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Comment déduire si une infection par un virus à ARN ou une infection par un virus à ADN

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Existe-t-il une règle générale pour dire qu'il doit s'agir d'une infection par un virus à ARN et l'autre d'une infection par un virus à ADN ?

Exemple de cas : 5 enfants développent une éruption rouge vif sur le visage et virent au violet au bout de quelques jours puis disparaissent. Ensuite, une éruption maculopapuleuse apparaît sur le tronc, les fesses et les extrémités. Elle s'estompe rapidement du tronc mais persiste sur les cuisses et les avant-bras. Deux enfants ont également eu une légère fièvre et un mal de gorge, mais tous n'étaient pas terriblement malades. Quel est le matériel génétique de l'agent causal le plus probable?

La bonne réponse est : ADN simple brin, puisque l'agent causal le plus probable est l'érythème infectieux causé par le parvovirus B19.

Je ne veux pas me souvenir de tous les microbes par cœur. Comment pouvez-vous en déduire qu'il doit s'agir d'une infection à ADN et probablement simple brin ?


Si vous voulez dire simplement en regardant les symptômes, alors il n'y a aucun moyen, surtout si dans le cadre d'une visite médicale. Vous feriez mieux d'apprendre les suspects habituels et de déterminer le risque et la probabilité pour les patients d'une infection donnée. Un bon exemple est l'hépatite. Le virus de l'hépatite B (VHB) et le virus de l'hépatite C (VHC) présentent des symptômes extérieurs (assez) similaires, mais le premier est un virus à ADN et le second un virus à ARN. En fait, en regardant la liste des causes aiguës d'enWikipedia, c'est partout !

Si vous pouvez réellement le tester en laboratoire, alors bien sûr. Même si…


La dynamique de N Modification de l'ARN 6 -méthyladénine dans les interactions entre les virus du riz et des plantes

N 6 -méthyladénosine (m 6 A) est la modification d'ARN la plus courante chez les eucaryotes et a été impliquée en tant que nouveau marqueur épigénétique impliqué dans divers processus biologiques. Le schéma et la dissection fonctionnelle de m 6 A dans la régulation de plusieurs maladies virales humaines majeures ont déjà été rapportés. Cependant, les modèles et les fonctions de la distribution de m 6 A dans l'éclatement des maladies des plantes restent largement inconnus.

Résultats

Nous analysons les méthylomes m 6 A de haute qualité dans des plants de riz infectés par deux virus dévastateurs. Nous constatons que la méthylation de m 6 A est principalement associée à des gènes qui ne sont pas activement exprimés dans les plants de riz infectés par le virus. Nous détectons également différentes distributions de pics m 6 A sur le même gène, ce qui peut contribuer à différents modes antiviraux entre le virus de la rayure du riz ou le virus de la raie noire du riz. Fait intéressant, nous observons des niveaux accrus de méthylation de m 6 A dans la réponse des plants de riz à l'infection virale. Plusieurs gènes liés à la voie antivirale, tels que les gènes liés au métabolisme de l'ARN silencing, de résistance et de phytohormone antivirale fondamentale, sont également m 6 A méthylés. Le niveau de méthylation de m 6 A est étroitement associé à ses niveaux d'expression relatifs.

Conclusion

Nous avons révélé la dynamique de la modification de m 6 A au cours de l'interaction entre le riz et les virus, qui peut agir comme une stratégie régulatrice principale dans l'expression des gènes. Nos investigations mettent en évidence l'importance des modifications de m 6 A dans les interactions entre plantes et virus, notamment dans la régulation de l'expression de gènes impliqués dans des voies clés.


Comment déduire si une infection par un virus à ARN ou une infection par un virus à ADN - Biologie

Mots-clés - génération de précurseur-miARN, silençage médié par l'ARN double brin, formation d'hétérochromatine, résilençage de la transcription active, maintien des gènes homéotiques et immunité antivirale

Les hélicases à boîte MORTE jouent un rôle essentiel dans le métabolisme de l'ARN à travers les espèces, mais des données émergentes suggèrent qu'elles ont des fonctions supplémentaires dans l'immunité. Grâce au dépistage par ARNi, un rôle conservé au cours de l'évolution et indépendant de l'interféron a été identifié pour l'hélicase DEAD-box DDX17 dans la restriction du virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV), un virus transmis par les moustiques de la famille des bunyavirus qui provoque une morbidité et une mortalité graves chez l'homme et le bétail. . La perte de Drosophila DDX17 (Rm62) dans les cellules et les mouches augmente l'infection par le RVFV. De même, l'épuisement de DDX17 mais pas l'hélicase DDX5 apparentée a augmenté la réplication du RVFV dans les cellules humaines. En utilisant le séquençage à haut débit d'immunoprécipitation par réticulation (CLIP-seq), cette étude montre que DDX17 lie les boucles de tige du précurseur-miARN de l'hôte (pri-miARN) pour faciliter leur traitement et également une boucle de tige essentielle dans l'ARN bunyaviral pour restreindre l'infection. Ainsi, DDX17 a un double rôle dans la reconnaissance des tiges-boucles : dans le noyau pour la biogenèse des microARN endogènes (miARN) et dans le cytoplasme pour la surveillance des non-éléments structurés (Moy, 2014).

Les hélicases à ARN contrôlent presque toutes les facettes du métabolisme de l'ARN, y compris la transcription, l'épissage, la biogenèse des miARN, la traduction et la désintégration. Constituant la plus grande famille d'hélicases, les protéines à boîte DEAD se trouvent dans les trois règnes de la vie et partagent 12 motifs conservés, dont le motif DEAD caractérisé par les acides aminés Asp-Glu-Ala-Asp. Bien que les protéines à boîte MORTE soient les plus appréciées pour leur rôle dans le métabolisme de l'ARN, certaines ont des fonctions importantes dans la défense antivirale. Par exemple, le gène 1 inductible par l'acide rétinoïque des mammifères (RIG-I/DDX58) et le facteur 5 associé à la différenciation du myélome (MDA-5), appelés collectivement récepteurs de type RIG-I (RLR), reconnaissent les éléments non autonomes dans Des ARN tels que l'ARN double brin (ARNdb) et l'ARN 5'-triphosphorylé, conduisant à l'induction transcriptionnelle de l'interféron de type I (IFN-I) et des cytokines pro-inflammatoires (Loo, 2011). Cependant, certains virus ne sont pas limités par les RLR dans certains contextes ou codent de puissants antagonistes des RLR, et donc des capteurs supplémentaires peuvent avoir évolué (Moy, 2014).

Bien que les RLR ne soient pas strictement conservés chez les invertébrés tels que les moustiques et la drosophile, les insectes utilisent une hélicase apparentée pour lutter contre les infections virales. L'hélicase à boîte DEAD Dicer-2 (Dcr-2) est un composant central de la voie ARNi qui reconnaît les ARN viraux double brin ou structurés et les clive en petits ARN interférents de 21 nt (siARN) (Ding, 2007 Sabin, 2013 ). Les siARN dérivés du virus sont chargés dans un complexe de silençage induit par l'ARN contenant Argonaute-2 (Ago2) qui clive l'ARN viral. De plus, pendant l'infection par le virus de la drosophile C (DCV), Dcr-2 contrôle l'induction du gène antiviral Vago (Deddouche, 2008 Moy, 2014 et références y figurant).

Plus récemment, plusieurs autres protéines à boîte DEAD ont été impliquées dans la détection des acides nucléiques viraux ou la régulation de la signalisation en aval. Par exemple, DDX41 reconnaît l'ADN intracellulaire et les dinucléotides cycliques bactériens, tandis qu'un complexe de DDX1, DDX21 et DHX36 détecte l'ARNdb viral spécifiquement dans les cellules dendritiques. D'autres capteurs d'hélicase ou composants de voies de signalisation antivirales récemment identifiés comprennent DDX3, DHX9 et DDX60. Ainsi, le paysage des hélicases DEAD-box dans l'immunité innée est plus diversifié qu'on ne le pensait auparavant, et de nombreuses hélicases antivirales restent probablement obscures (Moy, 2014).

Comme de nombreux aspects de l'immunité innée sont conservés chez les mouches ainsi que dans de nombreuses hélicases DEAD-box, un criblage d'ARNi a été effectué pour identifier de nouvelles hélicases antivirales. L'accent a été mis sur le virus transmis par les arthropodes (arbovirus) virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV), un virus à ARN de sens négatif tri-segmenté de la famille des bunyavirus. Chez l'homme, l'infection par le RVFV provoque généralement une maladie fébrile aiguë mais peut évoluer vers des manifestations plus graves telles que l'encéphalite et la fièvre hémorragique avec une mortalité de 1 à 3 %. Chez le bétail, l'infection est particulièrement mortelle avec des taux d'avortement de 100 % et près de 100 % de mortalité chez les nouveau-nés. Il n'existe aucun vaccin ou traitement efficace contre l'infection par le virus de la fièvre de la Vallée du Rift et, par conséquent, des cibles supplémentaires pour une intervention pharmacologique sont nécessaires. De plus, il a été montré que le RVFV n'est pas limité par les RLR dans certains contextes, y compris les fibroblastes, ce qui suggère que d'autres capteurs peuvent restreindre ce pathogène (Moy, 2014).

Cette étude identifie Drosophila Rm62 comme un nouveau facteur hôte qui limite l'infection par le RVFV in vitro et in vivo. Cette restriction était spécifique aux bunyavirus, car Rm62 contrôlait également la réplication du virus bunyavirus La Crosse (LACV), mais pas des virus des trois autres familles testées. Remarquablement, le rôle antiviral de Rm62 a été conservé dans les cellules humaines, car l'homologue humain DDX17 limitait l'infection par le RVFV. DDX17 a été identifié dans un complexe de poids moléculaire élevé avec Drosha et il a été démontré plus tard qu'il régule le complexe du microprocesseur qui médie le traitement des pri-miARN et la biogenèse des miARN, mais ses cibles d'ARN directes ne sont pas entièrement connues. En utilisant CLIP-seq, cette étude a révélé qu'en plus de se lier aux ARN cellulaires, DDX17 interagit également avec l'ARN du RVFV, probablement via des éléments d'ARN viral structurés. Des similitudes frappantes ont été trouvées dans le mode de reconnaissance de l'ARN hôte et viral : DDX17 se lie à un sous-ensemble d'épingles à cheveux pri-miARN ainsi qu'à une épingle à cheveux bien caractérisée sur le génome du RVFV. Le clonage de cette épingle à cheveux dans le virus Sindbis (SINV) a diminué sa réplication d'une manière dépendante de DDX17 dans les cellules humaines et d'insectes, indiquant une fonction antivirale directe pour la liaison de DDX17 à l'ARN viral. Prises ensemble, ces données élargissent la compréhension de la reconnaissance DDX17 des ARN cellulaires et viraux ainsi que la portée des hélicases DEAD-box dans l'immunité antivirale, démontrant que les fonctions immunitaires des gènes DEAD-box peuvent être conservées de manière évolutive des insectes aux humains (Moy , 2014).

Des données émergentes ont commencé à découvrir des fonctions spécialisées pour les hélicases à boîte DEAD de mammifères dans l'immunité, en particulier dans la détection d'acides nucléiques viraux pour activer l'induction d'interféron (Fullam, 2013). Cependant, on ne sait pas si les hélicases DEAD-box jouent des rôles indépendants de l'interféron dans l'immunité antivirale. De plus, si les hélicases antivirales à boîte DEAD existent principalement chez les mammifères ou si les fonctions immunitaires évoluées dans les organismes inférieurs n'ont pas été entièrement explorées. Cette étude a découvert un rôle spécifique et conservé au cours de l'évolution de l'hélicase DDX17 dans la restriction de l'infection par le RVFV, un arbovirus humain majeur qui manque de thérapeutique efficace (Moy, 2014).

Grâce à un criblage d'ARNi dans des cellules de drosophile, Rm62 a été identifié comme un gène d'hélicase anti-RVFV. Rm62 est également essentiel pour la résistance à l'infection par le RVFV in vivo, car les mouches déficientes en Rm62 contestées par le RVFV ont montré une réplication virale et une mortalité accrues. La perte de Rm62 a augmenté l'infection par LACV mais pas l'infection par le SINV, le VSV ou le DCV, et l'inactivation des gènes de l'hélicase à boîte DEAD étroitement liés n'a eu aucun effet sur le RVFV. Ainsi, Rm62 est un facteur de restriction virale essentiel et spécifique chez les mouches (Moy, 2014).

Les mammifères codent deux orthologues de Rm62, DDX5 et DDX17, qui ont été largement étudiés dans la coactivation transcriptionnelle, l'épissage de l'ARNm et le traitement des miARN. De plus, des études antérieures ont impliqué DDX5 et DDX17 dans la promotion de la réplication de plusieurs virus, tels que le virus de l'hépatite C et le virus de la grippe. Cette étude a révélé que l'extinction de DDX17 mais pas de DDX5 augmentait la réplication du RVFV dans les cellules humaines U2OS, tandis que la surexpression de DDX17 inhibait l'infection par le RVFV. Bien qu'une fonction antivirale pour DDX5 ne puisse pas être exclue, étant donné que l'épuisement de DDX5 a régulé positivement l'expression de DDX17 et qu'il n'a pas été possible d'abattre efficacement les deux protéines simultanément dans les cellules U2OS, les niveaux basaux de DDX5 n'ont pas été en mesure de compenser la perte de DDX17. Par conséquent, l'activité antivirale de DDX17 est conservée au cours de l'évolution des invertébrés aux mammifères, suggérant une origine ancienne pour les hélicases à boîte DEAD dans l'immunité innée. DDX17 rejoint une liste croissante de protéines antimicrobiennes DEAD-box qui fonctionnent comme des capteurs cytoplasmiques pour les acides nucléiques viraux. Par exemple, DDX41 se lie à l'ADN pour contrôler l'IFN-I et l'induction de cytokines pro-inflammatoires (Zhang, 2011). De plus, DDX3 interagit avec IKK&epsilon et TBK-1 pour réguler l'activation de l'IFN-I en aval de la reconnaissance du virus. En revanche, DDX17 est indispensable pour l'expression des gènes antiviraux, ce qui suggère que DDX17 agit indépendamment de l'IFN-I, qui est distinct des gènes antiviraux DEAD-box précédemment définis (Moy, 2014).

Des rapports antérieurs ont proposé que Rm62 et DDX17 régulent l'ARNi, qui est une voie antivirale bien caractérisée chez les invertébrés. Dans les cellules de drosophile, il a été démontré que Rm62 se lie à Ago2 et contrôle l'extinction médiée par l'ARNsi (Ishizuka, 2002). Sur la base de ces résultats, une étude a suggéré que les mouches déficientes en Rm62 infectées par le virus Drosophila X (DXV) ont une mortalité accrue due à un ARN antiviral défectueux (Zambon, 2006). surveiller la réplication virale. Dans les cellules de mammifères, DDX5 et DDX17 se trouvent dans le complexe Microprocesseur et régulent la biogenèse des miARN. Cependant, les données actuelles suggèrent que Rm62 et DDX17 restreignent l'infection virale d'une manière indépendante de l'ARNi. Premièrement, il a été découvert que Rm62 contrôle la réplication du RVFV mais pas du VSV, du SINV ou du DCV, des virus restreints par l'ARNi antiviral chez les mouches. Deuxièmement, Rm62 ne s'est pas avéré contrôler le silençage de l'ARN médié par les siARN ou les miARN dans des criblages in vitro et in vivo plus récents, ce qui a été confirmé dans les expériences en cours. Troisièmement, on ne pense généralement pas que l'ARNi limite l'infection virale dans les cellules somatiques de mammifères, alors que sa fonction antivirale dans les types de cellules de mammifères embryonnaires et indifférenciées peut être active. Enfin, l'épuisement du composant du microprocesseur Drosha, qui peut agir comme un facteur antiviral indépendant de l'interféron, n'a pas eu d'impact sur l'infection par le RVFV. Bien qu'il puisse y avoir une complexité et une interaction supplémentaires entre DDX17, la biologie des miARN et la défense antivirale, les données actuelles suggèrent que la fonction antivirale de DDX17 est indépendante de son rôle dans la biogenèse des miARN (Moy, 2014).

