtubules) se réplique avant qu'une cellule ne se divise, et les centrioles semblent jouer un rôle en tirant les chromosomes dupliqués vers les extrémités opposées de la cellule en division. Cependant, la fonction exacte du centriole dans la division cellulaire n'est pas claire, car les cellules dont le centrosome a été retiré peuvent toujours se diviser et les cellules végétales, qui manquent de centrosomes, sont capables de division cellulaire.

    Lysosomes

    Les cellules animales ont un autre ensemble d'organites que la plupart des cellules végétales n'ont pas : les lysosomes. Les lysosomes sont l'« élimination des déchets » de la cellule. Dans les cellules végétales, les processus digestifs se déroulent dans les vacuoles. Les enzymes des lysosomes aident à décomposer les protéines, les polysaccharides, les lipides, les acides nucléiques et même les organites usés. Ces enzymes sont actives à un pH beaucoup plus bas que celui du cytoplasme. Par conséquent, le pH dans les lysosomes est plus acide que le pH du cytoplasme. De nombreuses réactions qui ont lieu dans le cytoplasme ne pourraient pas se produire à un pH bas, donc encore une fois, l'avantage de compartimenter la cellule eucaryote en organites est évident.

    La paroi cellulaire

    Si vous examinez la figure 4.8, le diagramme des cellules végétales, vous verrez une structure externe à la membrane plasmique. Il s'agit de la paroi cellulaire, un revêtement rigide qui protège la cellule, fournit un support structurel et donne forme à la cellule. Les cellules fongiques et certaines cellules protistes ont également des parois cellulaires. Alors que le principal composant des parois cellulaires procaryotes est le peptidoglycane, la principale molécule organique de la paroi cellulaire de la plante (et de certains protistes) est la cellulose (figure 4.16), un polysaccharide composé d'unités de glucose. Avez-vous déjà remarqué que lorsque vous mordez dans un légume cru, comme le céleri, il craque ? C'est parce que vous déchirez les parois cellulaires rigides des cellules de céleri avec vos dents.

    Chloroplastes

    Comme les mitochondries, les chloroplastes ont leur propre ADN et ribosomes, mais les chloroplastes ont une fonction totalement différente. Les chloroplastes sont des organites de cellules végétales qui effectuent la photosynthèse. La photosynthèse est la série de réactions qui utilisent le dioxyde de carbone, l'eau et l'énergie lumineuse pour produire du glucose et de l'oxygène. C'est une différence majeure entre les plantes et les animaux. Les plantes (autotrophes) sont capables de fabriquer leur propre nourriture, comme les sucres utilisés dans la respiration cellulaire pour fournir l'énergie ATP générée dans les mitochondries des plantes. Les animaux (hétérotrophes) doivent ingérer leur nourriture.

    Comme les mitochondries, les chloroplastes ont des membranes externe et interne, mais dans l'espace délimité par la membrane interne d'un chloroplaste se trouve un ensemble de sacs membranaires remplis de fluide interconnectés et empilés que nous appelons thylakoïdes (Figure 4.17). Chaque pile de thylakoïdes est un granum (pluriel = grana). Nous appelons le fluide enfermé par la membrane interne qui entoure le grana le stroma.

    Les chloroplastes contiennent un pigment vert, la chlorophylle, qui capte l'énergie lumineuse qui entraîne les réactions de la photosynthèse. Comme les cellules végétales, les protistes photosynthétiques ont également des chloroplastes. Certaines bactéries effectuent la photosynthèse, mais leur chlorophylle n'est pas reléguée à un organite.

    Connexion Évolution

    Endosymbiose

    Nous avons mentionné que les mitochondries et les chloroplastes contiennent de l'ADN et des ribosomes. Vous êtes-vous demandé pourquoi ? Des preuves solides indiquent l'endosymbiose comme explication.

    La symbiose est une relation dans laquelle les organismes de deux espèces distinctes dépendent les uns des autres pour leur survie. L'endosymbiose (endo- = « à l'intérieur ») est une relation mutuellement bénéfique dans laquelle un organisme vit à l'intérieur de l'autre. Les relations endosymbiotiques abondent dans la nature. Nous avons déjà mentionné que les microbes qui produisent de la vitamine K vivent à l'intérieur de l'intestin humain. Cette relation est bénéfique pour nous car nous sommes incapables de synthétiser la vitamine K. Elle est également bénéfique pour les microbes car ils sont protégés des autres organismes et du dessèchement, et ils reçoivent une nourriture abondante de l'environnement du gros intestin.

    Les scientifiques ont remarqué depuis longtemps que les bactéries, les mitochondries et les chloroplastes sont de taille similaire. Nous savons également que les bactéries ont de l'ADN et des ribosomes, tout comme les mitochondries et les chloroplastes. Les scientifiques pensent que les cellules hôtes et les bactéries ont formé une relation endosymbiotique lorsque les cellules hôtes ont ingéré à la fois des bactéries aérobies et autotrophes (cyanobactéries) mais ne les ont pas détruites. Au cours de plusieurs millions d'années d'évolution, ces bactéries ingérées se sont spécialisées dans leurs fonctions, les bactéries aérobies devenant des mitochondries et les bactéries autotrophes devenant des chloroplastes.

    La vacuole centrale

    Auparavant, nous avons mentionné les vacuoles comme des composants essentiels des cellules végétales. Si vous regardez la figure 4.8b, vous verrez que les cellules végétales ont chacune une grande vacuole centrale qui occupe la majeure partie de la surface de la cellule. La vacuole centrale joue un rôle clé dans la régulation de la concentration en eau de la cellule dans des conditions environnementales changeantes. Avez-vous déjà remarqué que si vous oubliez d'arroser une plante pendant quelques jours, elle se fane ? En effet, lorsque la concentration en eau dans le sol devient inférieure à la concentration en eau dans la plante, l'eau sort des vacuoles centrales et du cytoplasme. Au fur et à mesure que la vacuole centrale rétrécit, elle laisse la paroi cellulaire sans support. Cette perte de support des parois cellulaires de la plante se traduit par un aspect flétri.

    La vacuole centrale soutient également l'expansion de la cellule. Lorsque la vacuole centrale contient plus d'eau, la cellule devient plus grande sans avoir à investir une énergie considérable dans la synthèse d'un nouveau cytoplasme.


    Godfrey Hounsfield et Allan Cormack développent le scanner de tomographie axiale informatisée (CAT). À l'aide d'un ordinateur, l'appareil combine de nombreuses images radiographiques pour générer des vues en coupe ainsi que des images tridimensionnelles d'organes et de structures internes.

    John Venables et CJ Harland observent des motifs de rétrodiffusion d'électrons (EBSP) au microscope électronique à balayage. EBSP fournit des informations microstructurales quantitatives sur la nature cristallographique des métaux, des minéraux, des semi-conducteurs et des céramiques.


    Présentation de la discussion

    Cette conférence présente la microscopie à deux photons qui utilise des lasers pulsés intenses pour imager en profondeur des échantillons biologiques. Il peut être utilisé pour l'imagerie d'échantillons de tissus épais ou même pour l'imagerie à l'intérieur d'animaux vivants.