Des études LIP-seq ont révélé que le DDX17 s'associe physiquement à l'ARN viral pour contrôler l'infection virale. L'un des pics de liaison au DDX17, correspondant à l'IGR entre les gènes N et NSs sur le segment S génomique, a précipité efficacement le DDX17 des lysats cellulaires. Fait intéressant, cette région forme une épingle à cheveux étendue (Sabin, 2013), suggérant que DDX17 peut reconnaître des tiges-boucles hautement structurées sur les ARN viraux. De plus, dans les cellules infectées, DDX17 forme des puncta cytoplasmiques chevauchant le RVFV N. Cette relocalisation vers des complexes de réplication virale peut permettre à DDX17 d'accéder et de se lier à des éléments d'ARN viral structurés et ainsi de limiter la réplication (Moy, 2014).

En effet, en exprimant l'épingle à cheveux RVFV de SINV (SINV-hp), il a été démontré que SINV devient hypersensible à DDX17 dans les cellules humaines et d'insectes. Cela suggère que la liaison de DDX17 à l'ARN viral est suffisante pour médier son effet antiviral. Comment cette liaison limite la réplication virale reste à clarifier dans de futures études. DDX17 peut s'associer à des cofacteurs protéiques supplémentaires qui interviennent dans sa fonction antivirale. Par exemple, il a été démontré que DDX17 se lie à Dcp2 et Dcp1a, qui suppriment le capuchon 5' des ARNm, et à l'exonucléase Xrn1, qui médie la dégradation de l'ARN 5' à 3'. Fait intéressant, une étude récente a montré que Drosophila Dcp2 restreint l'infection par le RVFV, bien que cela puisse être de manière indirecte en limitant le pool de substrats d'ARNm cellulaire que le RVFV utilise pour sa propre réplication. DDX5 et DDX17 se lient également aux composants de l'exosome d'ARN, un complexe qui catalyse la dégradation de l'ARN 3' à 5'. Par conséquent, DDX17 peut agir comme le capteur qui amène les cibles d'ARN viral à la machinerie de dégradation de l'ARN, ou il peut dérouler les ARN viraux pour faciliter la dégradation. La machinerie de décapage, l'exosome et le DDX17 ont en outre été liés à la protéine antivirale ZAP. Le ZAP est connu pour restreindre la réplication du SINV dans les cellules humaines, et cette étude a révélé un effet modeste de l'épuisement du DDX17 sur le WT SINV, bien que cet effet ne soit pas aussi fort qu'avec le SINV-hp. En revanche, les mouches ne codent pas pour un homologue ZAP, et le silence Rm62 n'a eu aucun impact sur la réplication WT SINV dans les cellules d'insectes. Comme la restriction DDX17 maximale du SINV dépendait de la boucle souche du RVFV dans les deux types de cellules, la fonction antivirale de DDX17 dans l'infection par le RVFV est probablement indépendante de la ZAP et dépend de la liaison directe à l'ARN viral (Moy, 2014).

La raison pour laquelle DDX17 cible spécifiquement les ARN bunyaviraux est également incertaine, car les règles qui dirigent l'activité de liaison à l'ARN de DDX17, ainsi que les protéines à boîte DEAD en général, sont difficiles à déchiffrer. On soupçonne que la spécificité antivirale dérive d'une combinaison de localisation cellulaire et de structures d'ARN spécifiques. Les données suggèrent que SINV et VSV n'ont pas les signaux de ciblage appropriés. De plus, la corrélation entre le modèle d'expression de DDX17 et la pathogenèse virale doit être caractérisée. DDX17 est exprimé de manière ubiquitaire et n'est pas induit transcriptionnellement par l'IFN-I, et les données suggèrent que la localisation subcellulaire mais pas le niveau d'expression est sensible à l'infection. D'autres études permettront de mieux définir la régulation de DDX17 et d'explorer la relation entre le type de tissu et l'activité antivirale (Moy, 2014).

Au-delà de l'élucidation de nouvelles fonctions de DDX17 dans l'immunité, les données révèlent des informations importantes sur le mécanisme de reconnaissance de DDX17 pour divers ARN. Les données suggèrent que les protéines DEAD-box se prêtent parfaitement à l'analyse CLIP-seq. Cette étude a révélé que les cibles d'ARNm cellulaire DDX17 sont enrichies en éléments répétés CT et CA, ce qui suggère que la séquence primaire contribue à la reconnaissance de l'ARNm. En revanche, les pri-miARN liés à DDX17 n'étaient pas enrichis pour cet élément ou toute autre séquence linéaire à la place, DDX17 était localisé dans la tige du miARN, suggérant qu'il reconnaît les pri-miARN via une structure secondaire. Les pri-miARN liés ont été comparés à deux autres études qui surveillaient les miARN lors de la perte de DDX17. L'un a identifié 94 miARN qui ont diminué lors de la perte de p72 dans des fibroblastes embryonnaires de souris qui dérivent de 82 pré-miARN exprimés dans des cellules U2OS, dont 32% étaient directement liés par DDX17 dans les études actuelles. Une autre étude a identifié 317 miARN mal régulés par l'épuisement de DDX17 dans les cellules HaCaT des 160 miARN liés à DDX17 de la présente étude, 60 ont été analysés dans leurs cellules et 30 se sont avérés être régulés par DDX17 (50 %). De plus, la première étude a identifié un motif de séquence dans le segment flanquant 3' d'un sous-ensemble de pri-miARN qui ont été impactés par les niveaux de DDX17 ([GTA]CATC[CTA]), et l'accent a été mis sur miR-21, un miARN qui le courant également identifié comme lié par DDX17. L'étude précédente a démontré par des tests de liaison in vitro que le motif ainsi qu'une boucle de tige complète étaient nécessaires pour une activité de liaison complète. Au total, ces données suggèrent que DDX17 reconnaît la tige pri-miARN dans le contexte d'une queue 3'. Cela biaiserait la liaison de DDX17 aux pri-miARN par rapport aux pré-miARN, car une énergie de liaison supplémentaire serait dérivée des régions flanquantes et faciliterait la liaison de DDX17 aux boucles de tige au sein d'ARN plus grands, comme on le trouve dans les ARN viraux. À l'appui de cela, le motif de séquence ([GTA]CATC[CTA]) était surreprésenté dans les pics d'ARNm de la présente étude, suggérant que cette séquence est en effet un site de liaison préféré pour DDX17 dans divers ARN (Moy, 2014) .

En conclusion, ces données révèlent des parallèles frappants entre la reconnaissance par DDX17 des pri-miARN et des ARN viraux : dans les deux cas, DDX17 cible une tige-boucle structurée, soit pour faciliter le traitement des miARN, soit pour médier l'inhibition du virus (Moy, 2014).

L'hélicase à ARN Rm62 coopère avec Su(var)3-9 pour faire taire la transcription active chez Drosophila melanogaster

L'expression des gènes est hautement dynamique et de nombreux gènes présentent une large gamme d'expression sur plusieurs ordres de grandeur. Cette régulation est souvent médiée par des facteurs de transcription spécifiques à la séquence. De plus, l'emballage serré de l'ADN dans la chromatine peut fournir une couche supplémentaire de contrôle résultant en une gamme dynamique d'expression génique couvrant plusieurs ordres de grandeur. Lors de l'activation transcriptionnelle, les barrières chromatiniennes doivent être éliminées pour permettre une progression efficace de l'ARN polymérase. Cette structure répressive de la chromatine doit être rétablie rapidement après son activation afin de réguler étroitement l'activité des gènes. Cette étude montre que la boîte DExD/H contenant l'ARN hélicase Rm62 est ciblée sur un site d'induction rapide de la transcription où elle est responsable d'un degré accru de méthylation au niveau de H3K9 au locus du choc thermique après suppression du stimulus de choc thermique. L'hélicase à ARN interagit avec l'histone méthyltransférase bien caractérisée Su(var)3-9 via son extrémité N, ce qui fournit un mécanisme potentiel pour le ciblage de la méthylation de H3K9 vers des gènes hautement régulés. Le recrutement de Su(var)3-9 par interaction avec une ARN hélicase sur un site de transcription active pourrait être un mécanisme général qui permet un silence efficace de gènes hautement régulés permettant ainsi à une cellule d'affiner son activité génique sur une large plage (Boeke, 2011).

Cette étude a identifié Rm62 comme un interacteur avec l'extrémité N-terminale de Su(var)3-9. Fait intéressant, ce domaine d'interaction est partagé entre Su(var)3-9 et eIF2&gamma et pourrait donc médier l'interaction entre Rm62 et les deux protéines. Cette étude s'est concentrée sur l'analyse de l'interaction nucléaire de Rm62 et Su(var)3-9 car elle semble être importante pour l'arrêt efficace de gènes hautement activés tels que le hsp70. Conformément au rôle précédemment décrit des modifications des histones au locus du choc thermique, une forte méthylation de H3K9 a été observée au hsp70 gène avant l'activation du choc thermique qui disparaît après le choc thermique et réapparaît lentement lorsque les cellules se remettent du choc thermique. Cette méthylation est fortement dépendante de la présence de Rm62 car elle est fortement réduite en Rm62 souches de mouches mutantes. La mutation Rm62 conduit non seulement à moins de méthylation de H3K9 au niveau des loci de choc thermique, mais conduit également à une réduction globale de la marque H3K9me2 dans l'euchromatine. Cela suggère un mécanisme répandu de recrutement de méthyltransférase médié par l'interaction entre Rm62 et Su(var)3-9 (Boeke, 2011).

Les modifications des histones jouent un rôle crucial dans la régulation de l'expression des gènes. Les hsp70 locus fournit un excellent modèle de promoteur pour basculer rapidement entre l'état activé et désactivé de la transcription et il a été démontré qu'il est régulé à plusieurs niveaux, y compris la modification des histones. L'un des facteurs qui sont recrutés dans le promoteur du choc thermique immédiatement après l'activation est le Rm62, que cette étude identifie comme un interacteur avec l'histone méthyltransférase Su(var)3-9. Bien qu'il ait été recruté immédiatement après le choc thermique, le Rm62 joue un rôle dans l'arrêt de la transcription après la suppression du choc thermique (Buszczak, 2006). Il a été suggéré que l'activité de l'hélicase de l'ARN est nécessaire pour l'élimination efficace de l'ARN de son site de transcription, ce qui à son tour est important pour la résilience du gène (Buszczak, 2006). Cependant, un rôle plus direct dans la génération de l'État refoulé ne pouvait être exclu. Puisqu'un fort recrutement dépendant de Rm62 de Su(var)3-9 au promoteur a été observé après un choc thermique qui est important pour le rétablissement de la chromatine méthylée H3K9, il est proposé que l'interaction entre les deux protéines contribue à la régénération d'un structure répressive de la chromatine après choc thermique. Buszczak a observé une phosphorylation prolongée de H3S10 au hsp70 locus chez les mouches porteuses d'une mutation dans Rm62 qui pourrait très bien être due à un échec du recrutement de la méthylation Su(var)3-9 et H3K9 en l'absence de Rm62. La phosphorylation de H3S10 est sévèrement altérée lorsque le résidu voisin (H3K9) est méthylé par Su(var)3-9 in vitro. Le recrutement d'une méthyltransférase H3K9 dans le hsp70 gène après choc thermique peut donc empêcher une phosphorylation efficace de H3S10 favorisant ainsi le rétablissement d'une structure de chromatine réprimée. Dans le même temps, le recrutement accru d'une kinase H3S10 pourrait empêcher une méthylation prématurée de K9 via les méthyltransférases recrutées, ce qui pourrait expliquer la différence cinétique frappante observée entre la liaison de Su(var)3-9 et l'accumulation d'histones méthylées H3K9. Ces résultats peuvent donc fournir un autre exemple d'un commutateur phospho-méthyle où une forte interdépendance de la méthylation des histones et de la phosphorylation des histones est observée sur les résidus adjacents. Alternativement, l'absence de méthylation des histones après le choc thermique observée par immunofluorescence et par ChIP pourrait être due au fait que les histones sont complètement éliminées après le choc thermique et ne sont réassemblées que pendant la récupération. Dans ce cas le recrutement de Su(var)3-9 conduirait à une concentration locale accrue de la méthyltransférase au site du promoteur, qui pourrait (re-)méthyler les histones éjectées conduisant à la régénération d'un état réprimé après chaleur choc. Cela peut en fait également expliquer l'effet apparemment paradoxal de la localisation de HP1 lors des bouffées de choc thermique. Les données de liaison pourraient également suggérer que le recrutement de Su(var)3-9 est en fait important pour l'activation du gène, puisqu'il s'avère qu'il se lie au promoteur immédiatement après l'induction de la transcription. Cependant, cela est peu probable, car un effet de l'élimination du Su(var)3-9 et du Rm62 est observé sur l'arrêt de hsp70 transcription mais pas sur son induction (Boeke, 2011).

Une autre explication de l'écart apparent entre la liaison Su(var)3-9 et la méthylation de H3K9 pourrait être la nécessité d'un signal supplémentaire pour que l'enzyme devienne active. Un tel signal pourrait être un signal externe tel qu'une modification post-traductionnelle ou un signal interne tel que l'ARN transcrit à partir du hsp70 lieu lui-même. Immédiatement après le choc thermique, une courte rafale de petits ARN peut être détectée qui sont libérés du locus du choc thermique. Considérant le fait que Rm62 joue également un rôle dans le silençage médié par l'ARNi (Csink, 2006), cette impulsion de petits ARN pourrait en fait être la cause du recrutement dépendant du choc thermique de Rm62 au hsp70 locus que cette étude a observé. Les données suggèrent que Su(var)3-9 est ensuite recruté dans le hsp70 locus via des interactions protéine-protéine où il méthyle les histones qui sont assemblées sur le promoteur lors de la répression. Cependant, la possibilité n'a pas été testée que l'ARN stimule l'activité de Su(var)3-9, ce qui pourrait également contribuer à la méthylation retardée des histones (Boeke, 2011).

Enfin, il n'est pas exclu qu'en plus de Su(var)3-9, une déméthylase soit recrutée dans le hsp70 locus, qui supprime la méthylation des histones des histones liées au promoteur. En effet, le membre de la famille jmjC dUTX, qui contient une demthylase spécifique de H3K27, s'associe à l'enzyme ARN polII d'allongement et est recruté dans le hsp70 locus après choc thermique. Il est très probable que de multiples mécanismes redondants jouent un rôle dans le re-silence du hsp70 gènes après un choc thermique, toutes les possibilités évoquées ci-dessus étant impliquées. À la lumière de la nouvelle découverte d'une interaction fonctionnelle entre Su(var)3-9 et Rm62, il sera intéressant d'étudier si cette interaction peut également fournir un lien mécanistique entre l'arrêt de gènes hautement actifs et le silence d'éléments d'ADN répétitifs. via la génération de courts transcrits non traduits pouvant aider au recrutement d'une histone méthyltransférase. Il a été démontré que des mécanismes similaires fonctionnent dans S. pombe mais n'ont jusqu'à présent pas été identifiés chez les eucaryotes supérieurs (Boeke, 2011).

Les blancs, un composant du complexe de liaison nucléaire siRNA/dsRNA, sont nécessaires à la spermiogenèse de la drosophile

De petits ARN et un large éventail de partenaires protéiques contrôlent l'expression des gènes chez les eucaryotes par le biais de divers mécanismes. En combinant la chromatographie d'affinité d'ARNsi et la spectrométrie de masse, cette étude a identifié les blancs de protéine de domaine de liaison à l'ARN double brin comme étant une protéine de liaison à l'ARNsi et à l'ARNdb des cellules de Drosophila S2. Les blancs sont un facteur nucléaire qui contribue à l'efficacité de l'ARNi. Le fractionnement biochimique d'un complexe contenant des blancs montre que le complexe des blancs est différent des complexes de silençage induits par l'ARN précédemment décrits et s'associe à l'hélicase DEAD-box RM62, une protéine précédemment impliquée dans le silençage de l'ARN. Chez les mouches, les blancs sont fortement exprimés dans les tissus des testicules et sont nécessaires à la spermiogenèse postméiotique, mais la perte des blancs ne s'accompagne pas d'une dérépression transposon détectable. Au lieu de cela, les gènes liés aux voies de l'immunité innée sont régulés à la hausse dans blancs testicules mutants. Ces résultats révèlent que les blancs sont un composant unique d'un complexe nucléaire de liaison siARN/ARNdb qui contribue aux voies essentielles liées à l'extinction de l'ARN dans la lignée germinale mâle (Gerbasi, 2011).

L'accumulation nucléaire d'ARNm de réponse au stress contribue à la neurodégénérescence causée par les répétitions rCGG de prémutation du X fragile

Le syndrome tremblement/ataxie associé à l'X fragile (FXTAS) est une maladie neurodégénérative observée chez les porteurs de prémutation de l'X fragile. Des études antérieures ont montré que les répétitions rCGG du X fragile sont suffisantes pour provoquer une neurodégénérescence et que les protéines de liaison aux répétitions rCGG Pur alpha et hnRNP A2/B1 peuvent moduler la toxicité neuronale induite par rCGG. Pour explorer davantage le rôle de Pur alpha dans la neurodégénérescence médiée par rCGG, une approche protéomique a été adoptée et plus de 100 protéines ont été identifiées qui interagissent avec Pur alpha. Rm62, l'orthologue de la drosophile de l'hélicase à ARN p68, est particulièrement intéressant, qui pourrait moduler la neurodégénérescence médiée par rCGG. Cette étude montre que les répétitions de rCGG ont diminué l'expression de Rm62 post-transcriptionnellement, conduisant à l'accumulation nucléaire du transcrit Hsp70, ainsi que des ARNm supplémentaires impliqués dans le stress et les réponses immunitaires. Ensemble, ces résultats suggèrent qu'une accumulation nucléaire anormale de ces ARNm, probablement due à une altération de l'exportation nucléaire, pourrait contribuer à la pathogenèse du FXTAS (Qurashi, 2011).

Rm62, une hélicase à ARN à boîte DEAD, complexe avec DSP1 dans des embryons de drosophile

Deux classes principales de protéines, le groupe Polycomb (PcG) et le groupe Trithorax (TrxG), jouent un rôle clé dans la régulation des gènes homéotiques. Ces protéines agissent dans des complexes multimériques pour remodeler la chromatine. Une troisième classe de protéines nommée Enhancers of Trithorax and Polycomb (ETP) module l'activité de TrxG et PcG, mais leur rôle reste largement inconnu. Une protéine de type HMGB, la DSP1 (Dorsal Switch Protein 1), a été classée comme ETP. Des études préliminaires ont révélé que la DSP1 est impliquée dans des complexes multimériques. Cette étude a identifié une hélicase à ARN DEAD-box, Rm62, comme partenaire de DSP1 dans un complexe de 250 kDa. Des tests de co-immunoprécipitation effectués sur des extraits d'embryons indiquent que DSP1 et Rm62 sont associés dans des embryons de 3 à 12 h. De plus, DSP1 et Rm62 colocalisent sur les chromosomes polytènes. Conformément à ces résultats, une mutation dans Rm62 améliore une mutation nulle de dsp1 ainsi que des mutations de trxG ou PcG, suggérant que Rm62 a les caractéristiques d'une ETP. Cette étude montre qu'une ARN hélicase est impliquée dans le maintien des gènes homéotiques (Lamiable, 2010).

Modificateurs génétiques de dFMR1 coder les composants des granules d'ARN chez la drosophile

Les mécanismes de localisation et de traduction des ARNm neuronaux présentent un intérêt biologique considérable. La traduction de l'ARNm régulée dans l'espace contribue aux décisions relatives au destin des cellules et à l'orientation des axones au cours du développement, ainsi qu'à la plasticité synaptique à long terme à l'âge adulte. La protéine Fragile-X Mental Retardation (FMRP/dFMR1) est l'une des molécules de contrôle de la traduction neuronale les mieux étudiées et cette étude décrit l'identification et la caractérisation précoce des protéines susceptibles de fonctionner dans la voie dFMR1. Induction du dFMR1 dans sans sept-l'expression des cellules de l'œil de drosophile provoque un œil désorganisé (rugueux) par un mécanisme qui nécessite les résidus nécessaires à la fonction de répresseur traductionnel de dFMR1/FMRP. Plusieurs mutations dans dco, orbe2, pAbp, rm62, et smD3 les gènes suppriment majoritairement le sev-dfmr1 phénotype de l'œil rugueux, suggérant qu'ils sont nécessaires pour les processus médiés par dFMR1. Les protéines codées se localisent dans les mRNP neuronaux contenant dFMR1 dans les neurites des neurones en culture, et/ou ont un effet sur la ramification dendritique prévue pour authentique répresseurs traductionnels neuronaux. Les analyses de mosaïque génétique indiquent que dco, orbe2, rm62, smD3, et dfmr1 sont dispensables pour le refoulement traductionnel de caché, un gène cible de microARN, connu pour être réprimé dans les disques alaires par le coq nain miARN. Ainsi, les protéines codées peuvent fonctionner comme des régulateurs de traduction spécifiques aux miARN et/ou aux ARNm in vivo (Cziko, 2009).

Il est suggéré que, comme pour les précédents sev-dfmr1 suppresseurs Ago1, Lgl et Me31b, analyse des protéines PABP, Smd3, Rm62, Orb2 et Dco, codées par le sev-dfmr1 Les gènes suppresseurs identifiés dans cette étude aideront à élucider le fonctionnement de dFMR1 dans la régulation traductionnelle, le ciblage et la localisation de l'ARN et la fonction de la voie ncRNA (Cziko, 2009).

Trois éléments de preuve indiquent que les gènes identifiés codent pour des protéines ayant une activité de répresseur traductionnel. Premièrement, à l'exception de Dco, toutes ces protéines ont déjà été impliquées dans certains aspects du métabolisme de l'ARN et sont présentes sur les granules neuritiques contenant dFMR1 dans lesquels l'ARN est réprimé et transporté. Deuxièmement, le phénotype de l'œil rugueux observé dans sev-dfmr1 a été liée à la capacité de FMRP à réprimer la traduction de l'ARNm. Ainsi, on s'attendrait à ce que le phénotype soit atténué par des mutations qui réduisent l'efficacité de la répression traductionnelle. Troisièmement, la surexpression de Dco, Pabp, Orb2 ou Rm62 inhibe la croissance dendritique des neurones, un phénotype prédit pour les répresseurs traductionnels neuronaux. Ces observations sont cohérentes avec l'idée que la traduction des ARN dans les neurites, qui favorise la ramification dendritique, est inhibée par la surexpression de Dco, Pabp, Orb2 ou Rm62. Ainsi, les données d'interaction génétique, la localisation moléculaire et un test fonctionnel dans les dendrites indiquent que Dco/Dbt, PABP, Rm62 ou SmD3 fonctionnent comme des répresseurs traductionnels neuronaux (Cziko, 2009).

L'identification de plusieurs gènes codant des facteurs de traduction canoniques en tant que suppresseurs de sev-dfmr1 met en évidence le fait que les molécules individuelles de contrôle de la traduction fonctionnent dans des complexes à plusieurs composants et ont donc plusieurs interactions fonctionnelles. La PABP est un exemple d'une protéine dont on pense actuellement qu'elle remplit deux fonctions opposées de contrôle de la traduction. En plus de son rôle bien étudié en tant qu'activateur traductionnel, la PABP peut médier la répression traductionnelle, par exemple., de l'ARNm de la vasopressine bien que le mécanisme exact reste incertain. Des rôles doubles dans l'activation et la répression sont également suggérés par l'observation que des niveaux réduits ou élevés de PABP ont des effets similaires au niveau de la jonction neuromusculaire de la drosophile (JNM). De plus, PABP s'associe à des particules contenant BC1, un ARN non codant spécifique aux neurones avec une fonction de répresseur traductionnel, ainsi qu'un complexe CYFIP-FMRP qui peut fonctionner comme répresseur dans certains contextes mais comme activateur dans d'autres. De même, les homologues d'Orb2 (CPEB), bien que requis pour l'activation traductionnelle des ARNm contenant des CPE via la poly-A polymérase, permettent également la répression traductionnelle en combinaison avec les protéines Maskin ou Cup (Cziko, 2009).

Il était quelque peu surprenant que SmD3, un facteur d'épissage, ait été identifié dans un criblage de répresseurs traductionnels. Cependant, SmD3 a des fonctions supplémentaires de non-épissage : dans Caenorhabditis elegans, les protéines Sm sont nécessaires à l'assemblage du mRNP des cellules germinales et à la localisation de l'ARN. Un tel rôle dans la régulation traductionnelle et l'assemblage de mRNP est plus cohérent avec les fonctions prédites par les expériences génétiques (Cziko, 2009).

Rm62/Dmp68 est un membre de la famille des hélicases DEAD-box qui s'est avéré être associé à un complexe de silençage d'ARNi contenant dFMR1. Il a également des rôles supplémentaires au cours de la transcription et du traitement de l'ARNm ainsi que potentiellement dans le traitement des miARN dans le cadre du complexe Drosha. Sur la base des preuves biochimiques de la présence de Rm62 dans les complexes contenant de la FMRP, il n'est pas surprenant que rm62 mutations montrent de fortes interactions génétiques avec dfmr1. Cependant, le mécanisme de suppression reste inconnu (Cziko, 2009).

Enfin, Dco/Dbt est de loin la protéine la plus insaisissable en ce qui concerne sa fonction potentielle dans la voie de régulation traductionnelle. Dco/Dbt, une caséine kinase I (CKI) est mieux connue de la biologie circadienne où elle phosphoryle Per et accélère sa dégradation. La protéine dFMR1 possède plusieurs sites de phosphorylation, dont l'un dans les cellules S2 s'est avéré phosphorylé par une protéine CKII. Alors que l'exigence fonctionnelle de la phosphorylation de dFMR1 dépendante de CKI n'est pas encore comprise, il existe des preuves considérables que l'état de phosphorylation de FMRP peut en fait déterminer son rôle dans la traduction. Les données biochimiques démontrent que la plupart des FMRP dans les granules sont à l'état phosphorylé tandis que FMRP dans la fraction polysome est déphosphorylée, suggérant un mécanisme pour passer d'un état d'activateur à un répresseur, et un rôle régulateur important pour les kinases qui phosphorylent FMRP (Cziko, 2009) .

Un autre lien potentiel intéressant entre les deux protéines est l'observation comportementale selon laquelle les patients atteints de retard mental à l'X fragile présentent souvent des perturbations circadiennes. Ce rythme circadien altéré est également présent chez la drosophile dfmr1 mutants qui modélisent utilement le syndrome de l'X fragile (Cziko, 2009).

L'identification de ces protéines comme sev-dfmr1 modificateurs illustre les nombreux rôles éventuellement régulateurs des protéines associées à l'ARN. De plus, les données associant Dco/Dbt à la régulation de l'ARN indiquent des mécanismes inexplorés et nouveaux de régulation de l'ARN dans les neurones (Cziko, 2009).

Étant donné que dFMR1/FMRP est censé fonctionner dans la répression traductionnelle dépendante des miARN, il était particulièrement intéressant de se demander si ces intéracteurs dFMR1 avaient un rôle dans cette voie. Pour résoudre ce problème, un in vivo test qui utilise un rapporteur fluorescent a été utilisé pour révéler la force de la répression traductionnelle via un endogène (coq nain) miARN. Lorsqu'il est combiné à l'analyse de la mosaïque génétique, ce test peut être utilisé pour étudier les mutations nulles dans les gènes candidats, tant que les mutations ne provoquent pas de létalité cellulaire. Le test semble plus sensible que les tests cellulaires généralement utilisés sur la preuve de l'analyse préalable de Me31B, dont l'exigence pour la fonction miARN, clairement visible dans le in vivo test, n'est évident que dans les expériences de double knockdown dans les tests de culture cellulaire les plus couramment utilisés (Cziko, 2009).

In vivo les expériences n'ont révélé aucune exigence pour le sev-dfmr1 interagissant les protéines Dco, Orb2, Rm62 et SmD3 dans la répression des miARN. Pour les raisons expliquées ci-dessus, il est peu probable que cela reflète une faiblesse dans le dosage expérimental de la fonction miARN. Une plus grande surprise a été la découverte que le dFMR1 lui-même semblait indispensable pour la fonction miARN in vivo. Étant donné que l'allèle utilisé est un allèle nul bien caractérisé et que l'absence de dFMR1 dans les clones mutants est confirmée par coloration d'anticorps, la conclusion selon laquelle dFMR1 n'est pas un composant essentiel et essentiel de la voie RISC/miARN est forte. Cette conclusion n'est incompatible avec aucune des données existantes montrant une association biochimique entre RISC et FMRP et des interactions génétiques entre Ago1 et FMRP. Cependant, cela est également cohérent avec les observations récentes indiquant la dispensabilité de FMRP pour la fonction RISC dans les cellules en culture. Il est suggéré que la fonction de dFMR1 et, par extension, de FMRP peut être restreinte à un sous-ensemble de transcrits, par exemple ceux avec des UTR contenant à la fois des motifs de liaison FMRP et des éléments cibles miARN. En effet, des modèles similaires qui tiennent compte de la spécificité de l'ARNm de FMRP ont déjà été proposés (Cziko, 2009).

Ces données fournissent une base sur laquelle concevoir d'autres expériences pour comprendre les rôles spécifiques de FMR1 et de ses protéines en interaction dans le contrôle de la traduction (Cziko, 2009).

La machinerie d'interférence ARN influence l'organisation nucléaire d'un isolant de chromatine

L'interférence ARN (ARNi) est un mécanisme de silençage conservé qui peut agir par l'altération de la structure de la chromatine. Les isolants de chromatine favorisent l'organisation nucléaire d'ordre supérieur, établissant ainsi des domaines d'ADN soumis à des contrôles transcriptionnels distincts. Des preuves sont présentées pour une relation fonctionnelle entre l'ARNi et l'isolant gitan de la drosophile. L'activité de l'isolateur est diminuée lorsque les gènes Argonaute requis pour l'ARNi sont mutés, et la fonction de l'isolateur est améliorée lorsque les niveaux de l'hélicase Rm62, impliquée dans l'extinction médiée par l'ARN double brin (dsRNA) et la formation d'hétérochromatine, sont réduits. Rm62 interagit physiquement avec la protéine isolante de liaison à l'ADN CP190 d'une manière dépendante de l'ARN. Enfin, la réduction des niveaux de Rm62 entraîne une réorganisation nucléaire marquée d'un isolant compromis. Ces résultats suggèrent que la machinerie ARNi agit comme un modulateur de l'architecture nucléaire capable d'effectuer des changements globaux dans l'expression des gènes (Lei, 2006).

Ces résultats suggèrent l'existence d'une espèce d'ARN requise pour la formation ou l'intégrité des corps isolants, peut-être un produit du traitement par les Argonautes et les autres machines ARNi. L'hélicase à ARN putative Rm62 peut être recrutée dans des complexes isolants par interaction physique avec CP190 et l'ARN. Bien qu'on ne sache pas à quelle étape mécanique Rm62 agit dans l'ARNi, Rm62 peut agir en aval des Argonautes pour dérouler ou remodeler les complexes ARN-protéine isolante, perturbant ainsi l'activité de l'isolant gypsy et l'organisation nucléaire. Une bonne localisation du corps isolant nécessite une matrice nucléaire intacte, et les premières observations ont identifié l'ARN comme un composant important de cet échafaudage nucléaire. Des études futures devraient déterminer l'identité des ARN putatifs associés à l'isolant gitan. Ces résultats suggèrent une fonction auparavant inconnue de la machinerie ARNi dans le contrôle de l'architecture nucléaire pour effectuer des changements dans l'expression des gènes (Lei, 2006).

L'hélicase à ARN de Drosophila P68 régule la désactivation transcriptionnelle en favorisant la libération d'ARN à partir de la chromatine

Mettre fin à l'activité d'un gène nécessite que les transcrits préexistants soient mûris ou détruits et que la structure de la chromatine locale soit ramenée à une configuration inactive. Cette étude montre que l'homologue drosophile de l'hélicase à ARN P68 de mammifère joue un nouveau rôle dans l'exportation de l'ARN et la désactivation des gènes. Les mutations de p68 ressemblent phénotypiquement à des mutations dans petits poils (sbr), l'homologue chez la drosophile du facteur d'exportation d'ARNm humain NXF1. Toute la longueur hsp70 L'ARNm s'accumule dans le noyau près de ses sites de transcription suite au choc thermique des homozygotes p68, et hsp70 l'arrêt des gènes est retardé. Les larves mutantes non stressées présentent des défauts similaires dans l'accumulation de transcrits et la répression des gènes à divers loci. Les mutations de p68 se sont avérées alléliques à Lighten-up, un suppresseur connu de la panachure par effet de position. Ces observations révèlent un lien étroit entre la clairance du transcrit et la répression génique. Le P68 peut être nécessaire pour éliminer rapidement les transcrits d'un gène avant que son activité ne puisse être arrêtée et que sa chromatine ne revienne à un état inactif (Buszczak, 2006).

p68 les animaux mutants désactivent les gènes lentement et de manière incomplète. Ceux-ci incluent les gènes de réponse précoce à l'ecdysone régulés par le développement E74 et E75, les gènes d'ADNr dans le nucléole et de nombreux autres gènes actifs qui cessent normalement la transcription après un choc thermique, et les gènes de réponse au choc thermique eux-mêmes pendant la récupération après un stress. Cette activité génique prolongée dans p68 les animaux mutants semblent normaux en ce qui concerne l'organisation de la chromatine, la production d'ARN et le traitement de l'ARN. Par exemple, longtemps après hsp70 les gènes se sont éteints chez les animaux de type sauvage, hsp70 gènes dans p68 les mutants conservent des niveaux élevés de modification H3phosS10, un facteur de transcription HSF abondant et une ARN polymérase II active, et ils continuent à incorporer Br-UTP dans l'ARN (Buszczak, 2006).