    Des questions

    1. Expliquez pourquoi seule la lumière rouge est émise à travers la peau fine lorsqu'une lampe de poche est allumée dessus.
    2. Qu'est-ce que le nettoyage et à quoi sert-il ?
    3. Quels sont les avantages d'utiliser deux photons infrarouges au lieu d'un photon bleu en microscopie à deux photons pour exciter une molécule émettant de la lumière verte ?
    4. Pourquoi la microscopie à deux photons ne nécessite-t-elle pas de trou d'épingle (sélectionnez tout ce qui s'applique) ?
      1. Parce que la lumière émise en microscopie à deux photons ne se diffuse pas
      2. Parce qu'il n'y a pas de lumière floue en microscopie à deux photons
      3. Parce que la microscopie à deux photons donne lieu à une excitation localisée
      4. Aucune de ces réponses
      1. L'image détectée comprendrait moins de signal de fond
      2. L'image détectée serait plus faible
      3. Aucune de ces réponses

      Réponses

      1. Parce que les matériaux biologiques absorbent la lumière dans la plupart des longueurs d'onde, sauf dans la couleur rouge. Par conséquent, plus de lumière rouge est laissée à travers la peau que les autres longueurs d'onde
      2. La compensation supprime la diffusion des échantillons biologiques. Les utilisations de la solution varient et incluent l'amélioration de l'imagerie « en profondeur » dans des échantillons fixes épais. Les solutions de clarification sont soit des solvants organiques, des détergents ou de l'urée.
      3. L'utilisation de deux photons au lieu d'un augmentera la profondeur de pénétration Étant donné que les molécules biologiques n'absorbent généralement pas la lumière dans le spectre rouge, l'utilisation de photons rouges pour exciter les marqueurs fluorescents peut diminuer l'arrière-plan de l'image De plus, deux photons rouges utilisés simultanément peuvent exciter un marqueur fluorescent qui est généralement excité dans la longueur d'onde bleue (en microscopie à un photon). Ceci augmente la gamme de marqueurs fluorescents utilisables en coupes épaisses Enfin, la microscopie à deux photons impliquant une excitation localisée, elle n'implique pas de trous d'épingle.
      4. B et C
        1. Incorrect : La lumière émise en microscopie à deux photons se diffuse, mais cela n'a pas d'importance. Comme un seul point émet de la lumière (le foyer du faisceau lumineux), l'émission totale est mesurée.
        2. Correct : Étant donné qu'il n'y a pas de lumière floue en microscopie à deux photons, le trou d'épingle n'est pas requis en microscopie à deux photons.
        3. Correct : La microscopie à deux photons donne lieu à une excitation localisée, ce qui signifie que seul le point focal reçoit suffisamment de lumière (provenant de deux photons) pour être excité et émettre de la lumière. Par conséquent, les photons d'excitation ne peuvent pas produire suffisamment de lumière pour exciter les marqueurs, ce qui signifie qu'il n'y a pas de lumière de fond à filtrer à travers un trou d'épingle.
        1. Incorrect : L'image détectée inclurait moins de signal d'arrière-plan. Il n'y a pas de signal de fond en microscopie à deux photons
        2. Correct : L'image détectée serait plus sombre. Étant donné que la lumière totale émise est mesurée en microscopie à deux photons, et parce que le trou d'épingle filtrerait une partie importante de cette lumière émise, la lumière serait perdue si le trou d'épingle était maintenu allumé.)

        Configuration et alignement du microscope DIC

        Contraste interférentiel différentiel (CID) les composants optiques peuvent être installés sur pratiquement n'importe quel microscope à fond clair transmis, réfléchi ou inversé, à condition que l'instrument soit capable d'accepter des filtres polarisants et les prismes condenseurs et objectifs spécialement conçus (avec les boîtiers) nécessaires pour effectuer la technique.

        Tous les principaux fabricants de microscopes produisent des accessoires DIC pour leurs microscopes de recherche, et ceux-ci sont souvent regroupés sous forme de kits assortis contenant tout le matériel et les composants optiques requis. Dans la configuration standard, un microscope à contraste interférentiel différentiel (voir Figure 1) contient les éléments polarisants généralement rencontrés sur un microscope à lumière polarisée et, en plus, deux prismes composés biréfringents spécialement construits. Appelé Wollaston ou Nomarski prismes, ces séparateurs de faisceaux optiques (et combineurs de faisceaux) sont positionnés pour projeter des motifs d'interférence de fronts d'onde cisaillés dans le plan focal avant du condenseur et le plan focal arrière de l'objectif.

        La figure 1 présente la configuration de train optique typique pour un microscope à contraste d'interférence différentielle transmise. Les fronts d'onde semi-cohérents émis par des voisinages localisés dans le filament de la lampe traversent un polariseur linéaire positionné entre le port de lumière dans la base du microscope et l'assemblage du condenseur. Un prisme composé de Nomarski ou de Wollaston est situé dans ou près de l'ouverture du condenseur (plan focal avant) et sert à aligner et à cisailler les fronts d'onde polarisés incidents en deux composantes orthogonales. Les fronts d'onde perpendiculaires et cisaillés sont focalisés par le système de lentilles du condenseur en faisceaux parallèles qui traversent le plan de l'échantillon et répondent aux gradients d'indice de réfraction et d'épaisseur par déformation en fonction des paramètres de longueur de chemin optique de l'échantillon.

        Les ondes lumineuses recueillies par l'objectif convergent au niveau du plan focal arrière où se trouve un deuxième prisme de Nomarski.Le prisme de Nomarski de l'objectif recombine les fronts d'onde cisaillés et déformés en une lumière linéaire et polarisée elliptiquement qui fait ensuite passer un composant à travers l'analyseur (un deuxième polariseur orienté perpendiculairement au polariseur de sous-étage) situé dans un tube intermédiaire au-dessus de l'objectif. Enfin, les composants de lumière polarisée linéaire qui émergent de l'analyseur se recombinent par interférence constructive et destructive au niveau du plan image dans le diaphragme de l'oculaire (ou l'objectif de projection de la caméra).

        Éléments polarisants pour la microscopie DIC

        Les polariseurs utilisés en microscopie DIC sont similaires ou identiques à ceux utilisés pour les observations en lumière polarisée, mais de nombreux fabricants proposent des filtres polarisants DIC assortis qui ont à la fois des efficacités de transmission de la lumière faibles et élevées. À l'extrémité supérieure de la plage de grossissement (40x, 60x et 100x), les polariseurs à haute efficacité de transmission sont préférés pour la DIC, car les détails de l'échantillon sont plus clairement délimités et des valeurs de retard de polarisation plus importantes peuvent être utilisées pour l'imagerie vidéo et numérique. Les filtres polarisants à faible transmission sont utiles pour l'observation DIC en utilisant les objectifs 10x et 20x, mais restreignent considérablement la transmission de la lumière à des grossissements plus élevés.

        Sur la plupart des microscopes, le polariseur est monté directement sur le port de lumière à la base de l'instrument ou dans un porte-filtre fixé sous le condenseur. Les polariseurs conçus pour couvrir le port de lumière sont généralement montés dans un ensemble rotatif qui permet au microscopiste de faire pivoter le filtre selon un angle de 90 à 180 degrés (voir la figure 2(a)). Une fois que le polariseur rotatif est positionné à l'azimut de transmission souhaité, il peut être fixé en place avec une vis de verrouillage. Par convention, le polariseur est orienté avec l'axe de transmission des vibrations positionné dans une direction Est-Ouest (de gauche à droite lorsqu'on se tient devant le microscope). Les microscopes dont le polariseur est fixé au support de montage du condenseur de sous-étage sont fournis avec un boîtier qui peut ou non permettre la rotation du polariseur (figures 2(b) et 2(c)). Les polariseurs à géométrie circulaire s'insèrent dans un support dans la platine et peuvent pivoter par incréments fixes de 45 degrés avec une détente. D'autres polariseurs sont montés dans des cadres rectangulaires qui glissent dans une fente du support du condenseur (figures 2(b) et 2(c)), et contiennent souvent des molettes qui permettent une rotation de 180 à 360 degrés.

        Les analyseurs sont placés entre le prisme de l'objectif Nomarski et les tubes d'observation oculaire dans des microscopes équipés pour l'observation DIC, de la même manière que l'emplacement de ces composants dans les microscopes à lumière polarisée. L'analyseur est également un polariseur linéaire qui est positionné avec l'azimut de transmission orienté à un angle de 90 degrés par rapport à celui du polariseur. Par convention, la direction de vibration de l'analyseur est Nord-Sud, ce qui coïncide avec l'orientation Est-Ouest prescrite pour le polariseur.

        La configuration de montage du microscope pour les analyseurs est tout aussi variée que pour les polariseurs, et ces composants sont généralement insérés dans le train optique à travers un certain nombre d'emplacements. Dans certains microscopes, l'analyseur est fixé dans un cadre rectangulaire (figure 2(e)) et inséré dans une fente de l'embout nasal, du tube intermédiaire ou de l'illuminateur vertical. D'autres conceptions d'analyseurs présentent le même style de cadre, mais permettent la rotation de l'élément d'analyseur avec une molette qui est souvent graduée par incréments de 10, 45 ou 90 degrés (Figure 2(f)). Les microscopes à lumière polarisée équipés pour l'observation DIC logent souvent l'analyseur dans un tube intermédiaire (voir Figure 2(d)) situé entre l'objectif et les tubes d'observation. Ces unités sont souvent conçues pour des mesures de précision en lumière polarisée et comportent des échelles de vernier graduées à 360 degrés enroulées autour de la circonférence, avec un mécanisme de verrouillage pour fixer l'analyseur dans l'azimut de transmission souhaité. De plus, l'analyseur est généralement monté sur un curseur de manière à pouvoir être facilement retiré du chemin lumineux pour une observation en polarisation linéaire ou en fond clair. Les tubes intermédiaires pour la microscopie en lumière polarisée contiennent également un 20 × 6 millimètre VACARME fente standard pour un compensateur quart d'onde, pleine onde ou de Sénarmont (Figure 2(d) et Figure 5).

        Les microscopes modernes positionnent le polariseur et l'analyseur à des emplacements stratégiques par rapport à la lentille de champ, au condenseur, à l'objectif et aux tubes d'observation. Dans les microscopes plus anciens, ces éléments polarisants peuvent être installés dans une grande variété d'emplacements. Il convient toutefois de noter que placer des éléments polarisants dans ou très près d'un plan d'image conjugué (diaphragme de champ, platine d'échantillon ou ouverture fixe de l'oculaire) n'est pas une bonne idée, car les rayures, les imperfections, la saleté et les débris sur le verre la surface peut être imagée avec l'échantillon.

        Condenseur et prismes objectifs

        Les prismes de condenseur DIC, qui agissent comme des séparateurs de faisceau pour produire un cisaillement angulaire aux fronts d'onde de lumière polarisée entrante, sont souvent montés dans un condenseur à tourelle rotative conçu pour abriter au moins trois prismes individuels, comme illustré à la Figure 3. Les spécifications et les configurations de la tourelle varient selon le fabricant, mais ils contiennent généralement des fentes pour quatre à huit composants auxiliaires, y compris des prismes de Wollaston ou de Nomarski, des anneaux annulaires à contraste de phase ou des arrêts de lumière en fond noir. La tourelle du condenseur illustrée à la figure 3 contient sept ouvertures, dont trois sont remplies d'anneaux à contraste de phase et trois de prismes DIC. La fente ouverte est utilisée pour l'observation en fond clair.

        Chaque prisme DIC de condenseur (également appelé compensateurs ou auxiliaire prismes) doit être spécifiquement adapté à une plage étroite d'ouvertures numériques d'objectifs, de sorte qu'un prisme particulier ne peut fonctionner que pour un ou deux objectifs (par exemple, le 10x et le 20x). En conséquence, entre trois et cinq prismes de condenseur doivent être utilisés pour correspondre à toute la plage de grossissement de l'objectif entre 10x et 100x. Certains fabricants adaptent chaque prisme de condenseur à un objectif particulier, nécessitant ainsi jusqu'à sept prismes de condenseur pour couvrir tout le spectre des objectifs à sec et à immersion dans l'huile ayant des ouvertures numériques variées.

        Les inserts de prisme DIC du condenseur sont construits avec des plaques d'aluminium circulaires anodisées ayant le prisme combiné (généralement de forme circulaire) fixé dans une orientation précise avec du ciment optique. Les coins de prisme DIC sont très fins et coupés avec des tolérances étroites pour garantir que les valeurs de cisaillement angulaire correspondent à celles requises par l'ouverture numérique de l'objectif. Les plaques polies doivent être manipulées avec soin pour éviter la contamination par les empreintes digitales, l'huile, la saleté et les débris. Chaque cadre de prisme contient une fente ou une broche qui s'accouple à un partenaire correspondant dans la tourelle du condenseur afin de définir et de sécuriser l'alignement du prisme du condenseur par rapport au prisme objectif et aux axes du polariseur (et de l'analyseur).

        Placé entre l'objectif et l'analyseur se trouve un deuxième prisme composé de Nomarski qui agit pour recombiner les fronts d'onde cisaillés par le prisme du condenseur (Figures 1, 4 et 5). Ce prisme, souvent appelé le objectif ou principal Le prisme DIC peut être soit adapté à un prisme condenseur spécifique, soit un seul prisme objectif peut servir à recombiner des fronts d'onde ayant le spectre d'angles de cisaillement représenté par tous les prismes condenseurs. La majorité des fabricants de microscopes configurent leurs microscopes DIC pour utiliser un prisme Nomarski à objectif unique, qui est monté dans un cadre rectangulaire qui glisse dans le nez (voir Figure 4). Afin d'introduire un retard de polarisation dans le système optique DIC, le prisme objectif repose sur un support de glissement qui peut être déplacé d'avant en arrière sur l'axe optique du microscope au moyen d'un bouton de commande micrométrique.

        Les prismes objectifs DIC conçus pour introduire un retard de polarisation par translation à travers l'axe optique du microscope sont fabriqués dans une forme rectangulaire avec le grand axe correspondant à la direction du cisaillement du prisme (figure 4 (b)). Dans un microscope DIC correctement aligné, le prisme du condenseur est imagé sur le prisme de l'objectif par l'action combinée des systèmes de lentilles de condenseur et d'objectif. En conséquence, le cisaillement du front d'onde produit par le prisme du condenseur correspond exactement à chaque point le long de la surface des deux prismes (qui sont inversés l'un par rapport à l'autre). La translation de l'un ou l'autre des prismes le long de l'axe de cisaillement produit un décalage de front d'onde (retard de polarisation), qui, à son tour, introduit une différence de chemin optique uniforme à travers l'ouverture du microscope. La translation du prisme objectif avec le contrôle micrométrique est le mécanisme le plus populaire pour produire un retard de polarisation dans les microscopes DIC.

        Plusieurs conceptions de curseur de prisme d'objectif de divers fabricants sont illustrées sur la figure 4. Tous les prismes composés sont logés dans des cadres rectangulaires avec un bouton de commande de translation positionné à l'extrémité du cadre. Le bouton de commande est utilisé pour décaler latéralement la position du prisme le long de l'axe de cisaillement (Figure 4 (b)) afin d'introduire un retard de polarisation (ou une différence nette de chemin optique de front d'onde), dans le train optique de contraste d'interférence différentielle. Les curseurs de prisme Nomarski conçus pour la microscopie DIC en lumière réfléchie contiennent également un deuxième bouton de commande (Figure 4 (c) et 4 (d)) qui permet de régler la hauteur du prisme pour correspondre aux différentes positions du plan focal arrière sur toute la plage de grossissement de l'objectif et d'ouverture numérique. . Lorsque le microscope est utilisé dans un autre mode d'imagerie, le cadre du prisme objectif peut être facilement retiré du chemin optique en faisant glisser le cadre entier sans le retirer de la tourelle ou du boîtier du tube intermédiaire.

        Dans les microscopes DIC conçus pour introduire un retard de polarisation à l'aide d'un compensateur de Sénarmont, les prismes de l'objectif Nomarski sont fixés avec des montures fixes qui glissent dans la tourelle au-dessus des objectifs (Figure 5 (c)). Les microscopes utilisant des compensateurs de Sénarmont nécessitent un prisme d'objectif séparé pour chaque objectif, mais peuvent souvent utiliser le même prisme de Nomarski de condenseur pour deux ou plusieurs objectifs. Les montures de prisme à objectif fixe (Figure 5 (c)) sont facilement retirées du chemin lumineux en faisant glisser le cadre loin de l'embout du microscope.

        Une configuration typique de polariseur et de plaque à retard quart d'onde pour le contraste d'interférence différentielle de Sénarmont est illustrée à la figure 5(a). Cette unité est montée sur le bouton de réglage du diaphragme de champ sur la base du microscope et, après alignement de l'axe optique de la plaque de retard et de l'azimut de transmission du polariseur, fixée au bouton avec une vis de blocage. L'axe du polariseur est marqué sur la face avant du compensateur de Sénarmont et des règles graduées permettent à l'opérateur de déterminer qualitativement la quantité approximative de retard de polarisation introduit dans le système lorsque le polariseur est tourné. Le bouton de verrouillage peut être utilisé pour maintenir le polariseur immobile par rapport à la lame quart d'onde. Pour l'observation en fond clair ou les techniques de contraste amélioré sans DIC, l'ensemble du polariseur et de la plaque de retard peut être retiré du chemin optique en faisant pivoter la partie supérieure articulée.