Ces expériences excluent plusieurs explications potentielles de l'activité génique continue dans p68 animaux mutants. Premièrement, le P68 de mammifère a été proposé pour faciliter l'épissage en déroulant l'appariement de bases entre l'ARN U1 et la jonction d'épissage 5'. Ainsi, les effets sur l'arrêt des gènes pourraient être secondaires à un mauvais épissage des régulateurs d'arrêt direct. Cependant, aucune preuve n'a été trouvée que Drosophile P68 affecte l'épissage. Le niveau de non épissé hsp83 les transcriptions n'ont pas augmenté au-delà d'une petite augmentation attribuable à la transcription en cours, pas plus que les non épissés E74 ou E75 les transcrits géniques soient détectés dans p68 mutants. Des gènes dépourvus d'introns tels que hsp70 ont été affectés de la même manière que les gènes contenant des introns. Deuxièmement, le mammifère P68 a été impliqué en tant que régulateur direct de la transcription et pourrait participer à l'activation des gènes cibles de p53 (Bates. 2005). Cependant, Drosophile P68 semble peu susceptible d'agir en tant qu'activateur transcriptionnel, car les gènes affectés étaient divers et indépendants dans leur fonction (y compris le nucléole), et étaient régulés à la hausse plutôt qu'à la baisse (Buszczak, 2006).

Une dernière possibilité est que les effets secondaires de p68 sur la physiologie nucléaire en retour et arrêter l'arrêt du gène. Par exemple, le retard dans la production de HSP70 causé par p68 La mutation pourrait ralentir l'activation de la boucle de rétroaction négative par laquelle les protéines chaperons, notamment HSP70, HSP90 et HSP40, sont proposées pour arrêter normalement l'expression des gènes induite par un choc thermique après élimination du stress. Cependant, il semble hautement improbable que les divers gènes dont l'arrêt dépend de p68 fonction, y compris les gènes de l'ADNr, les gènes de réponse à l'ecdysone et les gènes cellulaires réprimés par le choc thermique, sont tous soumis à une telle régulation par rétroaction. Au lieu de cela, les preuves disponibles soutiennent fortement que P68 fonctionne directement en arrêtant l'activité des gènes, et conformément à une telle action directe, il a été observé que l'abondance de P68 augmente sur les loci avant et pendant le processus d'arrêt (Buszczak, 2006).

Comment, alors, un rôle direct de P68 dans l'arrêt du gène est-il lié à la fonction supplémentaire d'exportation d'ARN observée pour cette molécule ? Perte de fonction p68 Les mutations entraînent des anomalies des poils et des ovaires similaires à celles observées dans sbr mutants, un composant connu de la machinerie d'exportation d'ARN. p68 les animaux mutants accumulent de l'ARN sur des sites de transcription dispersés à de nombreux endroits autour du génome. De plus, les nouvelles transcrites et traitées hsp70 les transcrits s'accumulent sur le site de transcription pendant des périodes prolongées, provoquant un retard prononcé dans la traduction de HSP70. Ces résultats suggèrent que P68 fonctionne à une étape très précoce de l'exportation d'ARN, ou à une nouvelle étape avant l'exportation qui est nécessaire pour effacer les transcrits terminés de leurs sites de transcription (Buszczak, 2006).

Au cours de la transcription, diverses protéines qui interviennent dans l'élongation transcriptionnelle, le traitement de l'ARN et l'exportation de l'ARN enrobent les transcrits naissants pour former de grands complexes ribonucléoprotéiques (mRNP). Les travaux dans une variété d'organismes suggèrent que l'assemblage de ces mRNP est soumis à des contrôles de qualité stricts. La perturbation du traitement de l'ARN ou l'association de facteurs d'exportation avec des transcrits entraîne une accumulation d'ARN au niveau des loci des gènes et l'activation de la voie de surveillance de l'ARN. Les transcrits défectueux sont ciblés pour la dégradation par l'exosome, un complexe de RNAse multi-sous-unités conservé au cours de l'évolution. L'exosome s'associe à des facteurs d'élongation et se localise dans des gènes activement transcrits dans Drosophile, ce qui suggère que les transcriptions sont constamment surveillées pour détecter les défauts. Fait intéressant, des mutations dans le rrp6p Le gène de l'exosome entraîne non seulement la stabilisation des ARN, mais également leur libération inappropriée de la chromatine. Ces résultats suggèrent que l'exosome attache les transcrits à la chromatine et garantit que seuls les ARN correctement traités sont libérés pour l'exportation. P68 peut fonctionner en interagissant avec des transcrits naissants d'une manière qui confère à un transcrit la compétence de quitter son site de synthèse et de subir un transport vers les pores nucléaires. Cette étape sensible à P68 agirait comme un point de contrôle pour la libération finale d'un transcrit terminé dans le nucléoplasme (Buszczak, 2006).

L'idée est favorisée que l'exigence de P68 pour l'arrêt du gène peut être expliquée par son rôle proposé en tant que médiateur de la libération du transcrit. Il existe deux mécanismes généraux par lesquels les transcrits naissants sur le site d'un gène actif pourraient empêcher la désactivation de la transcription. Premièrement, certains cofacteurs transcriptionnels à action positive s'associent aux transcrits naissants plutôt que de rester dans les régions promotrices ou amplificatrices. Les facteurs liés au transcrit resteraient à des concentrations locales très élevées par rapport à ceux qui se dissocient dans le nucléoplasme avant de se relier. On s'attendrait à ce que des transcriptions portant de tels facteurs favorisent l'activité continue des gènes, dans le cadre d'un équilibre de mécanismes agissant positivement et négativement qui déterminent le taux instantané d'activité transcriptionnelle. Pendant la répression, la libération d'ARN régulée à la hausse par P68 abaisserait la concentration locale de ces facteurs et aiderait à déplacer l'équilibre vers un état qui favorise la désactivation des gènes (Buszczak, 2006).

L'activité des gènes est également contrôlée par l'état de décondensation de la chromatine. La décondensation est corrélée à des niveaux élevés d'acétylation des histones et à la modification de l'ADP-ribose, et ces modifications doivent être inversées pour achever la fermeture du gène. La présence de mRNP volumineux autour d'un gène pourrait simplement empêcher la chromatine de se réassembler dans l'état très compact caractéristique des gènes inactifs. Les transcrits et leurs complexes protéiques associés pourraient également être inhibiteurs des processus de remodelage de la chromatine en raison d'interactions protéine-protéine spécifiques. Le ciblage de P68 supplémentaire vers des gènes au début de l'arrêt du gène pourrait stimuler l'exportation des transcrits restants qui contrecarreraient le processus de répression (Buszczak, 2006).

Plusieurs gènes au sein d'une région chromosomique sont parfois fermés de manière coordonnée par le processus de formation de l'hétérochromatine. La capacité de p68 stimuler la désactivation des gènes via la libération de transcrits peut jouer un rôle dans la formation de l'hétérochromatine ainsi que dans la fermeture de gènes individuels, car p68/Lèvre a été précédemment identifié comme un suppresseur de la panachure de l'effet de position (Csink. 1994). Cela suggère que l'élimination des transcrits peut être une partie importante de la formation et de la propagation de l'hétérochromatine. Il a été démontré que la voie ARNi facilite le silençage hétérochromatique. Drosophile P68 a été trouvé dans un complexe avec Argonaute2, suggérant qu'il pourrait interagir directement avec la machinerie ARNi (Ishizuka, 2002). Il pourrait y avoir un lien mécanistique entre la fonction de P68 dans la clairance du transcrit et de la voie ARNi dans la promotion de l'extinction des gènes (Buszczak, 2006).

L'ARNi est une réponse immunitaire antivirale contre un virus à ARNdb chez Drosophila melanogaster

La drosophile possède un système immunitaire inné robuste et efficace, qui réagit aux infections allant des bactéries aux champignons et, comme on l'a découvert récemment, aux virus. Les réponses immunitaires connues de la drosophile reposent sur des activités humorales et cellulaires, similaires à celles trouvées dans le système immunitaire inné d'autres animaux. Récemment, l'ARNi ou «RNA silencing» est apparu comme un moyen possible par lequel la drosophile peut réagir à des agents pathogènes, des transposons et des éléments rétroviraux spécifiques, d'une manière similaire à celle d'un système immunitaire adaptatif de mammifère traditionnel au lieu d'un génome plus généralisé. réponse immunitaire innée codée. L'ARNi est un mécanisme de régulation et de défense hautement conservé, qui supprime l'expression des gènes via une dégradation ciblée de l'ARN dirigée soit par l'ARNdb exogène (clivé en siARN) soit par des miARN endogènes. Chez les plantes, l'ARNi s'est avéré agir comme un système de réponse immunitaire antivirale. Cette étude montre que l'ARNi est une réponse antivirale utilisée par la drosophile pour lutter également contre l'infection par le virus Drosophila X, un birnavirus. De plus, plusieurs gènes de la voie ARNi de base, y compris piwi, gène vasa intronique (vig), aubergine (aub), armitage (armi), Rm62, r2d2 et Argonaute2 (AGO2) ont été identifiés comme ayant un rôle vital dans cette réponse dans les organismes entiers. Ces résultats font de la drosophile un modèle idéal pour l'étude des réponses antivirales à l'ARNi chez les animaux (Zambon, 2006).

Une protéine X fragile de Drosophila interagit avec des composants de l'ARNi et des protéines ribosomiques

Chez la drosophile, Fmr1 se lie à et réprime la traduction d'un ARNm codant pour la protéine Futsch associée aux microtubules. Un complexe associé à Fmr1 a été isolé qui comprend deux protéines ribosomiques, L5 et L11, ainsi que l'ARN 5S. Le complexe Fmr1 contient également Argonaute2 (AGO2) et un homologue Drosophila de l'hélicase à ARN p68 (Dmp68). AGO2 est un composant essentiel du complexe de silençage induit par l'ARN (RISC), un complexe de nucléase spécifique à une séquence qui médie l'interférence ARN (ARNi) chez la drosophile. Dmp68 est également nécessaire pour une ARNi efficace. Fmr1 est associé à Dicer, un autre composant essentiel de la voie ARNi, et aux microARN (miARN) in vivo, suggérant que Fmr1 fait partie de l'appareil lié à l'ARNi. Ces résultats suggèrent un modèle dans lequel les voies de contrôle traductionnel médiées par l'ARNi et Frm1 se croisent chez la drosophile. Les résultats soulèvent également la possibilité que des défauts dans une machinerie liée à l'ARNi puissent provoquer une maladie humaine (Ishizuka, 2002).

L'identification d'AGO2 en tant que protéine interagissant avec Fmr1 est particulièrement frappante. AGO2 est un membre de la famille des gènes Argonaute et est un composant essentiel du complexe de silençage induit par l'ARN (RISC), un complexe de nucléase spécifique à une séquence qui médie l'ARNi chez la drosophile. Par conséquent, la découverte que Fmr1 forme un complexe in vivo avec AGO2 suggère que Fmr1 peut fonctionner dans l'ARNi. Pour tester cela, l'ARNi a été utilisé pour supprimer les protéines endogènes, comme cela avait été fait auparavant pour établir un rôle pour AGO2 dans l'ARNi. La suppression des protéines ribosomiques L5 et L11 avec des ARNdb spécifiques a rendu les cellules S2 si malades que leurs rôles dans l'ARNi n'ont pas pu être évalués. Cependant, le traitement des cellules S2 avec des ARNdb homologues à AGO2, Fmr1 ou Dmp68 réduit considérablement les niveaux de ces protéines. La capacité de ces cellules à réaliser l'ARNi a été testée par transfection avec un plasmide d'expression de protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) en combinaison avec un ARNdb EGFP. La suppression de l'expression d'AGO2 est en corrélation avec une réduction prononcée de la capacité des cellules à faire taire le rapporteur EGFP par l'ARNi. Fait intéressant, l'ARNi ciblant Dmp68 entraîne une inhibition de l'ARNi dans les cellules S2. Ces résultats suggèrent que l'hélicase DEAD-box Dmp68 non seulement interagit avec Fmr1, mais est également nécessaire pour un ARNi efficace dans les cellules S2. Dmp68 est un orthologue drosophile de la p68 humaine, dont il a été démontré qu'il déroule les ARNdb courts mais pas longs d'une manière dépendante de l'ATP. Il est conclu qu'au moins deux des protéines interagissant avec Fmr1, AGO2 et Dmp68, sont nécessaires pour l'ARNi dans les cellules de Drosophila S2 en culture. En revanche, l'épuisement de Fmr1 n'a pas semblé affecter le silence EGFP. Par conséquent, bien que Fmr1 interagisse fortement avec AGO2 et Dmp68 in vivo, Fmr1 ne semble pas être essentiel pour une ARNi efficace (Ishizuka, 2002).

Des travaux récents dans de nombreux organismes ont montré que l'ARNi partage des caractéristiques avec un mécanisme de régulation des gènes du développement qui implique des miARN. On pense que ces petits ARN (siARN et miARN) sont incorporés dans des complexes de silençage qui interviennent respectivement dans la destruction de l'ARNm au cours de l'ARNi et le contrôle de la traduction au cours du développement. Par conséquent, il est suggéré qu'une machinerie de traitement commune génère des ARN guides qui médient à la fois l'ARNi et la régulation des gènes endogènes. AGO2 et Dmp68 sont essentiels pour l'ARNi chez la drosophile. Cependant, Fmr1 semble être un répresseur de traduction. Étant donné que Fmr1 interagit avec AGO2 et Dmp68 in vivo, il était intéressant d'examiner si Fmr1 est également présent dans un complexe associé à AGO2 et/ou Dmp68. Pour ce faire, AGO2 (AGO2-TAP) ou Dmp68 (Dmp68-TAP) marqué par TAP ont été exprimés dans des cellules S2. Un lysat cytoplasmique des cellules exprimant AGO2-TAP ou Dmp68-TAP a été préparé et soumis à des purifications TAP. Dans des essais réciproques, Fmr1 et AGO2 endogènes se sont avérés s'associer. De plus, AGO2 endogène a été copurifié avec AGO2-TAP. Fmr1 et AGO2 endogènes se sont également avérés présents dans le complexe associé à Dmp68. Comme AGO2 peut être co-immunoprécipité avec Dicer, qui initie l'ARNi en transformant les déclencheurs de silençage de l'ARNdb en siARN, et en transformant également les précurseurs de miARN en miARN matures, la possibilité a été envisagée que Fmr1 puisse également interagir physiquement avec Dicer. En effet, Dicer endogène peut être copurifié non seulement avec AGO2-TAP mais aussi avec Fmr1-TAP, et il a également été montré que Fmr1 reste associé à AGO2 après induction par ARNi. Il est bien établi que les siARN s'associent à AGO2 pendant l'ARNi dans les cellules S2. Par conséquent, ces résultats indiquent que Fmr1 peut faire partie de RISC. Enfin, de manière analogue au complexe associé à l'orthologue humain AGO2 (eIF2C2) qui contient une hélicase à ARN de type DEAD-box et des miARN, il était intéressant de tester si les miARN sont également présents dans les complexes associés à AGO2 et/ou Fmr1. Les molécules d'ARN copurifiées avec AGO2-TAP ou Fmr1-TAP ont été récupérées, dissoutes sur un gel dénaturant de polyacrylamide à 15 % et soumises à une analyse par transfert de Northern. Un miARN connu, miR-2b, dans les cellules de Drosophila S2 a pu être détecté à la fois dans les complexes associés à AGO2 et à Fmr1. Ensemble, ces données montrent que Fmr1 est présent dans un complexe avec des composants d'ARNi et de miARN dans des cellules cultivées de drosophile S2 (Ishizuka, 2002).