        Une technique alternative pour la compensation DIC de Sénarmont consiste à placer la lame compensatrice quart d'onde dans le train optique entre le prisme de Nomarski objectif et l'analyseur. Dans ce cas, soit un polariseur linéaire standard est utilisé sous les prismes du condenseur, soit le compensateur de Sénarmont illustré sur la figure 5(a) est réglé avec l'axe du polariseur parallèle à l'axe rapide de la plaque de retard (seule la lumière polarisée linéaire sort du compensateur) et perpendiculaire à l'analyseur. Un tube intermédiaire conçu pour introduire la compensation DIC de Sénarmont après le prisme objectif est illustré sur la figure 5(b). Dans ce cas, un retard de polarisation est introduit dans le système optique en faisant tourner l'analyseur, plutôt que le polariseur.

        Equipé d'une lentille de Bertrand pour l'observation du plan focal arrière de l'objectif, le tube intermédiaire présenté sur la figure 5(b) possède également une fente au standard DIN capable d'accueillir diverses plaques de retardement, dont un compensateur de Sénarmont (représenté sur la figure). L'analyseur peut être tourné par un mécanisme de vernier gradué de précision, qui permet à l'opérateur de déterminer quantitativement le niveau de retard de polarisation introduit dans le système optique DIC. Avec les compensateurs de Sénarmont, des valeurs de retard de polarisation comprises entre un vingtième et une longueur d'onde complète peuvent être facilement mesurées avec une précision de 0,15 nanomètre. De plus, la lentille de Bertrand peut être commodément insérée dans le trajet lumineux au moyen d'une molette afin d'observer les événements se produisant au niveau du plan focal arrière de l'objectif. L'utilisation d'une lentille de Bertrand ou d'un télescope de phase pour surveiller le plan focal de l'objectif est essentielle à l'alignement du microscope DIC, comme indiqué ci-dessous.

        En microscopie DIC, le contraste est fonction de l'orientation de l'échantillon, et la grande variété de géométries rencontrées nécessite souvent le repositionnement de l'échantillon pour maximiser les effets de contraste pour l'observation des structures cibles. L'utilisation de platines mécaniques rectangulaires standard pour observer l'échantillon DIC est entravée par la plage limitée de mouvement de rotation présentée par ces composants, bien que le X-oui Le mécanisme de traduction facilite l'examen minutieux de l'intégralité du contenu d'une lame de microscope. Afin de permettre aux échantillons d'être facilement tournés et manipulés pour présenter le contraste azimutal optimal, une étape de rotation circulaire similaire à celle illustrée sur la figure 6 (a) est recommandée pour la microscopie DIC. La platine circulaire permet une rotation à 360 degrés de l'échantillon, ce qui est souvent nécessaire avec des échantillons linéaires étendus (tels que des diatomées ou des structures filamenteuses) qui présentent des effets de contraste azimutaux extrêmes en DIC. La traduction de l'échantillon pendant l'observation est facilitée par l'utilisation d'un accessoire de platine mécanique gradué (figure 6 (b)) qui se fixe directement à la platine circulaire et serre solidement une lame de microscope. La platine doit être centrée le long de l'axe optique du microscope, soit en ajustant la position de la platine elle-même, soit en centrant les objectifs et le condenseur par rapport à la platine.

        Les objectifs conçus pour le contraste interférentiel différentiel doivent être exempts de contraintes ou d'occlusions biréfringentes qui dépolarisent la lumière et entraînent une dégradation de l'image. Dans le passé, les microscopistes étaient limités aux objectifs achromatiques et fluorine sans contrainte destinés aux observations en lumière polarisée, mais les objectifs modernes ayant des facteurs de correction plus élevés peuvent désormais être utilisés pour la microscopie DIC. Appelé universel objectifs, ces systèmes de lentilles avancés peuvent souvent être utilisés pour la microscopie combinée DIC, fluorescence, contraste de phase et fond clair sans avoir à changer d'objectif. De plus, de nouveaux objectifs apochromatiques ont été conçus et sont suffisamment exempts de contraintes pour permettre leur utilisation dans l'observation de la lumière polarisée et des contrastes interférentiels différentiels, améliorant considérablement la qualité et la résolution de l'image à des grossissements plus élevés.

        Alignement du microscope à contraste d'interférence différentielle

        Avant d'essayer de configurer un microscope pour l'observation en contraste d'interférence différentiel, inspectez l'instrument pour vérifier si tous les composants nécessaires sont présents et exempts de peluches, de poussière et de débris. Les éléments de lentilles d'objectif et de condenseur qui contiennent des signatures de contrainte peuvent dégrader les images dans le DIC, tout comme les surfaces de lentilles sales, les rayures et les matières étrangères contaminantes dans le chemin optique. Un bon alignement du microscope est essentiel pour obtenir des résultats optimaux et produire des images qui affichent des effets pseudo-tridimensionnels et d'ombre portée. La plupart des étapes décrites dans la procédure suivante ne sont nécessaires que lors du premier alignement du microscope pour la CIVD et ne nécessitent pas de répétition pour les observations quotidiennes. D'autres mesures doivent être prises chaque fois que le microscope est utilisé pour des investigations DIC.

        Inspection préliminaire au microscope - Examinez soigneusement le microscope pour vous assurer que tous les composants DIC nécessaires sont installés ou disponibles et prêts à l'emploi si nécessaire. Retirez le condenseur, démontez la tourelle et inspectez l'état des prismes Nomarski ou Wollaston. Les surfaces de ces prismes composés doivent être propres et exemptes de poussière et de débris. Parce qu'ils sont logés dans la tourelle du condenseur, les prismes du condenseur DIC sont rarement contaminés par des empreintes digitales, mais la poussière et les peluches peuvent facilement s'écouler dans la tourelle et atterrir sur l'une des surfaces de quartz plates. Pour nettoyer une surface de prisme contaminée, utilisez un ballon en caoutchouc pour éliminer les fibres détachées et la poussière, et/ou essuyez délicatement la surface avec un chiffon pour lentille ou un coton doux et humide. Attention à ne pas rayer les surfaces. Le même traitement doit être accordé au(x) prisme(s), au condenseur et aux lentilles externes de l'objectif, aux lentilles d'oculaire de microscope et à la lentille de champ au niveau de l'orifice du diaphragme de champ à la base du microscope (ou fixé au pilier d'un microscope inversé ). Après vous être assuré que les composants critiques sont propres, réassemblez le microscope, installez le polariseur et l'analyseur, puis alignez le système optique pour l'éclairage de Köhler.

        Installer le polariseur et l'analyseur - Le microscope étant démonté (condenseur, prismes DIC et au moins un objectif retirés), installez le polariseur et l'analyseur dans leurs positions respectives sous le condenseur et au-dessus de l'objectif. D'une manière similaire à la microscopie à lumière polarisée, le polariseur et l'analyseur sont positionnés de sorte que leurs azimuts de transmission soient croisés à un angle de 90 degrés (perpendiculaires) l'un par rapport à l'autre. Le polariseur, qui est monté entre la source lumineuse et le condenseur, est traditionnellement orienté dans une direction Est-Ouest, ou de gauche à droite face au microscope. Dans certains cas, les positions du polariseur et de l'analyseur sont prédéterminées par leur position fixe dans les cadres de montage, et ces composants ne peuvent être insérés dans la voie optique du microscope qu'avec une seule orientation. Habituellement, un marqueur sur la monture du polariseur indique la direction de transmission, mais certains microscopes sont équipés d'une monture de polariseur rotative graduée en degrés (Figure 2). L'analyseur peut également être rotatif avec un bouton gradué, et/ou peut contenir une marque indiquant l'axe de transmission.

        Lorsque le polariseur et l'analyseur sont croisés (axes de transmission orientés à un angle de 90 degrés), le champ de vision apparaît très sombre lorsqu'il est observé à travers les oculaires. Cette condition est appelée extinction maximale. Si une quantité importante de lumière traverse le microscope et que le champ de vision n'est pas sombre (ou presque noir), vérifiez que le polariseur et l'analyseur sont croisés. Après avoir croisé les polariseurs, insérez le condenseur et l'objectif, mais n'installez pas le curseur de prisme Nomarski (ou la monture fixe). Faites pivoter la tourelle du condenseur en position fond clair (la fente n'a pas de plaque de phase ou de prisme DIC). Le champ de vision doit rester sombre, mais si l'un de ces composants (le condenseur ou l'objectif) contient des lentilles tendues, une partie de la lumière peut passer à travers. Retirez l'un des éléments polarisants du train optique (soit le polariseur, soit l'analyseur) avant de passer à l'étape suivante.

        Établir l'éclairage Köhler - Avant de procéder à la configuration DIC (après l'installation des polariseurs), le système optique du microscope doit être aligné pour l'observation des échantillons en fond clair à l'aide de la technique standard de Köhler. Lorsqu'elle est correctement configurée, une image de la source lumineuse (généralement une lampe tungstène-halogène) doit être projetée sur le plan du diaphragme de l'ouverture du condenseur par la lentille collectrice logée dans le logement de la lampe ou le long du train optique à l'intérieur de la base du cadre du microscope. Simultanément, le système de lentilles du condenseur projette également une image du diaphragme de champ dans le plan conjugué de l'échantillon (au niveau de la platine du microscope). Une fois le filament de la lampe centré (la plupart des lampadaires modernes contiennent une lampe pré-centrée), fermez le diaphragme d'ouverture du condenseur et alignez le condenseur avec l'axe optique du microscope en éclairage à fond clair (la tourelle du condenseur est réglée sur la 0 ou B position). Mettre le diaphragme au point, superposé sur un spécimen focalisé à l'aide de l'objectif 10x, et ouvrir les feuilles de l'iris jusqu'à ce que seule une petite partie du diaphragme soit visible sur les bords périphériques du champ de vision. Des mesures similaires sont prises pour chaque objectif utilisé, en s'assurant que le microscope est correctement configuré pour l'éclairage de Köhler pour chaque objectif à tour de rôle en ajustant à la fois les diaphragmes de champ et d'ouverture. Au cours des observations quotidiennes en DIC, le microscope doit être vérifié périodiquement pour s'assurer que l'éclairage de Köhler est maintenu.

        Inspectez l'ouverture arrière de l'objectif - Après avoir configuré le microscope pour l'éclairage de Köhler, insérez le polariseur et l'analyseur et examinez le plan focal arrière de l'objectif avec un télescope de phase ou une lentille de Bertrand (mode d'observation conoscopique). Si le polariseur et l'analyseur sont correctement positionnés et le microscope parfaitement aligné, une croix d'extinction sombre apparaîtra dans l'ouverture de l'objectif, comme illustré sur la figure 7(a). Les bras de la croix d'extinction doivent être orientés verticalement et horizontalement, avec une petite quantité de lumière apparaissant aux quatre coins de l'ouverture (Figure 7(a)). Les points lumineux dans les régions croisées ou hautement biréfringentes, qui affectent l'intégrité de la croix d'extinction, sont un indicateur d'optique déformée. De plus, les particules de poussière et de peluche positionnées à proximité d'un plan focal d'ouverture conjuguée (condenseur ou objectif) apparaîtront brillantes lorsqu'elles sont vues à l'ouverture arrière de l'objectif. Si des taches biréfringentes sont présentes, vérifiez un autre objectif sans contrainte pour déterminer si le premier objectif ou le système de lentille du condenseur est tendu. Retirez toute poussière contaminante des surfaces de l'objectif ou de la lentille du condenseur et remplacez les composants optiques tendus (si possible) avant de passer à l'étape suivante.

        Alignement objectif du prisme DIC - Installer le prisme objectif en insérant soit le curseur (Figure 4), soit un prisme confiné à un support fixe (pour les systèmes utilisant le retard de polarisation de Sénarmont, voir Figure 5). Une fois le prisme en place, examinez à nouveau le plan focal arrière de l'objectif avec le télescope de phase ou la lentille de Bertrand. Le champ de vision devrait maintenant apparaître très lumineux, mais sans particularité, avec une seule frange d'interférence sombre s'étendant sur le diamètre de l'ouverture à un angle de 45 degrés (voir la figure 7(b)) le long de la axe de cisaillement. Selon que le microscope est droit ou inversé, la frange d'interférence traversera l'ouverture arrière de l'objectif dans une direction nord-est-sud-ouest (verticale) ou nord-ouest-sud-est (inversée). Dans les deux cas, la frange d'interférence doit être bien définie, comme illustré sur la figure 7(b), et positionnée au centre de l'ouverture.

        Dans certaines conceptions de microscopes DIC, le prisme objectif est fixe (compensation de Sénarmont), tandis que dans d'autres, le prisme peut être déplacé d'avant en arrière sur l'axe optique au moyen d'un mécanisme à vis de positionnement dans le cadre coulissant. Dans ce dernier cas, tournez lentement le bouton de réglage tout en observant le plan focal arrière de l'objectif à travers le télescope ou la lentille de Bertrand. Lorsque le bouton est tourné, la frange d'interférence doit s'éloigner de sa position centrale vers la moitié supérieure ou inférieure de l'ouverture arrière lumineuse. Alternativement, tourner le polariseur dans un compensateur de Sénarmont produira le même effet.

        Alignement du prisme DIC du condenseur - Retirez le prisme de l'objectif du train optique et basculez le prisme du condenseur à ouverture la plus basse (à utiliser avec l'objectif 10x) en position en faisant tourner la tourelle du condenseur. La position appropriée est généralement marquée par le rouge ou le blanc 10 réglage sur la tourelle (ou un code similaire, tel que L). Refocalisez le télescope de phase ou la lentille de Bertrand pour observer la frange d'interférence qui apparaît dans le plan focal arrière de l'objectif. Encore une fois, une seule frange doit être présente ayant la même orientation que la frange produite par le prisme objectif (nord-est-sud-ouest pour les microscopes droits ou nord-ouest-sud-est pour les microscopes inversés). Les franges d'interférence pour le condenseur et les prismes objectifs doivent apparaître presque identiques et doivent avoir la même orientation le long de l'axe de cisaillement.

        Afin d'observer clairement la frange d'interférence du prisme du condenseur à l'aide de condenseurs à grande ouverture numérique conçus pour une immersion dans l'huile, il peut être nécessaire de retirer l'ensemble de lentille avant à l'aide du levier de commande de la lentille pivotante. Si la frange apparaissant dans l'ouverture de l'objectif n'est pas correctement positionnée, il peut être nécessaire d'ajuster l'orientation ou l'alignement du prisme du condenseur. Dans la plupart des cas, les prismes du condenseur sont assemblés dans un cadre de protection circulaire en aluminium (Figure 3) avec une encoche ou une goupille (ou une vis de verrouillage) pour assurer un positionnement correct dans la tourelle du condenseur. Parfois, un prisme de condenseur peut être forcé dans la tourelle sans alignement correct, ce qui sera apparent lorsque la frange d'interférence est examinée. Si un prisme de condenseur semble désaligné, consultez le fabricant du microscope pour obtenir des instructions sur le réglage correct des prismes DIC du condenseur.

        Observation des spécimens - Avec le microscope aligné pour l'éclairage de Köhler, le polariseur et l'analyseur croisés, et les deux prismes (objectif et condenseur) installés, placez un spécimen monté transparent mince (comme une préparation de cellules épithéliales de la muqueuse buccale) sur la scène. Ajustez le microscope pour une extinction maximale, et focalisez l'échantillon tout en observant la procédure à travers les oculaires en mode orthoscopique (pas de lentille de Bertrand ni de télescope de phase). L'image observée dans le champ de vision doit apparaître gris très foncé, presque noire, à extinction maximale avec des reflets brillants dans les régions ayant des gradients d'épaisseur ou d'indice de réfraction bien définis (par exemple, la membrane cellulaire et le noyau, voir la figure 8 (b)). Les spécimens sphériques avec un indice de réfraction élevé, tels que les gouttelettes d'huile à immersion, peuvent même agir comme de minuscules lentilles et apparaître avec une frange ou une bande d'interférence bien définie traversant la région centrale orientée dans la même direction que les franges lorsqu'elles sont observées à l'arrière de l'objectif ouverture.