On pense que Fmr1 joue un rôle important dans la traduction de certains ARNm spécifiques tels que l'ARNm de futsch. Bien qu'il ne soit pas clair comment Fmr1 régule la traduction de ces ARNm, ces découvertes peuvent contenir quelques indices.Étant donné que Fmr1 interagit avec l'ARNr ribosomique L5/5S et L11, qui sont tous situés au sommet de la sous-unité ribosomique 60S, il est probable que cette interaction amène Fmr1 à la sous-unité ribosomique 60S. Par conséquent, l'association de Fmr1 avec la sous-unité ribosomique 60S par le biais d'interactions directes avec l'ARNr ribosomique L5/5S et L11 peut inhiber la traduction en empêchant l'assemblage de complexes d'initiation ou en provoquant un changement structurel des ribosomes, qui, à son tour, influence un étape(s) après le début de la traduction. Alternativement, étant donné que l'ARNr 5S est la seule espèce d'ARN connue qui se lie aux protéines ribosomiques, y compris L5, et forme un RNP 5S avant d'être incorporé dans les ribosomes, Fmr1 peut interagir avec le RNP 5S cytoplasmique non associé aux ribosomes, qui, à son tour, influence la formation de la sous-unité ribosomique 60S mature. Il est intéressant de noter dans ce contexte que seulement environ la moitié des molécules d'ARNr 5S dans les cellules de mammifères sont associées à la sous-unité ribosomique 60S et que bien que l'ARNr 5S améliore l'activité ribosomique, il n'est pas absolument essentiel pour cela (Ishizuka, 2002).

Fmr1 est présent dans un complexe isolé des cellules S2, qui contient également AGO2 et Dicer. AGO2 et Dicer sont des composants essentiels de l'ARNi. L'interaction entre Fmr1 et AGO2 reste constante avant et après l'induction d'ARNi, suggérant que Fmr1 fait partie de RISC pendant l'ARNi. Cependant, il n'y a aucune preuve pour soutenir l'idée que la formation de RISC est induite par le traitement des cellules S2 avec l'ARNdb. Comme l'une des fonctions de l'appareil ARNi est de faire taire les transposons et les séquences répétitives résidant naturellement dans le génome de la drosophile, ces cellules sont donc susceptibles d'être pleines de complexes RISC préformés, quel que soit le traitement par ARNdb. Par conséquent, il est possible que Fmr1 fasse partie des complexes RISC préformés et continue de faire partie du RISC actif après le déroulement de l'ARNsi dépendant de l'ATP (Ishizuka, 2002).

L'implication d'une autre protéine interagissant avec Fmr1, Dmp68, dans l'ARNi suggère en outre l'association étroite de Fmr1 avec l'ARNi. L'hélicase à ARN p68 a été identifiée pour la première fois par réaction croisée avec un anticorps monoclonal qui a été initialement dirigé contre le grand antigène T du SV40 il y a deux décennies. L'hélicase joue un rôle important dans la prolifération cellulaire et la maturation des organes et appartient à une grande famille de protéines hautement conservées au cours de l'évolution, la famille dite DEAD-box des ATPases et hélicases putatives. Des études récentes ont révélé que plusieurs hélicases à ARN, y compris mut6, SDE3, mut14, drh-1 et fuseau-E sont nécessaires pour l'ARNi et les voies de silençage génique post-transcriptionnel (PTGS) associées. Dmp68 est similaire, mais clairement pas un orthologue de ces protéines. Par conséquent, le Dmp68 est un nouveau composant de l'ARNi. Étant donné que le déroulement dépendant de l'ATP du duplex siARN remodèle le RISC pour générer un RISC actif dans la voie ARNi, Dmp68 peut arbitrer le processus de déroulement. Il est également concevable que le Dmp68 puisse être impliqué dans des événements en aval tels que la reconnaissance d'ARN cible, en tant que chaperon d'ARN ou RNPase (Ishizuka, 2002).

La connexion qui a été établie entre Fmr1, les composants de l'ARNi, les miARN et la machinerie générale de traduction est d'une importance considérable car ils fournissent des indices intrigants et des connexions possibles à la fonction de Fmr1 et aux voies avec lesquelles il peut se croiser. Des travaux récents dans de nombreux organismes ont montré que l'ARNi partage des caractéristiques avec un mécanisme de régulation des gènes du développement qui implique des miARN. Par exemple, les ARNdb étrangers qui déclenchent l'ARNi et les précurseurs de miARN endogènes qui fonctionnent dans le développement sont transformés en petits ARN par Dicer. Les membres de la famille des gènes Argonaute sont également impliqués dans les voies siRNA et miRNA. Dans C. elegans, Dicer, la protéine de liaison à l'ARNdb RDE-4 et une hélicase à ARN à boîte DExH conservée (DRH-1) sont dans un complexe avec RDE-1, un orthologue AGO2. De plus, l'orthologue AGO2 humain, eIF2C2, se trouve dans un complexe, le miRNP, qui contient l'hélicase à ARN à boîte DEAD Gem3. Par conséquent, les protéines Argonaute semblent être dans un complexe qui contient une ou plusieurs hélicases à ARN, Dicer et de petits ARN guides, et fonctionnent dans une variété de mécanismes dépendants de l'homologie qui impliquent l'appariement de bases entre les petits ARN guides et les ARNm cibles. Les découvertes selon lesquelles Fmr1 interagit avec AGO2, Dmp68, Dicer, les miARN et la machinerie de traduction générale, fournissent un moyen de lier les enzymes ARNi aux voies de contrôle de la traduction, et sont également cohérentes avec le fait que la nucléase RISC se fractionne avec les ribosomes (Ishizuka, 2002 ).

Il semble que Fmr1 soit important pour le contrôle de la traduction, éventuellement médié par des composants et des miARN liés à l'ARNi. Bien que des études récentes aient identifié une liste d'ARNm qui sont des cibles potentielles de FMRP, ces résultats suggèrent en outre un modèle dans lequel FMRP peut ne pas se lier directement à ses cibles d'ARNm, mais plutôt cibler ses substrats d'ARNm dans le cadre d'appareils liés à l'ARNi, qui sont guidés par des miARN. Comment FMRP pourrait-il alors réguler la traduction de ses cibles d'ARNm ? Dans le cas de lin-4, un prototype de miARN, ses cibles d'ARNm (lin-14 et lin-28) sont réprimées traductionnellement mais restent associées aux polyribosomes, suggérant un blocage à une étape après l'initiation de la traduction. FMRP peut former un complexe miRNP sur ses cibles d'ARNm et l'association de ce complexe avec l'ARNr ribosomique L5/5S et L11 peut inhiber la traduction à une ou plusieurs étapes post-initiation, y compris l'élongation, la terminaison ou la libération de protéine fonctionnelle comme discuté ci-dessus. Enfin, il est proposé que le syndrome de l'X fragile puisse être le résultat d'une anomalie de la synthèse des protéines causée par un ou plusieurs défauts d'un appareil lié à l'ARNi (Ishizuka, 2002).

Le gène Lighten up (Lip) de Drosophila melanogaster, un modificateur de l'expression des rétroéléments, de la panachure de l'effet de position et des allèles d'insertion du locus blanc

Cette étude visait à identifier les mutations d'un seul gène impliquées dans la régulation de la posologie agissant en trans afin de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans les syndromes aneuploïdes, divers types de compensation posologique ainsi que dans les mécanismes de régulation. Le gène Lighten up (Lip) chez Drosophila melanogaster a été identifié dans un criblage mutagène pour détecter les modificateurs dominants du second site de sang blanc (wbl), un allèle induit par un rétrotransposon du locus de la couleur des yeux blancs. Lip améliore spécifiquement le phénotype de wbl ainsi qu'un sous-ensemble d'autres allèles d'insertion de rétroéléments de blanche, y compris l'allèle induit par copia, blanc-abricot (wa), et six allèles causés par l'insertion d'éléments I. Six allèles ont été identifiés de Lip qui sont tous mortels récessifs, bien que des échappés hétéroalléliques phénotypiquement additifs aient été récupérés dans certaines combinaisons. Lip supprime également la panachure de l'effet de position, indiquant qu'il peut avoir un rôle dans la configuration de la chromatine. De plus, Lip modifie l'abondance totale des transposons du sang et des rétrotransposons de copia, ayant un effet inverse sur le niveau à l'état d'équilibre des transcrits sanguins, tout en montrant un effet non additif sur l'ARN de copia (Csink, 1994). Fonctions des orthologues Rm62 chez d'autres espèces

La protéine DEAD box p68 : un nouveau coactivateur transcriptionnel du suppresseur de tumeur p53

L'hélicase à ARN à boîte DEAD, p68, a été impliquée dans divers processus cellulaires et il a été démontré qu'elle possède une fonction de coactivateur transcriptionnel. Cette étude montre que p68 est en synergie puissante avec la protéine suppresseur de tumeur p53 pour stimuler la transcription à partir de promoteurs dépendants de p53 et que p68 et p53 endogènes co-immunoprécipitent à partir d'extraits nucléaires. Étonnamment, la suppression de l'ARNi de p68 inhibe l'expression du gène cible de p53 en réponse aux dommages à l'ADN, ainsi que l'apoptose dépendante de p53, mais n'influence pas la stabilisation de p53 ou l'expression de gènes ne répondant pas à p53. L'immunoprécipitation de la chromatine a démontré que p68 est recruté dans le promoteur p21 d'une manière dépendante de p53, compatible avec un rôle dans la promotion de l'initiation de la transcription. Fait intéressant, le knock-down de p68 n'affecte pas significativement l'activation de NF-kappaB, ce qui suggère que la stimulation de l'activité transcriptionnelle de p53 n'est pas due à un effet de transcription général. Cette étude représente le premier rapport de l'implication d'une ARN hélicase dans la réponse p53, et met en évidence un nouveau mécanisme par lequel p68 peut agir comme un cosuppresseur tumoral en gouvernant l'activité transcriptionnelle de p53 (Bates, 2005).

Médiation de l'isolation transcriptionnelle du CTCF par la protéine p68 de liaison à l'ARN de la boîte DEAD et l'activateur d'ARN du récepteur stéroïde SRA

Le facteur de liaison au CCCTC (CTCF) est une protéine de liaison à l'ADN qui joue un rôle important dans l'organisation de la chromatine, bien que le mécanisme par lequel le CTCF exécute ces fonctions ne soit pas entièrement compris. Des études récentes montrent que le CTCF recrute le complexe de cohésine sur les sites isolants et que la cohésine est nécessaire à l'activité de l'isolant. Cette étude montre que la DEAD-box RNA hélicase p68 (DDX5) et son ARN non codant associé, l'activateur d'ARN des récepteurs stéroïdes (SRA), forment un complexe avec le CTCF qui est essentiel pour la fonction d'isolateur. p68 a été détecté au niveau des sites CTCF dans la région de contrôle imprimée IGF2/H19 (ICR) ainsi que d'autres sites CTCF génomiques. L'épuisement in vivo de SRA ou de p68 a réduit l'activité de l'isolant médié par le CTCF à l'ICR IGF2/H19, augmenté les niveaux d'expression d'IGF2 et augmenté les interactions entre l'amplificateur endodermique et le promoteur IGF2. p68/SRA interagit également avec les membres du complexe de la cohésine. L'épuisement de p68 ou de SRA n'affecte pas la liaison du CTCF à ses sites génomiques, mais réduit la liaison de la cohésine. Les résultats suggèrent que p68/SRA stabilise l'interaction de la cohésine avec le CTCF en se liant aux deux, et est nécessaire pour une fonction isolante appropriée (Yao, 2010).

Bates, G.J., Nicol, S.M., Wilson, B.J., Jacobs, A.M., Bourdon, J.C., Wardrop, J., Gregory, D.J., Lane, D.P., Perkins, N.D. et Fuller-Pace, F.V. (2005). La protéine DEAD box p68 : un nouveau coactivateur transcriptionnel du suppresseur de tumeur p53. EMBO J 24 : 543-553. Identifiant PubMed : 15660129

Boeke, J., Bag, I., Ramaiah, M. J., Vetter, I., Kremmer, E., Pal-Bhadra, M., Bhadra, U. et Imhof, A. (2011). L'hélicase à ARN Rm62 coopère avec Su(var)3-9 pour résilier la transcription active chez Drosophila melanogaster. PLoS One 6 : e20761. Identifiant PubMed : 21674064

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Cziko, A. M., McCann, C. T., Howlett, I. C., Barbee, S. A., Duncan, R. P., Luedemann, R., Zarnescu, D., Zinsmaier, K. E., Parker, R. R. et Ramaswami, M. (2009). Les modificateurs génétiques de dFMR1 codent pour les composants des granules d'ARN chez la drosophile. Génétique 182 : 1051-1060. Identifiant PubMed : 19487564

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Comment déduire si une infection par un virus à ARN ou une infection par un virus à ADN - Biologie

NKX3.1 code pour un facteur de transcription homéodomaine dont l'expression est largement restreinte à la prostate et contrôlée par les androgènes. Le gène est situé sur le chromosome 8p21 dans une région fréquemment délétée dans les cancers de la prostate précoces (examiné dans 1, 2). Des études sur des souris knock-out Nkx3.1 ont fourni des preuves convaincantes que Nkx3.1 est un suppresseur de tumeur de la prostate 3 – 5 . Ces souris développent une néoplasie intraépithéliale prostatique (PIN), une lésion précancéreuse caractérisée par une hyperprolifération de cellules dysplasiques, indiquant que Nkx3.1 est haplo-insuffisant pour la suppression de PIN 6 . Des études supplémentaires ont montré que le passage en série de lésions de type PIN de souris mutantes Nkx3.1 peut subir des altérations histopathologiques progressivement sévères 5 . Enfin, la perte de Nkx3.1 peut coopérer avec la perte de Pten et de p27 dans le développement du cancer de la prostate chez la souris 7, 8, tandis que la surexpression de Nkx3.1 inhibe la prolifération cellulaire dans les greffes épithéliales nulles de Pten 9 . Ces données indiquent que l'expression diminuée de NKX3.1 qui est fréquemment observée dans les cancers de la prostate humains 10 est impliquée dans le stade initial de la carcinogenèse de la prostate. Alors que la fonction suppresseur de tumeur de NKX3.1 reste mal définie au niveau moléculaire, les phénotypes knock-out suggèrent que Nkx3.1 contrôle les gènes impliqués dans le développement, la différenciation et le maintien de l'intégrité tissulaire de la prostate.

Comme les autres homéoprotéines de la classe NKX, NKX3.1 peut fonctionner comme un répresseur transcriptionnel en se liant à un motif d'ADN homéodomaine non canonique tel que naturellement présent dans le promoteur du récepteur aux androgènes de souris 9 ou présenté artificiellement dans les gènes rapporteurs synthétiques 11 . La répression transcriptionnelle peut impliquer le recrutement médié par NKX3.1 des co-répresseurs 12 et l'histone désacétylase, HDAC1 9 . Un deuxième mode de trans-répression trouvé pour le gène de l'antigène prostatique spécifique (PSA) se produit indépendamment des sites de liaison du promoteur NKX3.1, mais via une interaction répressive avec des activateurs transcriptionnels tels que SP1 13 et le facteur ETS dérivé de la prostate (PDEF 14). Il a également été démontré que NKX3.1 active la transcription des gènes, soit par liaison directe au promoteur comme dans le cas de PCAN1 et HK2 15, 16, soit par interaction avec d'autres activateurs transcriptionnels tels que le facteur de réponse sérique (SRF) ou FoxA1 et le récepteur aux androgènes (AR ) 17 , 18 .

Le profilage transcriptomique combiné à la cartographie globale de > 9 500 sites de liaison génomique par séquençage ChIP a révélé un ensemble de 282 gènes cibles directs putatifs qui étaient exprimés de manière différentielle dans les jeunes prostates NKX3.1 -/- ne présentant pas de PIN 16, 19. Un sous-ensemble de gènes cibles NKX3.1 a également été régulé par Myc avec les deux facteurs de transcription montrant un antagonisme mutuel 16 . Étant donné que la surexpression de Myc coopère avec la perte de Nkx3.1 dans la tumorigenèse de la prostate chez la souris, le maintien d'un contrôle approprié des gènes cibles Nkx3.1/Myc communs peut être impliqué dans la fonction suppresseur de tumeur Nkx3.1's 16. Une étude similaire chez des souris âgées présentant déjà un PIN a révélé une signature d'expression génique indiquant une réponse altérée au stress oxydatif 20 . Fait intéressant, ces changements étaient en corrélation avec une augmentation de 5 fois des dommages oxydatifs à l'ADN dans les prostates Nkx3.1 -/-. On ne sait pas si les dommages oxydatifs à l'ADN sont une conséquence directe de la perte de NKX3.1 ou une conséquence secondaire du développement de PIN.