        Tout en observant l'image de l'échantillon focalisé, translatez le prisme DIC objectif à l'aide du bouton coulissant ou faites tourner le polariseur (ou analyseur) dans un microscope équipé pour la compensation de Sénarmont. Cette action est appelée introduction du retard de polarisation, et translatera la frange d'interférence coupant l'éprouvette le long de l'axe de cisaillement et produira un changement correspondant à l'apparence de l'éprouvette. Déplacer le prisme dans une direction (biais positif) éclaircira les caractéristiques de l'échantillon sur un bord tout en assombrissant les mêmes caractéristiques sur le bord opposé et éclaircira simultanément l'arrière-plan (voir Figure 8(a)). En général, l'éprouvette prend un aspect pseudo-tridimensionnel avec un effet d'ombre portée orienté dans la même direction que l'axe de cisaillement. Déplacer le prisme de l'autre côté de l'axe optique du microscope (biais négatif) inversera les régions claires et sombres de l'échantillon (comparer la figure 8 (a) avec la figure 8 (c)).

        À extinction maximale avec tous les composants DIC correctement installés et alignés, l'ouverture arrière de l'objectif apparaît gris foncé (presque noire) et relativement uniforme lorsqu'elle est observée avec un télescope de phase ou une lentille de Bertrand (Figure 7(c)). Dans la plupart des cas, la région centrale de l'ouverture arrière apparaît en noir de jais tandis que des traces de lumière apparaissent dans les quatre quadrants à la périphérie. La croix d'extinction devrait généralement apparaître assez similaire à celle observée avec les polariseurs croisés seuls, mais elle est généralement beaucoup plus sombre et couvre une plus grande région de l'ouverture arrière de l'objectif. Les zones lumineuses entourant la périphérie (figure 7(c)) résultent d'un artefact qui se produit par dépolarisation partielle de la lumière à la surface des polariseurs et des lentilles dans le condenseur et l'objectif.

        Les images de contraste d'interférence différentielle peuvent être considérablement améliorées en masquant les régions lumineuses à la périphérie de la croix d'extinction dans l'ouverture arrière de l'objectif. Ceci est accompli en réduisant la taille du diaphragme d'ouverture du condenseur pour éliminer les bords brillants. En général, la taille de l'ouverture arrière de l'objectif doit être réduite avec le diaphragme du condenseur à environ 75 ou 80 pour cent de la pleine ouverture. Lorsque le système optique est parfaitement aligné, la croix d'extinction apparaît droite (voir figure 7) et on peut observer qu'elle est constituée de deux larges franges d'interférence, chacune formée à angle droit et se rejoignant au centre de l'ouverture arrière de l'objectif (les franges peut également être visualisé en mode orthoscopique dans des microscopes de qualité inférieure).

        Sur certains microscopes, les positions du condenseur et du prisme objectif peuvent être ajustées pour produire un motif de franges plus uniforme, ce qui fait que la région centrale de l'ouverture apparaît plus sombre et plus uniforme. Cette tâche est accomplie en desserrant et en tournant (ou en élevant ou en abaissant) le prisme du condenseur ou en décroisant le polariseur et l'analyseur de quelques degrés. Parfois, les microscopes contiennent des vis de réglage qui permettent le réglage du condenseur et des prismes objectifs, mais les modèles ainsi équipés se font rares. Comme contrôle final de l'alignement du microscope, ajustez le bouton de mise au point du condenseur tout en examinant le modèle d'extinction dans l'ouverture arrière de l'objectif pour déterminer s'il peut être amélioré. A noter qu'un repositionnement important du condenseur peut dégrader les performances optiques en séparant le chevauchement entre les plans d'interférence conjugués des prismes DIC objectif et condenseur.

        Ajuster le retard de polarisation en déplaçant le prisme objectif, ou en faisant tourner le polariseur dans une configuration de Sénarmont, améliore considérablement l'apparence de l'image (par rapport à celle observée à l'extinction maximale) et augmente le contraste. Cette manœuvre est essentielle pour l'imagerie d'échantillons en contraste interférentiel différentiel et représente la dernière étape du réglage du train optique du microscope. Dans de nombreux cas, un gradient de lumière apparaît sur tout le champ de vision lors de l'observation d'images DIC. Cela se produit en plus de la présence d'intensités claires et sombres sur les bords opposés de l'échantillon, et est dû à un artefact de frange de champ large et indistinct produit par le système optique. Les microscopes ayant des composants optiques bien assortis maximisent la taille de la frange de champ, qui peut devenir si large et uniformément répartie que l'ensemble du champ apparaît d'une couleur gris moyen uniforme. Dans la plupart des cas, cependant, il reste des traces de la frange et le champ de vision présente un faible gradient d'intensité lumineuse (nuances de gris moyennes à claires ou plus foncées) d'un bord périphérique à l'autre. Cet artefact est inhérent à une configuration optique particulière et doit être ignoré lors de l'observation et de la collecte d'images d'échantillons DIC.

        Compensateurs en microscopie DIC

        Le contraste de l'échantillon peut également être augmenté en introduisant une plaque de retard (ou un compensateur) dans la voie optique d'un microscope DIC. En général, un pleine onde (également appelé un Premier ordre compensateur) est insérée dans un tube intermédiaire entre le prisme objectif et l'analyseur, bien que la plaque puisse également être située après le polariseur mais avant le prisme condenseur. Ces plaques présentent un niveau de retard d'une longueur d'onde entière à une valeur spécifiée dans la région verte (généralement près de 550 nanomètres), et le spécimen affiche des couleurs d'interférence newtoniennes jaunes et bleues le long des gradients d'indice de réfraction et d'épaisseur. L'arrière-plan est rendu magenta en raison de la soustraction des longueurs d'onde vertes de la lumière blanche.

        Dans une configuration de microscope DIC à prisme de de Sénarmont ou standard (traduisible) Nomarski, lorsque le prisme objectif est positionné avec la frange d'interférence d'extinction au centre de la voie optique, un motif similaire à celui affiché sur la figure 7 (b) est observé à le plan focal arrière de l'objectif (à condition que le prisme du condenseur soit éloigné du chemin optique). Si une plaque de retard pleine onde est ensuite placée entre le prisme objectif et l'analyseur, le motif d'interférence illustré sur la figure 9 (a), qui affiche un spectre de couleurs d'interférence newtoniennes, apparaît dans le plan focal arrière de l'objectif. Le retrait du prisme objectif du trajet optique et l'insertion d'un prisme condenseur donnent le motif présenté sur la figure 9 (c). Lorsque les prismes de l'objectif et du condenseur sont tous deux présents dans le train optique et ajustés à la position d'extinction, une couleur magenta est visible dans le plan focal arrière de l'objectif (Figure 9 (b)).

        La translation du prisme de Nomarski objectif ou la rotation du polariseur dans une configuration de compensateur de Sénarmont modifiera la couleur du motif d'interférence newtonien illustré à la figure 9(b). L'introduction d'un biais négatif déplacera les couleurs newtoniennes vers des valeurs soustractives (jaune), tandis que le déplacement du prisme vers des valeurs de biais positives entraînera des couleurs additives (bleu). Les couleurs produites par les gradients d'échantillons peuvent être comparées à une charte de référence Michel-Levy afin de déterminer l'amplitude des différences de chemin optique.

        Erreurs de configuration du microscope DIC

        Lorsqu'un microscope à interférence différentielle est correctement configuré, les images résultantes affichent un réalisme qui se manifeste dans une pseudo-tridimensionnalité par un effet d'ombre portée qui semble provenir d'un angle très oblique (voir la figure 10 (a)). Cependant, même de légères erreurs d'alignement peuvent entraîner une détérioration des moindres détails de l'échantillon, et de graves erreurs de configuration peuvent entraîner une perte dramatique de contraste qui rend l'image inutile. Les erreurs les plus courantes dans la configuration du microscope DIC résultent de polariseurs qui ne sont pas croisés, d'un décalage entre les prismes de l'objectif et du condenseur, d'un prisme DIC du condenseur manquant ou d'un réglage incorrect de l'ouverture de l'iris du condenseur. D'autres problèmes peuvent survenir, en particulier si le condenseur et/ou les objectifs ne sont pas sans tension, mais ces erreurs sont rares si le microscope est conçu spécifiquement pour l'imagerie d'échantillons en éclairage DIC.