Une autre clé pour comprendre la fonction suppresseur de tumeur de NKX3.1 réside potentiellement dans ses partenaires d'interaction protéique. Plusieurs ont été décrits qui modulent les effets transcriptionnels de NKX3.1’s (par exemple SRF 17 , 21 , PDEF 14 , HDAC1 9 , SP1 13 , MYC 16 et AR 18 ). En outre, NKX3.1 s'est avéré se lier à et augmenter l'activité de la topoisomérase I, suggérant qu'elle fonctionne dans la réparation de l'ADN 22, 23. NKX3.1 se localise sur les sites de dommages à l'ADN, favorise l'activité ATM et ATR et améliore la survie des cellules exposées à des dommages à l'ADN 24 . La perte de la fonction NKX3.1 dans les cellules précancéreuses de la prostate peut donc accélérer l'acquisition de dommages à l'ADN, potentiellement aggravés par l'accumulation ininterrompue d'espèces réactives de l'oxygène, favorisant ainsi la transformation cellulaire 24 . Néanmoins, il est actuellement difficile de savoir si la fonction de NKX3.1 dans la réparation de l'ADN est indirectement médiée par des effets transcriptionnels ou directement par des interactions physiques avec la machinerie de réparation de l'ADN.

Dans ce rapport, nous présentons une analyse de l'interactome de la protéine NKX3.1 qui a révélé des liens physiques intimes de NKX3.1 avec la machinerie de réparation de l'ADN, à savoir les composants de l'holocomplexe de la protéine kinase dépendante de l'ADN (DNA-PK) (XRCC5/Ku80, XRCC6/Ku70) et la poly(ADP) ribose polymérase (PARP1). En outre, le profilage transcriptomique des cellules épithéliales de la prostate immortalisées lors de l'activation aiguë de NKX3.1 a révélé une réponse transcriptionnelle rapide et complexe qui est une image miroir proche de la signature d'expression génique du PIN humain dépourvu de NKX3.1. Prises ensemble, ces données jettent un nouvel éclairage sur l'activité insaisissable de suppression de tumeur de NKX3.1, impliquant directement cette homéoprotéine dans la réparation de l'ADN et dans la conduite d'une signature d'expression génique indiquant une fonction essentielle dans le maintien de l'état de différenciation des cellules épithéliales luminales de la prostate.

Matériels et méthodes Culture de tissus, plasmides, virus, anticorps

La lignée cellulaire de cancer de la prostate humaine LNCaP a été obtenue auprès de l'ATCC et maintenue dans du RPMI 1640 (Hyclone, Cat.# SH30027.01) supplémenté avec 10 % de sérum bovin foetal (Sigma, Cat.# F6178-500ML), 50 unités/ml de pénicilline, et 50 unités/ml de streptomycine (Thermo Scientific HyClone, Cat.# SV30010). L'ADNc de NKX3.1 a été amplifié à partir de l'ARNm de LNCaP, la séquence a été confirmée et cloné dans pFLAG, attachant ainsi trois marqueurs d'épitope FLAG consécutifs à l'extrémité N-terminale. Pour la transfection d'ADN, les cellules LNCaP ont été cultivées à 50 % de confluence sur une boîte de 150 mm et transfectées avec 30 % d'ADN plasmidique en utilisant le réactif DOTAP selon les recommandations du fabricant (Roche, Indianapolis, IN). Des cellules épithéliales humaines de la prostate immortalisées (cellules LH, aimablement fournies par le Dr W. Hahn 25) ont été conservées dans des milieux de base de cellules épithéliales de la prostate (Lonza, Cat.# CC-3165) comprenant des facteurs de croissance, des cytokines et des suppléments (PREGM Singlequots, Lonza , n° de catalogue CC-4177).

Pour la production d'adénovirus, le système ADEASY a été utilisé comme décrit précédemment 26 . L'ADNc de NKX3.1 a été cloné dans le vecteur navette pADTRACK1. Le plasmide résultant a été transformé dans des cellules BJ-ADEASY par électroporation. L'ADN adénoviral généré par recombinaison dans des cellules BJ-ADEASY a été isolé et transfecté dans des cellules 293 (ATCC) en utilisant des procédures standard au phosphate de calcium. Le virus a été récolté à partir des cellules et amplifié par infection de 293 cellules. Le virus amplifié a été titré et utilisé à une multiplicité d'infections de

Les anticorps suivants ont été utilisés : monoclonal de souris Flag (Sigma-Aldrich Cat# F1804, RRID:AB_262044), monoclonal de souris NKX3.1 pour immunoblot (Invitrogen Cat# 35-9700, RRID:AB_138690), polyclonal de chèvre anti-humain NKX3.1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Cat# sc-15022, RRID:AB_650285) pour l'immunoprécipitation, GFP monoclonal de souris (Clontech Cat# 632380, RRID:AB_10013427), actine de souris monoclonal (MP Biomedicals, Irvine, CA, Cat.# ICN691001) , polyclonal de lapin BANF (EMD Millipore Cat# 09-893, RRID:AB_1977041), monoclonal de souris Ku70 (GeneTex Cat# GTX23114, RRID:AB_367103), monoclonal de souris Ku80 (GeneTex Cat# GTX72225, RRID:AB_383445 ), polyclonal de lapin MYC ( Epitomics Cat# 1472-1, RRID:AB_562270), lapin monoclonal p21 (Cell Signaling Technology Cat# 2947S, RRID:AB_823586), lapin polyclonal HSPA8 (Sigma-Aldrich Cat# SAB2101098, RRID:AB_10604580), souris PARP monoclonal (BD Biosciences Cat# 556494, RRID:AB_396433), polyclonal de lapin HOXB13 (Invitrogen Cat# 422500, RRID:AB_1500227).

Purification par affinité FLAG-NKX3.1

Les cellules d'une boîte de 150 mm transfectées avec pFLAF-NKX3.1 ou un vecteur vide ont été lysées dans chaque 1 ml de tampon de lyse IP (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X 100) sur de la glace. Par purification par affinité, 4 µg d'anticorps FLAG M2 (Sigma-Aldrich Cat # F1804, RRID:AB_262044) ont été couplés à 50 μl de billes magnétiques dans 0,2 M de triéthanolamine, pH 8,2 et 20 mM de pimelimidate de diméthyle avec mélange rotatif à température ambiante pendant 30 minutes. La réaction a été arrêtée en remettant en suspension les billes dans 1 ml de Tris 50 mM, pH 7,5 pendant 15 min. Après cinq lavages dans du tampon de lyse IP, les billes ont été ajoutées au lysat cellulaire. Après incubation pendant 4 h à 4 °C, le lysat a été retiré et stocké sous forme de lysats appauvris à -20 °C, tandis que les billes ont été lavées 5 fois avec 1 ml de tampon de lyse IP. Après le lavage final, les billes ont été remises en suspension dans 50 de tampon d'élution (5 &# x00b5 g de peptide triple FLAG dans du PBS) et incubées à 4 C pendant 30 minutes avec vortex. L'échantillon a été analysé par immunoblot (10 %), coloration à l'argent (2 %) et LC-MS/MS (88 %).

Chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)

L'analyse LC-MS/MS des complexes FLAG-NKX3.1 purifiés par affinité a été réalisée comme décrit précédemment en détail 27, 28. En bref, les éluats ont été digérés en solution avec de la trypsine et les peptides ont été séparés par chromatographie en phase inversée. Les peptides ont été analysés sur un spectromètre de masse LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific San Jose, CA). La méthode MS/MS dépendait du top 4 des données. L'exclusion dynamique a été activée. Les données ont été recherchées par rapport à une base de données de protéines humaines de l'indice international des protéines (IPI) à l'aide de Sorcerer-SEQUEST (SageN Research Milpitas, CA).

Analyses semi-quantitatives par comptage spectral

Les comptages spectraux sont le nombre de fois qu'un peptide ionisé est sélectionné par le spectromètre de masse pour MS/MS, en mode dépendant des données et fournissent des estimations semi-quantitatives largement acceptées de l'abondance relative des protéines 29 . QTools, qui sont des macros visuelles de base développées en interne (disponibles sur : www.dieter-wolf-lab.org/protocols ) pour l'analyse automatisée du nombre de spectres, ont été utilisés pour calculer les nombres spectraux des protéines, en utilisant la sortie PeptideProphet du trans -pipeline protéomique (TPP Institute for Systems Biology, Seattle, WA 30).

Filtrage des protéines post-identification

Les purifications de FLAG-NKX3.1 ont été effectuées en quatre exemplaires (c'est-à-dire 4 réplicats biologiques), en commençant chaque fois par un nouveau lot de cellules. Au total, huit échantillons issus de purifications par affinité (quadruples de mock et FLAG-NKX3.1) ont été analysés à plusieurs reprises (3 fois par échantillon, soit 3 réplicats techniques de chaque échantillon) par LC-MS/MS pour un total de 24 LC-MS/MS s'exécute.

Au total, nous avons identifié 315 protéines humaines (ensemble de données 1A). Pour compiler un interactome de la protéine NKX3.1 de confiance élevée, nous avons d'abord effectué une soustraction de fond, c'est-à-dire que le nombre de spectres obtenu pour chaque protéine dans les purifications fictives a été soustrait du nombre de spectres obtenu pour cette même protéine dans la purification FLAG-NKX3.1 correspondante. (Jeu de données 1B). Les comptes de spectre soustraits ont ensuite été additionnés sur les 4 purifications indépendantes. Si des valeurs négatives ont été obtenues après sommation (c'est-à-dire si une protéine était systématiquement plus abondante dans la purification fictive que dans la purification FLAG-NKX3.1), la protéine a été ignorée. Cela a abouti à une liste de 250 protéines avec un nombre moyen de spectres de 9,94 (ensemble de données 1B). De ces listes de données de fond soustraites, nous avons supprimé toutes les protéines dont le nombre de spectres est inférieur à la moyenne (≤ 10) pour exclure les protéines de faible abondance potentiellement non spécifiquement associées à NKX3.1. Cela a abouti à une liste de 71 protéines de fond soustraites et filtrées en abondance. Dans l'étape suivante, nous avons regroupé les entrées redondantes de la base de données de protéines (souvent résultant de plusieurs isoformes de protéines qui n'étaient pas distinguées par les peptides identifiés par LC-MS/MS) en entrées uniques en ajoutant leur nombre de spectres à la fois dans les purifications fictives et NKX3.1. . Cela a abouti à une liste non redondante de 58 protéines, que nous appelons l'interactome à haute confiance (ensemble de données 1B).

Étant donné que les comptes de spectre dépendent de la taille des protéines (des protéines plus grosses donnant lieu à plus de peptides tryptiques), nous avons normalisé les comptes de spectre aux poids moléculaires des protéines, ce que nous avons déjà trouvé comme une méthode appropriée de normalisation 31 . Les nombres de spectres sommés et normalisés de toutes les protéines non redondantes ont été utilisés pour assembler la liste finale soustraite de fond de 58 protéines interagissant avec NKX3.1 (appelée Sum NKX3.1 – Mock). Les nombres de comptage de spectre normalisés additionnés ont également été utilisés pour déterminer le facteur d'enrichissement d'une protéine dans l'échantillon NKX3.1 sur une simulation (Sum NKX3.1/Mock). Les deux listes ont été triées en fonction de l'abondance et comparées sur la figure 1D pour illustrer que les deux méthodes de filtrage de fond (soustraction ou division) produisent une liste qui se chevauche d'interacteurs NKX3.1 de confiance élevée. La carte d'intensité de comptage de spectre de la figure 1C réitère la plupart des étapes décrites ci-dessus, présentant ainsi une vue complète de l'analyse.

Figure 1. L'interactome de la protéine NKX3.1.

(A) Purification représentative de FLAG-NKX3.1 à partir de cellules LNCaP transfectées. Les lysats cellulaires ont été absorbés par la résine anti-FLAG M2, et les protéines spécifiquement retenues ont été éluées avec le peptide FLAG et séparées par SDS-PAGE. Une bande migrant avec le poids moléculaire attendu de FLAG-NKX3.1 et absente de la purification fictive (vecteur vide) est mise en évidence. (B) Diagramme de Venn à quatre voies pour indiquer le degré de chevauchement de la teneur en protéines détectée dans quatre purifications indépendantes de FLAG-NKX3.1. (C) Carte des intensités de comptage de spectre dans les quatre purifications indépendantes FLAG-NKX3.1 et simulées. La carte contient également la somme des nombres de spectres sur toutes les purifications ainsi que les données additionnées après ajustement pour les poids moléculaires des protéines. Les deux colonnes les plus à droite présentent deux manières distinctes de correction de fond, soit en soustrayant les valeurs fictives des valeurs NKX3.1 (NKX3.1 – Mock), soit en calculant le facteur d'enrichissement dans l'échantillon NKX3.1 par rapport à la simulation (NKX3. 1/Mock). Voir la section Matériaux et méthodes pour plus de détails sur l'analyse et le traitement des données. ( D ) Cartes d'intensité du nombre de spectres des 25 composants les plus abondants de l'interactome NKX3.1. Les données ont été triées soit par facteur d'enrichissement (panneau de gauche, NKX3.1/Mock trié) soit par valeurs de fond soustraites (panneau de droite, NKX3.1 – Mock trié). La police de caractères noire indique les protéines présentes sur les deux listes indépendamment de la méthode de tri basée sur l'abondance.

L'interactome NKX3.1 a été analysé avec le plugin Cytoscape Reactome FI 32 . La liste des protéines interagissant avec NKX3.1 a été chargée dans Cytoscape et utilisée pour construire des réseaux Reactome permettant les gènes de liaison. Les réseaux ont été regroupés en modules et des voies enrichies dans les modules (FDR ≤ 0,01) ont été identifiées (figure 2A).

Figure 2. NKX3.1 interagit avec les protéines de réparation de l'ADN.

( A ) La liste des protéines interagissant avec NKX3.1 a été chargée dans Cytoscape et utilisée pour construire des réseaux d'interaction fonctionnelle Reactome. Les réseaux ont été regroupés en modules (indiqués par des couleurs) et les voies enrichies dans les modules (FDR ≤ 0,01) ont été identifiées. Les losanges représentent des composants de réseau qui n'ont pas été identifiés comme des protéines interagissant avec NKX3.1. (B) Les cellules LNCaP ont été transfectées avec FLAG-NKX3.1 (+) ou un vecteur vide (-) suivi par l'absorption du lysat cellulaire sur la résine FLAG M2 pour purifier FLAG-NKX3.1. Des protéines de réparation d'ADN co-purifiantes ont été détectées par immunotransfert. Les quatre panneaux inférieurs proviennent de la même purification par affinité résolue sur un gel séparé. L'astérisque indique une réactivité croisée non spécifique de l'anticorps HSPA8. Les images de transfert recadrées sont présentées, voir la figure S7 pour des images complètes. (C) Une fraction de protéine nucléaire a été préparée à partir de cellules LNCaP et utilisée pour l'immunoprécipitation avec des anticorps NKX3.1 ou un contrôle IgG comme indiqué. Les mêmes échantillons avant (𠇋”) et après (𠇊”) l'immunoprécipitation sont montrés pour documenter l'épuisement spécifique de NKX3.1 endogène. Les trois panneaux inférieurs proviennent du même immunoprécipité résolu sur un gel séparé. Les images de transfert recadrées sont présentées, voir le supplément Figure S7 pour des images complètes.

Des échantillons d'ARN en double collectés à partir de cellules LH transduites par l'adénovirus NKX3.1 ou de cellules LH transduites avec le virus de contrôle GFP ont été utilisés pour l'analyse de puces à ADN sur la plate-forme Illumina. Les Human 6-V2 Expression BeadChips (Illumina) ont été utilisées, qui contiennent

46 000 sondes de transcription. Les données primaires ont été collectées à l'aide du lecteur BeadArray Reader du fabricant à l'aide du logiciel de numérisation fourni. L'analyse des données s'est faite en trois étapes. Tout d'abord, les intensités d'expression ont été calculées pour chaque transcrit sondé sur la puce pour toutes les hybridations à l'aide du logiciel Illumina's Beadstudio#2. Deuxièmement, les valeurs d'intensité ont été contrôlées et normalisées. Le contrôle qualité a été effectué en utilisant la valeur p de détection Illumina Beadstudio définie sur < 0,05 comme seuil. Cela a supprimé les sondes dont les signaux étaient trop faibles pour être détectés de manière fiable sur le réseau. Après cette étape, la première

46 000 sondes ont été réduites à 22 319 (ensemble de données 2A). Les mesures ont ensuite été normalisées à l'aide de la routine normalize.quantiles du package Affymetrix dans Bioconductor. Cette procédure a pris en compte toute variation d'intensité d'hybridation entre les puces individuelles. Une évaluation de plusieurs techniques de normalisation différentes à l'aide de la routine Bioconductor maCorrPlot a suggéré que normalize.quantiles était la plus appropriée pour les données. Enfin, ces données normalisées ont été importées dans GeneSpring et analysées pour les gènes différentiellement exprimés. Les ensembles de données brutes ont été soumis à la base de données GEO (numéro d'accès GSE47030).

Pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle entre les cellules LH infectées par Ad-GFP et Ad-GFP-NKX3.1, les réplicats biologiques pour chaque point dans le temps (7 h et 10 h) ont été moyennés. Les ensembles de données ont été interrogés pour les gènes présentant des différences statistiquement significatives entre les deux groupes (c. Pour trouver les gènes avec les changements d'expression les plus robustes, les données ont été tracées sous la forme d'un “Volcano Plot” (figure supplémentaire S2B), qui permet de mesurer la signification statistique ainsi que l'étendue du changement de pli dans l'expression. Des listes d'ARNm changeant significativement 3 fois ou 5 fois lors de l'expression de NKX3.1 ont été assemblées (ensemble de données 2C).

Isolement d'ARN et analyse Q-PCR

Les cellules LH ont été infectées avec 20 µl de virus Ad-GFP ou Ad-GFP-NKX3.1 et l'ARN total a été isolé après 6, 8, 10 et 12 h en utilisant le mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Les concentrations d'ARN ont été déterminées en mesurant l'absorption à 260 nm dans un spectrophotomètre. Des aliquotes de 2 μg d'ARN total de chaque échantillon ont été rétro-transcrites en ADNc à l'aide d'un kit Omniscript RT (Qiagen) selon les instructions du fabricant. La PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant le mélange maître Brilliant SYBR Green QPCR (Stratagene, La Jolla, CA) et le système de PCR en temps réel Mx3000 (Stratagene). Des amorces spécifiques aux gènes ont été conçues à l'aide de l'algorithme Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) comme indiqué ci-dessous. Les réactions de PCR ont été effectuées selon le protocole du Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix. Brièvement, la PCR a été réalisée en utilisant une concentration finale de 0,2 μmol des paires d'amorces, 50 ng de matrice d'ADNc et 12,5 μl de Brilliant ® SYBR Green QPCR Master Mix. Le volume a été ajusté à 25 μl en ajoutant de l'eau sans RNase. Le protocole de thermocyclage a commencé par une dénaturation de 3 min à 95°C, un programme d'amplification de 40 cycles consistant en une dénaturation de 30 s à 95°C, un annelage de 1 min à 55°C et une extension de 30 s à 95°C. Lors de la conversion des valeurs brutes de ct en valeurs X(0) liées linéairement, les valeurs d'expression ont été normalisées à GAPDH et les changements d'expression ont été exprimés sous forme de ratios de niveaux d'ARNm dans les cellules infectées par NKX3.1 par rapport aux cellules infectées par GFP (NKX3.1/GFP). Les ratios ont été transformés en log2 et moyennés sur deux répétitions techniques, et les écarts types ont été calculés.

Séquences d'amorces utilisées pour la Q-PCR :

Mesure de la prolifération cellulaire

Les cellules LH ont été ensemencées dans des plaques de 384 puits à une densité de 2000 cellules par puits. Après 24 heures, les cellules ont été transduites avec Ad-GFP-NKX3.1 ou des adénovirus Ad-GFP témoins pendant les durées indiquées sur la figure 6D&x2013F. La prolifération (c'est-à-dire la synthèse d'ADN) a été mesurée à l'aide du kit Click-iT ® EdU Alexa Fluor ® 594 HCS (Invitrogen, Carlsbad, CA) conformément aux instructions du fabricant. En bref, 10 µM 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) ont été ajoutés au milieu de culture pendant une heure, et les cellules ont été fixées avec du formaldéhyde à 3,7 %, lavées deux fois avec du PBS, perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 dans PBS, coloré avec le colorant Click-iT Alexa Fluor 594 et contre-coloré avec 1 µg/mL Hoechst 33342 (Bleu). Les plaques ont été scannées et analysées à l'aide d'un cytomètre automatisé Celigo à double longueur d'onde pour détecter le colorant Hoechst (numération cellulaire totale) et Alexa Fluor 594 (cellules incorporant EdU et subissant ainsi la synthèse d'ADN). Quatre images par puits ont été obtenues à chaque longueur d'onde, et le pourcentage de cellules en prolifération a été calculé en divisant le nombre de cellules Alexa positives par le nombre total de cellules.

Des inhibiteurs de MAP kinase et des anticorps neutralisants ont été ajoutés deux heures après la transduction virale. Les inhibiteurs de JNK SP600125 (EMD Chemicals Inc, San Diego, CA) et l'inhibiteur de p38 SB203580 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) ont été utilisés à 20 µM. Des IgG de souris dirigées contre le TNFα (Clone 6401, R&D Systems, Minneapolis, MN) et des IgG de souris entières comme contrôle (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) ont été utilisées à 5 µg/ml.

Analyse des voies et du réseau

Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems) a été utilisé pour l'analyse des voies et des réseaux. La majeure partie de l'analyse a été réalisée avec l'ensemble de données 5× (ARNm montrant un changement significatif de ≥ 5 fois lors de l'expression de NKX3.1). Le jeu de données 3× a été utilisé pour le réseau MYC. Les ensembles de données ont été importés dans IPA et analysés avec les paramètres suivants : Ensemble de référence : Ingenuity Knowledge Base (Genes + Endogenic Chemicals) Network Analysis : Direct and Indirect Relationships Source de données : Ingenuity Expert Findings Confidence : Experimentally Observed Species : Mammifère (humain, souris, rat) et Lignées tissulaires et cellulaires non catégorisées (par ex. produits chimiques) : toutes.

L'ensemble de données 5× a été téléchargé sur le serveur NextBio via le portail Sanford-Burnham. 153 des 158 caractéristiques du jeu de données 5× ont été reconnues et ont pu être interprétées par NextBio. L'analyse a été effectuée en utilisant les paramètres par défaut. Des sites de liaison au facteur de transcription significativement enrichis ont été identifiés par le biais des biogroupes correspondants. Le chevauchement entre l'ensemble de données 5× et l'étude d'expression génique de Nanni et al. 33 ont été identifiés grâce à une recherche dans toutes les études sélectionnées.

Coloration par immunofluorescence indirecte

Les cellules LNCaP transfectées Flag-NKX3.1 ont été ensemencées sur des lamelles de verre recouvertes de poly-lysine de 15 mm et fixées à l'aide de formaldéhyde (3,7 % dans du PBS). Les échantillons ont été colorés avec des anticorps monoclonaux FLAG de souris (Sigma) ou des anticorps polyclonaux de chèvre NKX3.1 (Santa Cruz). Les anticorps conjugués Alexa Fluor 568 (rouge) anti-souris IgG et Alexa Fluor 488 (vert) âne anti-chèvre IgG (Life Technologies Cat# A10037, RRID:AB_11180865 et Cat# A11055, RRID:AB_10564074) ont été utilisés comme anticorps secondaires. Les noyaux ont été colorés au 4’𠄶𠆝iamidino-2-phénylindole (DAPI). Les échantillons ont été imagés sur un microscope à fluorescence inversé Nikon Type 120 en utilisant un grossissement de 60 & 00d7.

Résultats L'interactome NKX3.1

En raison du fait que l'interactome NKX3.1 peut être profilé le plus efficacement dans les cellules qui expriment naturellement cette protéine, nous avons exprimé de manière transitoire NKX3.1 marqué par l'épitope FLAG dans des cellules de cancer de la prostate humaine LNCaP. FLAG-NKX3.1 était environ 5 fois en excès par rapport à NKX3.1 endogène (figure supplémentaire S1A) mais localisé principalement dans les noyaux cellulaires (figure supplémentaire S1B). L'inhibiteur de protéasome MG132 a été ajouté 4 heures avant la préparation du lysat afin de ralentir la clairance rapide via la voie ubiquitine-protéasome à laquelle NKX3.1 est normalement soumis 34, 35. Le lysat cellulaire a été absorbé par la résine anti-FLAG M2 et les protéines spécifiquement retenues ont été éluées avec le peptide FLAG. Quatre purifications d'affinité indépendantes ont été réalisées en parallèle avec des purifications fictives de lysat de cellules transfectées avec le vecteur vide. Les éluats ont été examinés par SDS-PAGE (figure 1A) et soumis à une analyse LC-MS/MS afin de déterminer leur composition protéique.Au total, 315 protéines ont été identifiées à un taux de faux positifs de ≤ 0,01 (ensemble de données 1A).

L'ensemble de données sur les protéines a été soumis à une soustraction de fond et à un filtrage basé sur l'abondance pour arriver à une liste de 58 protéines d'interaction NKX3.1 de confiance élevée (voir Matériels et méthodes et Ensemble de données 1B). Cinquante-cinq des 58 protéines ont été identifiées dans au moins deux purifications indépendantes, et 27 ont été identifiées dans au moins trois purifications (figure 1B, ensemble de données 1C). Cinq protéines ont été systématiquement identifiées comme partenaires d'interaction NKX3.1 dans les quatre purifications indépendantes, à savoir NKX3.1, les protéines de réparation de l'ADN XRCC5/Ku80 et PARP1, et les protéines de synthèse des protéines RPS9 et PABPC1.

Nous avons ensuite effectué une quantification relative de l'interactome NKX3.1 basée sur le comptage spectral 29 . Après avoir additionné les nombres de spectres ajustés au poids moléculaire de chaque protéine à travers les quatre purifications fictives et NKX3.1, nous avons dérivé des quantifications corrigées en arrière-plan en soustrayant les valeurs fictives additionnées des valeurs d'appât NKX3.1 additionnées (NKX3.1 &# x2013 Mock) ou en diviser les valeurs d'appât NKX3.1 à partir de valeurs fictives (NKX3.1/Mock) pour obtenir le facteur par lequel une protéine a été enrichie dans les échantillons d'appâts NKX3.1 par rapport à l'échantillon fictif. Les deux méthodes ont confirmé l'attente que NKX3.1 était la protéine la plus abondante identifiée dans les purifications d'affinité FLAG (Figure 1C, D). Nous avons également effectué une analyse d'interaction fonctionnelle Reactome pour construire un réseau d'interaction fonctionnelle de protéines de liaison NKX3.1 dérivées de données de la littérature conservées manuellement 32 . Le réseau a été regroupé en modules et des voies/réactions fonctionnelles enrichies ont été identifiées (figure 2A).

Parmi les 10 protéines co-purifiantes les plus abondantes se trouvaient les composants de l'holoenzyme de la protéine kinase dépendante de l'ADN (ADN-PK), XRCC5/Ku80, XRCC6/Ku70 et la poly(ADP) ribose polymérase (PARP1) (Figure 2A). L'ADN-PK et PARP1 ont des fonctions importantes dans la réparation, la recombinaison et la maintenance des télomères des cassures double brin de l'ADN, mais sont également impliquées dans le contrôle de la chromatine et de la transcription 36 – 38 . Par exemple, les protéines Ku s'associent à une série de protéines homéodomaines (HOXC4, OCT1, OCT2, DLX2), les recrutant ainsi aux extrémités de l'ADN où elles sont phosphorylées par l'ADN-PK39. Une telle phosphorylation a été proposée pour conduire à des changements dépendants des dommages à l'ADN dans leurs activités transcriptionnelles. L'ADP-ribosylation médiée par PARP1 peut stimuler la capacité de l'ADN-PK à phosphoryler les substrats protéiques 40 . Nos données d'interactome fournissent un mécanisme possible sous-jacent à la localisation précédemment observée de NKX3.1 aux sites de dommages à l'ADN 24, bien que les conséquences fonctionnelles de ces interactions pour l'activité transcriptionnelle de NKX3.1 restent à établir. Quoi qu'il en soit, des expériences de co-immunoprécipitation de suivi ont montré que NKX3.1 surexprimé interagissait facilement avec XRCC5/Ku80 endogène, XRCC6/Ku70 et PARP1 (figure 2B). L'interaction de l'ADN-PK avec le NKX3.1 exprimé de manière ectopique a été très récemment rapportée dans une étude indépendante 41 . Nous montrons ici que NKX3.1 endogène interagit également avec XRCC5/Ku80, XRCC6/Ku70 et PARP1 (Figure 2C).

Parmi les protéines interagissant avec NKX3.1 de premier ordre figurait également le facteur de liaison à l'amplificateur d'interleukine 2 (ILF2/NFAT 45 kDa) (figure 1D). Il a été précédemment démontré que cette protéine interagissait avec le complexe ADN-PK-Ku 42 et faisait partie d'un assemblage de ribonucléoprotéines contenant des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP), la protéine de choc thermique HSPA8, la protéine de liaison poly-A PABC1, la nucléoline (NCL) , et plusieurs protéines ribosomiques 43 , qui ont toutes été également identifiées ici comme des composants de l'interactome NKX3.1 (figure 1C, D, ensemble de données 1A). La plupart de ces interactions étaient également représentées dans le réseau Reactome (figure 2A). Deux sous-unités supplémentaires de cette particule, ILF3 et YBX1 ont également été identifiées, bien qu'à de faibles niveaux (ensemble de données 1A). Les hnRNP fonctionnent dans de multiples processus, y compris l'épissage, la dynamique, la stabilité et la traduction de l'ARNm, la maintenance des télomères, la réparation de l'ADN et le remodelage et la transcription de la chromatine 44 . Ce sont également des constituants majeurs du protéome nucléolaire, qui comprend en outre de nombreuses protéines interagissant avec NKX3.1 énumérées ci-dessus, notamment le complexe ADN-PK, PARP1, HSPA8 et les protéines ribosomiques ainsi que les hélicases à ARN DDX3 et DDX5 45, 46 . Bien que la signification de ces interactions reste incertaine, elles peuvent refléter un couplage physique étroit de la transcription de l'ARNm dépendant de NKX3.1 au traitement de l'ARNm 47 et/ou un rôle jusqu'ici méconnu de NKX3.1 dans la biogenèse du ribosome nucléolaire et le transport de l'ARNm cytoplasmique. Une proposition similaire a été faite pour rationaliser l'interactome du facteur de transcription SOX2, qui partage un chevauchement remarquable avec l'interactome NKX3.1 48 .

Un autre interacteur NKX3.1 très abondant est le régulateur de la chromatine et de l'assemblage nucléaire BANF1 (figure 1D). Cette interaction a été confirmée par co-immunoprécipitation (figure 2B). BANF1 a précédemment montré qu'il se lie à deux autres protéines identifiées dans l'interactome NKX3.1, l'émerine (EMD) et la thymopoétine (TMPO) 49 . De plus, BANF1 interagit avec plusieurs autres facteurs de transcription à homéodomaine et régule l'activité transcriptionnelle de l'un d'entre eux, CRX 50 . Il est donc probable que BANF1, en complexe avec l'émérine et la thymopoétine, soit impliqué dans la régulation génique médiée par NKX3.1. Les protéines d'attachement à la matrice nucléaire SAFA/HNRNPU et SAFB, qui ont également été identifiées comme des protéines interagissant avec NKX3.1, peuvent également participer à ce processus.

Enfin, nous avons identifié une interaction de NKX3.1 avec le facteur de transcription homéobox HOXB13 (Data set 1C). Cette interaction a été confirmée par co-immunoprécipitation (figure 2A). HOXB13 interagit également avec le récepteur des androgènes et régule la réponse cellulaire à l'androgène 51 . De plus, les mutations germinales de HOXB13 augmentent considérablement le risque de cancer héréditaire de la prostate par des mécanismes inconnus 52 . Cependant, d'autres études ont écarté la possibilité intrigante que la mutation de HOXB13 modifie son interaction avec NKX3.1 (CCY & DAW, observation non publiée).