        S'assurer que les polariseurs sont croisés et positionnés dans la bonne orientation a été discuté précédemment dans la section sur l'alignement du microscope. Occasionnellement, le polariseur ou l'analyseur peuvent se déplacer accidentellement hors de leur position en frottant contre la molette ou en utilisant l'instrument avec négligence. En conséquence, le contraste global de l'échantillon est réduit, mais de nombreuses caractéristiques restent souvent visibles. Ce type d'erreur peut être éliminé en utilisant un polariseur et un analyseur fixes ou en s'assurant que le bouton de verrouillage est réglé pour suspendre la rotation du polariseur. La plupart des polariseurs logés dans des montures rotatives contiennent des marques qui indiquent la position de l'azimut de transmission. Une vérification minutieuse de l'orientation du polariseur et de l'analyseur avant de commencer les observations DIC permettra d'éviter les erreurs avec ces composants.

        L'inadéquation accidentelle entre les prismes de l'objectif et du condenseur est une autre source fréquente d'erreurs en microscopie à contraste d'interférence différentielle. En raison des écarts d'angle de cisaillement entre les prismes non conçus pour fonctionner ensemble, l'image résultante présente un contraste extrêmement faible (voir la figure 10 (c), qui ne peut pas être corrigé en déplaçant le prisme objectif ou en tournant le polariseur dans un microscope à compensation de Sénarmont. La tourelle du condenseur est généralement marquée d'un code qui identifie le prisme placé dans le chemin optique. L'inspection de l'ordre du code extérieur pour s'assurer que les prismes du condenseur sont positionnés dans le bon emplacement aidera à éviter ce type d'erreur. De plus, le code du prisme inscrit sur le barillet de l'objectif doit correspondre au code du prisme du condenseur utilisé. En général, des décalages de prisme se produisent lorsque le grossissement est modifié, mais la tourelle du condenseur n'est pas tournée pour insérer un prisme correspondant dans le chemin optique. Parfois, un prisme de condenseur peut être absent du condenseur ou de la tourelle du condenseur tournée dans une position qui contient un prisme (par exemple, la position de fond clair voir Fi figure 3). Le résultat est une image similaire à celle illustrée sur la figure 10(c), qui manque de contraste et n'affiche pas la haute résolution pouvant être obtenue avec un contraste d'interférence différentiel.

        Le diaphragme à iris du condenseur est généralement utilisé pour ajuster la profondeur de champ et le contraste des images observées dans les oculaires ou enregistrées numériquement et sur film. En microscopie à contraste d'interférence différentielle, les grandes ouvertures sont utiles pour les expériences de sectionnement optique, où une faible profondeur de champ est requise, mais une haute résolution est également nécessaire. Souvent, le compromis entre le contraste maximum offert par l'utilisation d'ouvertures plus petites est compensé par l'élimination des caractéristiques d'échantillon interférentes situées loin du plan de mise au point. Si l'ouverture du condenseur n'est pas suffisamment ouverte (à environ trois quarts à quatre cinquièmes de l'ouverture de l'objectif), les artefacts de diffraction peuvent masquer des détails importants de l'échantillon et dégrader sérieusement l'apparence de l'image (Figure 10 (b)). En général, les effets de diffraction peuvent être évités en maintenant la taille du diaphragme à iris du condenseur entre 80 et 90 pour cent de l'ouverture de l'objectif.

        Des erreurs supplémentaires peuvent se produire en raison de l'aberration sphérique lors de l'utilisation d'échantillons épais immergés dans l'eau, ou lorsque la lame de microscope en verre, la boîte de culture ou la lamelle est trop épaisse. Ces erreurs se manifestent par des images peu nettes et dépourvues du relief ombré caractéristique des images DIC. Les colliers de correction sur les objectifs secs à fort grossissement peuvent souvent être ajustés pour corriger l'aberration sphérique, mais les spécimens trop épais doivent être remplacés par des sections plus minces. Lors de l'examen de cellules en culture, n'utilisez pas de systèmes optiques DIC avec des récipients de culture fabriqués à partir de polymères moulés par injection. Ces matériaux présentent une biréfringence de contrainte et produiront des images confuses. Utilisez plutôt des récipients en verre spécialement conçus pour la microscopie DIC, disponibles auprès de plusieurs fabricants. En général, une attention particulière doit être portée à la sélection de lames de microscope en verre de haute qualité et de lamelles couvre-objet fabriquées selon des tolérances précises, et le verre doit être soigneusement nettoyé et séché avant la préparation des échantillons.

        Sources d'éclairage pour la microscopie DIC

        À des grossissements inférieurs (10x à 40x), une lampe halogène à quartz de 50 watts peut fournir suffisamment de lumière pour une observation et un enregistrement satisfaisants des images en DIC. Cependant, aux grossissements les plus élevés (60x et 100x), au moins une source de lumière tungstène-halogène de 100 watts est recommandée.L'intensité d'éclairage requise par la source lumineuse dépend du pourcentage de transmission du polariseur et de l'analyseur, et de nombreux microscopes DIC plus anciens sont équipés d'éléments polarisants ayant de faibles valeurs de transmission (20 % ou moins). Cependant, les modèles de microscopes plus récents sont souvent équipés de polariseurs à haute transmission (supérieure à 30 %), qui permettent à une densité de flux plus élevée de traverser le système optique, fournissant une lumière adéquate pour l'observation et l'imagerie aux grossissements les plus élevés.

        Bien que les détails structurels grossiers, tels que les bords des cellules et les composants intracellulaires plus gros (noyaux) puissent être facilement visualisés avec une lampe aux halogénures de tungstène à haute intensité, afin d'observer les détails structurels les plus fins, un éclairage très intense ayant une bande passante étroite est essentiel . Les lampes à décharge à arc au mercure présentent un pic de haute énergie dans la partie centrale du spectre visible à 546 nanomètres (vert), qui peut être affiné davantage en passant à travers un filtre interférentiel à bande étroite (10 nanomètres) centré à 546 nanomètres. De plus, un brouilleur de lumière peut être utilisé pour améliorer l'éclairage à bande passante étroite afin d'obtenir la résolution la plus élevée possible. Notez que l'ouverture de l'objectif doit être entièrement éclairée, quelle que soit la source lumineuse, pour de meilleurs résultats.

        Le placement et l'orientation corrects des composants optiques dans un microscope à contraste interférentiel différentiel sont essentiels pour des performances optimales, quels que soient le grossissement et la résolution de la cible. Un réglage incorrect, même d'un seul composant, peut entraîner une grave dégradation de l'image et perturber l'effet d'ombre portée et la résolution de l'instrument. Les deux prismes composés et leurs polariseurs associés en microscopie DIC sont des paires d'images miroir. Les ondes lumineuses traversant le polariseur initial et le prisme du condenseur sont imagées sur le prisme objectif et l'analyseur pour produire l'image finale. Ces quatre composants doivent être dans le bon sens pour que le CIB fonctionne correctement. Le contraste est généré soit en modifiant la position latérale du prisme objectif, soit en faisant tourner le polariseur dans les instruments de compensation de Sénarmont. De cette manière, la différence de chemin optique entre les fronts d'onde est augmentée ou diminuée pour produire un contraste dans l'échantillon.

        Il convient de noter que le contraste dans le DIC est fonction des gradients de la longueur du trajet optique de l'échantillon, qui sont rendus en pseudo relief tridimensionnel lorsque le microscope est correctement ajusté. Étant donné que le contraste résulte d'une combinaison de fluctuations d'indice de réfraction et/ou de variations d'épaisseur, les gradients apparents observés avec la technique peuvent correspondre à de réels changements dans la topographie de l'échantillon ou peuvent être fonction, par exemple, de gradients de concentration en protéines localisés. Seule une connaissance indépendante des propriétés structurelles relatives à l'échantillon peut aider à déterminer la nature absolue des effets de contraste en microscopie DIC.

        De plus, même lorsqu'il est déterminé que les effets d'ombre portée peuvent vraiment être attribués aux changements de hauteur de l'échantillon, il n'y a aucun mécanisme inhérent au DIC pour indiquer quelles caractéristiques représentent des plateaux ou des vallées à un réglage particulier du prisme objectif. Une solution qualitative au problème consiste à localiser une caractéristique connue de l'échantillon, telle qu'une rayure dans le verre, et à observer comment la caractéristique réagit au retard de polarisation lorsque le prisme objectif est translaté à travers l'axe optique. Les caractéristiques intégrales des échantillons ayant une réponse similaire seront soit des vallées, soit des plateaux, tandis que celles ayant des réponses opposées auront une orientation inverse.

        Lors de l'examen d'échantillons inconnus avec un contraste d'interférence différentiel, le microscopiste doit être attentif aux couleurs d'interférence apparaissant sur les bords, qui sont normalement sans caractéristiques et présentent une couleur très claire ou foncée, selon l'orientation. La présence de couleurs d'interférence indique que l'échantillon peut être biréfringent et, par conséquent, pas un bon candidat pour l'observation DIC. Ce fait peut être confirmé en examinant l'échantillon sous un éclairage polarisé croisé avec à la fois les prismes DIC objectif et condenseur retirés de la voie optique.

        Parmi les limitations imposées à la microscopie différentielle à contraste interférentiel figurent les prismes biréfringents coûteux de Nomarski ou de Wollaston nécessaires à la réalisation de la technique. Ces composants sont beaucoup plus chers que ceux requis pour la microscopie à contraste de phase ou à contraste de modulation de Hoffman, qui peuvent servir de techniques alternatives, en particulier lors de l'observation de cellules vivantes dans des vaisseaux en plastique. De plus, les spécimens très minces ou dispersés produisent souvent de meilleures images ayant plus de contraste lorsque le contraste de phase est utilisé au lieu du DIC. Les objectifs apochromatiques plus anciens peuvent ne pas convenir à l'observation DIC car les objectifs eux-mêmes peuvent affecter de manière significative la lumière polarisée. Le microscopiste doit vérifier auprès du fabricant avant d'acheter des objectifs apochromatiques de haute qualité en conjonction avec des composants optiques DIC.

        Auteurs contributeurs

        Douglas B. Murphy - Département de biologie cellulaire et d'anatomie et de microscopie, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

        Edward D. Saumon - Département de biologie cellulaire, Université de Caroline du Nord, Chapel Hill, Caroline du Nord 27599.

        Mortimer Abramowitz - Olympus America, Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, New York, 11747.

        Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Floride, 32310.


        Virus

        Les virus sont des parasites intracellulaires qui ne peuvent pas se répliquer seuls. Ils se reproduisent en infectant les cellules hôtes et en usurpant la machinerie cellulaire pour produire plus de particules virales. Dans leurs formes les plus simples, les virus ne sont constitués que d'acide nucléique génomique (soit ADN ou ARN) entouré d'une enveloppe protéique (Figure 1.42). Les virus sont importants en biologie moléculaire et cellulaire car ils fournissent des systèmes simples qui peuvent être utilisés pour étudier les fonctions des cellules. Étant donné que la réplication du virus dépend du métabolisme des cellules infectées, les études sur les virus ont révélé de nombreux aspects fondamentaux de la biologie cellulaire. Les études sur les virus bactériens ont largement contribué à notre compréhension des mécanismes de base de la génétique moléculaire, et des expériences avec un virus végétal (virus de la mosaïque du tabac) ont d'abord démontré le potentiel génétique de l'ARN. Les virus animaux ont fourni des sondes particulièrement sensibles pour des recherches sur diverses activités de cellules eucaryotes.

        Graphique 1.42

        Structure d'un virus animal. (A) Les particules de papillomavirus contiennent une petite molécule d'ADN circulaire enfermée dans une couche de protéine (la capside). (B) Micrographie électronique de particules de papillomavirus humain. La couleur artificielle a été ajoutée. (B, Alfred Pasieka/Science (plus. )

        La croissance rapide et la petite taille du génome des bactéries en font d'excellents sujets d'expériences en biologie moléculaire, et les virus bactériens (bactériophages) ont encore simplifié l'étude de la génétique bactérienne. L'un des bactériophages les plus importants est le T4, qui infecte et se réplique dans E. coli. L'infection par une seule particule de T4 conduit à la formation d'environ 200 particules virales descendantes en 20 à 30 minutes. La cellule initialement infectée éclate (lyse), libérant des particules virales de descendance dans le milieu, où elles peuvent infecter de nouvelles cellules. Dans une culture de bactéries poussant sur milieu gélosé, la réplication de T4 conduit à la formation d'une zone claire de cellules lysées (une plaque) dans le tapis bactérien (Figure 1.43). Tout comme les particules virales infectieuses sont faciles à cultiver et à doser, les mutants viraux, par exemple, les virus qui se développeront dans une souche de E. coli mais aucun autre n'est facile à isoler. Ainsi, T4 est manipulé encore plus facilement que E. coli pour les études de génétique moléculaire. De plus, le génome de T4 est 20 fois plus petit que celui de E. coli—environ 0,2 million de paires de bases�ilitant davantage l'analyse génétique. Certains autres bactériophages ont des génomes encore plus petits, le plus simple consistant en des molécules d'ARN de seulement 3600 nucléotides environ. Les virus bactériens ont ainsi fourni des systèmes expérimentaux extrêmement faciles pour la génétique moléculaire. Les études de ces virus sont en grande partie ce qui a conduit à l'élucidation de nombreux principes fondamentaux de la biologie moléculaire.

        Graphique 1.43

        Plaques bactériophages. Des plaques T4 sont visibles sur une pelouse de E. coli. Chaque plaque résulte de la réplication d'une seule particule virale. (E.C.S. Chen/Visuels illimités.)

        En raison de la complexité accrue du génome des cellules animales, les virus ont été encore plus importants dans les études sur les cellules animales que dans les études sur les bactéries. De nombreux virus animaux se répliquent et peuvent être testés par formation de plaques dans des cultures cellulaires, tout comme les bactériophages. De plus, les génomes des virus animaux sont similaires en complexité à ceux des virus bactériens (allant d'environ 3000 à 300 000 paires de bases), de sorte que les virus animaux sont beaucoup plus faciles à gérer que leurs cellules hôtes.

        Il existe de nombreux virus animaux divers, chacun contenant de l'ADN ou de l'ARN comme matériel génétique (tableau 1.3). Une famille de virus animaux—the rétrovirus𠅌ontiennent des génomes d'ARN dans leurs particules virales mais synthétisent une copie d'ADN de leur génome dans les cellules infectées. Ces virus fournissent un bon exemple de l'importance des virus en tant que modèles, car les études sur les rétrovirus sont ce qui a d'abord démontré la synthèse d'ADN à partir de modèles d'ARN, un mode fondamental de transfert d'informations génétiques maintenant connu pour se produire à la fois dans les cellules procaryotes et eucaryotes. D'autres exemples dans lesquels les virus animaux ont fourni des modèles importants pour les investigations de leurs cellules hôtes comprennent des études de réplication d'ADN, de transcription, de traitement d'ARN et de transport et de sécrétion de protéines.

        Tableau 1.3

        Exemples de virus animaux.

        Il est particulièrement remarquable que l'infection par certains virus animaux, plutôt que de tuer la cellule hôte, convertit une cellule normale en une cellule cancéreuse. Les études de ces virus cancérigènes, décrits pour la première fois par Peyton Rous en 1911, ont non seulement fourni la base de notre compréhension actuelle du cancer au niveau de la biologie cellulaire et moléculaire, mais ont également conduit à l'élucidation de nombreux mécanismes moléculaires. qui contrôlent la croissance et la différenciation des cellules animales.


        Voir la vidéo: Microscope optique: biologie cellulaire (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Con

    Tu as tout à fait raison.

  2. Doughall

    Vous avez tort. Je suis sûr. Nous devons discuter. Écrivez-moi en MP.

  3. Kazikasa

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  4. Hephaestus

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  5. Fearnhamm

    Réponse rapide, signe d'intelligence)

  6. Mulkis

    À mon avis, cet article vous a été volé et placé sur un autre site. Je l'ai déjà vue.



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