Programme transcriptionnel induit par NKX3.1

Des déterminations antérieures des signatures d'expression génique dépendantes de NKX3.1 ont profilé des prostates de souris qui se sont développées et vieillies en l'absence totale de NKX3.1 16, 19, 20. Ces signatures peuvent donc décrire des changements adaptatifs qui se produisent en réponse à l'épuisement à long terme de NKX3.1 en plus de ses effets immédiats sur l'expression des gènes. Nous avons donc choisi d'introduire de manière aiguë NKX3.1 dans des cellules épithéliales de la prostate humaine immortalisées (cellules LH 25) qui n'expriment pas des niveaux détectables de protéine NKX3.1 (données non présentées). Nous avons produit des adénovirus entraînant l'expression de la GFP seule ou de la GFP et NKX3.1 à partir de promoteurs distincts (virus Ad-GFP et Ad-GFP-NKX3.1, respectivement). Des cellules LH ont été infectées avec ces virus selon le schéma de la figure 3A. Le signal GFP est devenu tout d'abord détectable par microscopie à fluorescence de cellules vivantes 6 heures après l'infection (données non présentées). Nous avons donc récolté des cultures en double de cellules pour l'immunotransfert 7 et 10 heures après l'infection et déterminé que NKX3.1 et GFP étaient exprimés aux deux moments (figure 3B). Aucun effet cytopathique de l'infection par l'adénovirus n'a été observé dans le laps de temps de l'expérience. En parallèle, nous avons préparé des échantillons d'ARN en double des points de temps de 7 heures et 10 heures pour l'analyse du transcriptome.

Figure 3. L'expression médiée par l'adénovirus de NKX3.1 dans les cellules épithéliales de la prostate LH régule des ARNm spécifiques.

( A ) Représentation schématique du déroulement temporel de l'expérience. Les cellules LH ont été infectées en double avec des adénovirus entraînant l'expression de la GFP seule ou de la GFP et de NKX3.1 à partir de deux promoteurs séparés. L'expression de la GFP est devenue apparente pour la première fois par microscopie à fluorescence 6 heures après la transfection (données non présentées). (B) Des lysats cellulaires en double ont été préparés 7 et 10 heures après l'infection et examinés pour l'expression de GFP et NKX3.1 par immunoblot. L'expression de NKX3.1 était déjà détectable au plus tôt (7 heures). (C) Analyse quantitative RT-PCR de 9 ARNm dont l'expression est modifiée en réponse à NKX3.1. Les cellules LH ont été infectées avec des adénovirus entraînant l'expression de la GFP seule ou de la GFP et de NKX3.1, et l'ARNm a été isolé après les moments indiqués (6, 8, 10, 12 heures). Les échantillons d'ARN ont été analysés par Q-PCR et les valeurs d'expression sont présentées sous forme de rapports transformés log2 du niveau d'ARNm dans les cellules infectées par NKX3.1 par rapport aux cellules infectées par GFP (NKX3.1/GFP). Les barres d'erreur indiquent les écarts types obtenus à partir de deux mesures répétées. Le panneau de gauche montre les données de 5 ARNm qui ont été régulés à la hausse par NKX3.1 dans l'ensemble de données de la matrice, tandis que le panneau de droite montre les données de quatre ARNm qui ont été régulés à la baisse.

Les changements globaux des niveaux de transcription notés en réponse à l'expression de NKX3.1 étaient très similaires aux points de temps de 7 heures ou 10 heures (Figure supplémentaire S2A). Des changements statistiquement significatifs ont été observés pour plusieurs centaines d'ARNm. Pour réduire le nombre de modifications de l'ARNm à interroger davantage à un nombre gérable, nous avons arbitrairement défini un seuil de changement de 5 fois. Cela a donné des listes de 158 gènes exprimés de manière différentielle pour le point de temps de 7 heures (figure supplémentaire S2B) et 165 pour le point de temps de 10 heures. Étant donné qu'il y avait un chevauchement considérable des deux listes, nous avons limité la poursuite de l'analyse à l'échantillon de 7 heures. Les ensembles de données 2A et B résument toutes les données d'expression d'ARNm. Le tableau supplémentaire 1 présente une liste classée de tous les 107 ARNm avec une régulation à la hausse > 5 fois, tandis que le tableau supplémentaire 2 présente une liste correspondante de tous les 51 ARNm avec une régulation à la baisse > 5 fois dans les cellules LH exprimant NKX3.1 (voir également l'ensemble de données 2C) . Nous avons choisi 5 ARNm régulés à la hausse et 5 régulés à la baisse pour validation par Q-PCR avec un nouvel ensemble d'échantillons d'ARN répliqués préparés à partir de cellules infectées par Ad-GFP ou Ad-GFP-NKX3.1 pendant des périodes de temps croissantes. Neuf des 10 changements d'expression ont confirmé la tendance observée à partir des puces à ADN, bien que la variabilité était substantielle pour certaines mesures (figure 3C). Nous n'avons pas réussi à confirmer l'induction de l'ARNm de KRT17 apparente à partir des données de la matrice (non représentées). Une validation supplémentaire par Q-PCR et immunoblot est présentée dans diverses sections ci-dessous (voir Figure 6).

L'examen des listes de modifications de l'ARNm a révélé une reprogrammation fondamentale de l'expression des gènes dans les cellules LH lors de l'expression aiguë de NKX3.1. Dans l'ensemble, les changements étaient indicatifs de l'inhibition de la prolifération cellulaire et de l'induction de la différenciation cellulaire. Par exemple, 9 marqueurs de différenciation épithéliale (cytokératines 5, 6B, 7, 8, 17, 18, 19, stratifine, kallikréine 5) ont été fortement induits. De plus, la voie Notch, souvent diminuée dans les cancers de la prostate 53 , a été induite (DLL1, HES1, JAG2). L'inhibiteur de la kinase dépendante de la cycline p21 (CDKN1A), qui inhibe la progression du cycle cellulaire et induit la différenciation cellulaire 54, a également augmenté.

De manière rassurante, bon nombre des ARNm induits par NKX3.1 les plus puissants codent pour des protéines qui se sont précédemment révélées être régulées à la baisse dans le cancer de la prostate humain sur la base de l'immunohistochimie (tableau supplémentaire 1). Cela comprenait, par exemple, les protéines liant le calcium S100A2 et A14 55 , la protéine stratifine 14-3-3 56 , 57 , la laminine A 58 , la claudine 7 59 , la prostasine 60 , la P cadhérine 61 et la kallikréine 5 62 . La cycline D2 est considérée comme un activateur de la progression du cycle cellulaire mais a été induite par NKX3.1. Remarquablement, cependant, la cycline D2 est typiquement régulée à la baisse dans les cancers de la prostate chez l'homme 63 . Quatre ARNm codant pour les HSP70 ont été régulés à la hausse (tableau supplémentaire 1). L'expression de HSP70 est fréquemment perdue dans les cancers de la prostate agressifs 64 et la surexpression expérimentale de HSP70 inhibe la tumorigénicité des xénogreffes de cancer de la prostate chez la souris 65 . De même, trois gènes codant pour les co-chaperons HSP70 DnaJ/HSP40 ont été régulés à la hausse > 5 fois. Enfin, deux glutathion transférases ont été régulées à la hausse par NKX3.1, une conclusion qui est cohérente avec la démonstration précédente que NKX3.1 régule à la hausse la défense contre le stress oxydatif 20 .

La liste des gènes régulés à la baisse (tableau supplémentaire 2) comprenait des gènes impliqués dans la migration cellulaire (liés à l'actine/myosine, collagènes 1A1, 5A1, 5A2), plusieurs facteurs de croissance et la voie interféron/STAT. Il a déjà été démontré que bon nombre des gènes les plus régulés à la baisse étaient surexprimés dans le cancer de la prostate et d'autres cancers (tableau supplémentaire 2). C'est le cas, par exemple, du facteur d'élongation de la traduction eucaryote 1 alpha (EEF1A2) qui est un oncogène potentiel 66 , de l'antagoniste BMP gremlin 1 67 , et du facteur de transcription FOXD1 68 . La N-cadhérine, qui remplace fréquemment les formes épithéliales de la cadhérine dans les cancers de la prostate (�herin switch”) était également fortement régulée à la baisse 69 . De manière significative, NKX3.1 a également régulé à la hausse la cadhérine P, inversant ainsi le commutateur de cadhérine.

Nous avons également comparé notre liste de 331 ARNm qui ont été modifiés 3 fois par NKX3.1 avec une liste récente de 282 gènes de souris considérés comme des cibles directes de NKX3.1 sur la base d'une combinaison d'expression et de données ChIP-seq 16 . Malgré la différence d'espèce et les stratégies diamétrales (surexpression versus knock-out), 10 gènes étaient représentés sur les deux listes (tableau supplémentaire 3). Ce chevauchement est hautement significatif si l'on considère que 8 de ces 10 gènes étaient régulés par NKX3.1 dans la même direction.

Pour évaluer les modules fonctionnels et les voies de signalisation affectés par NKX3.1, nous avons effectué une analyse globale avec le package Ingenuity Pathway Analysis (IPA). L'analyse a été réalisée avec l'ensemble de données d'ARNm changeant plus de 5 fois (𠇅× dataset”) ou, le cas échéant, avec un plus grand ensemble de données d'ARNm changeant plus de 3 fois (𠇃× dataset&# x201d, 357 gènes). Étant donné que des voies de notation identiques ont été obtenues avec les deux ensembles de données, l'analyse a été largement limitée au plus petit ensemble de données 5×, sauf indication contraire.

Conformément à l'implication de NKX3.1 dans le développement de la prostate, nous avons trouvé une surreprésentation hautement significative des fonctions IPA relatives au développement, au mouvement cellulaire, à la prolifération et à la croissance cellulaire (figure 4A). Le terme « maladie des systèmes de reproduction » était particulièrement intéressant, qui comprenait le sous-groupe « néoplasie intraépithéliale prostatique » (PIN). PIN est la première lésion précurseur connue du cancer de la prostate, et montre fréquemment une diminution des niveaux de NKX3.1 70 . La fonction “PIN” contenait les sept gènes répertoriés dans la figure 4B. Une étude précédente a déterminé que six de ces gènes étaient régulés à la baisse dans le PIN par rapport à la prostate normale, tandis qu'un était régulé à la hausse 71 . Remarquablement, cinq des sept gènes affichaient une image miroir des changements se produisant dans PIN lorsqu'ils étaient examinés dans des cellules LH exprimant NKX3.1 (figure 4B). Ces résultats suggèrent que les changements dans l'expression des gènes au début du PIN peuvent être liés de manière causale à la perte de NKX3.1.

Figure 4. Fonctions et voies surreprésentées dans le programme d'expression génique NKX3.1.

( A ) Sélectionnez IPA 𠇏unctions” significativement surreprésenté dans l'ensemble d'ARNm 5×. (B) Liste des ARNm avec expression inverse dans la néoplasie intraépithéliale prostatique (PIN 71) et NKX3.1 exprimant les cellules LH. Les ARNm indiqués en rouge sont régulés à la hausse tandis que ceux indiqués en vert sont régulés à la baisse. ( C ) Sélectionnez IPA �nonical Pathways” surreprésenté dans l'ensemble de données 5×. L'abscisse en haut indique la fraction en pourcentage de toutes les composantes possibles des voies qui étaient représentées dans l'ensemble de données. Étant donné que cet ensemble de données ne contenait qu'un nombre relativement faible de 158 ARNm, une faible surreprésentation en pourcentage des composants de la voie est statistiquement hautement significative (p < 0.05, voir le graphique jaune).

Comme le montre la figure 4C, un certain nombre de voies étaient surreprésentées qui n'étaient pas facilement apparentes à partir de la curation manuelle des listes de gènes présentées ci-dessus. Par exemple, l'analyse a indiqué une régulation positive par NKX3.1 des voies p53 et IL1, en plus de la voie de signalisation Notch. La signalisation de l'interféron, à son tour, semblait être désactivée par l'expression aiguë de NKX3.1.

Réseau TNFα. Pour obtenir une meilleure compréhension des circuits de régulation sous-jacents à la modulation induite par NKX3.1 de voies fonctionnelles particulières, nous avons effectué une analyse de réseau à l'aide du logiciel Ingenuity IPA. Le réseau de classement le plus élevé présenté à la figure 5A présentait TNF&# x03b1, un gène induit par NKX3.1 (tableau supplémentaire 1, figure 6A), au centre avec des bords atteignant 27 nœuds distincts. Dix-huit de ces bords ont été définis par une relation de régulation génique (c'est-à-dire un bord d'expression) signifiant ainsi des gènes connus pour être induits ou supprimés par la signalisation TNFα. Une annotation supplémentaire du réseau TNFα a également connecté le TNFα à la suppression du mouvement cellulaire induite par NKX3.1 via la régulation à la baisse des composants de mobilité basés sur l'action-myosine et l'amélioration de l'adhésion cellulaire grâce à la régulation à la hausse des laminines ( Figure 5A ). Les deux processus sont considérés comme des caractéristiques de bonne foi de la suppression tumorale. Un examen attentif de chaque arête d'expression de TNFα a révélé une concordance considérable entre la définition de l'arête (basée sur la littérature publiée) et l'expression réelle du nœud cible en réponse à NKX3.1. Quatorze nœuds du premier degré qui devraient être activés par TNFα ont également été régulés à la hausse par NKX3.1 (tableau supplémentaire 4). Conformément à la signalisation de la MAP kinase étant une voie en aval majeure activée par le TNF & # x03b1, nous avons constaté qu'un inhibiteur chimique de JNK mais pas de p38 pouvait partiellement antagoniser l'expression induite par NKX3.1 de HSPA6 et HES1 ( Figure 6B ).

Figure 5. Analyse du réseau IPA du programme transcriptionnel NKX3.1.

( A ) Réseau TNFα. Les couleurs des nœuds représentent le niveau de régulation vers le haut (rouge) ou vers le bas (vert) lors de l'expression de NKX3.1. ( B ) Réseau de suppresseur de tumeur p53. Le quadrilatère p53-TERT-EGF-JUN est mis en évidence par des bords bleu foncé. ( C ) Réseau MYC. Les bords du premier degré de MYC sont surlignés en bleu clair. (D) Réseau PDGFB/TGFβ. Les bords du premier degré sont surlignés en bleu clair, le lien PDFGB-TGFβ en bleu foncé.

Figure 6. Modifications induites par NKX3.1 dans l'expression des gènes et des protéines.

( A ) Analyse quantitative RT-PCR de l'ARNm du TNF & x03b1. Les cellules LH ont été infectées avec des adénovirus entraînant l'expression de la GFP seule ou de la GFP et de NKX3.1, et l'ARNm a été isolé après les moments indiqués (6, 8, 10, 12 heures). Les échantillons d'ARN ont été analysés par Q-PCR avec deux ensembles d'amorces différents amplifiant l'ARNm du TNF & x03b1, et les valeurs d'expression sont présentées sous forme de rapports transformés log2 du niveau d'ARNm dans les cellules infectées par NKX3.1 par rapport aux cellules infectées par la GFP (NKX3.1/GFP). Les barres d'erreur indiquent les écarts types obtenus à partir de deux mesures répétées. (B) Des cellules LH ont été infectées avec des adénovirus entraînant l'expression de GFP seule ou de GFP et NKX3.1. Après 4 heures, 10 &# de l'inhibiteur de JNK SP600125 ou 10 &# de l'inhibiteur de la kinase p38 SB203580 ont été ajoutés, suivis d'une isolation de l'ARNm après 6 heures. Les niveaux de HSPA6 et HES1 ont été analysés par Q-PCR. Les valeurs d'expression sont présentées sous forme de rapports transformés log2 du niveau d'ARNm dans les cellules infectées par NKX3.1 par rapport aux cellules infectées par la GFP (NKX3.1/GFP). Les barres d'erreur indiquent les écarts types obtenus à partir de deux mesures répétées.(C) Des cellules LH ont été infectées avec des adénovirus entraînant l'expression de GFP seule ou de GFP et NKX3.1, et des lysats de protéines ont été préparés après les moments indiqués (6, 8, 10, 12 heures). L'expression des protéines indiquées a été déterminée par immunoblot. Les images de transfert recadrées sont présentées, voir Figure S8. pour des images complètes. (D) Les cellules LH ont été infectées avec les virus Ad-GFP et Ad-GFP-NKX3.1, et le taux de synthèse d'ADN a été mesuré par incorporation d'EdU après les temps indiqués (graphiques du haut). Le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été déterminé comme mesure de l'efficacité de l'infection (graphiques du bas). (E) Les cellules LH ont été infectées par le virus Ad-GFP-NKX3.1 et l'effet de l'inhibiteur JNK (SP600125, 20 μM) ou de l'inhibiteur de la kinase p38 (SB203580, 20 μM) sur la suppression médiée par NKX3.1 de la synthèse d'ADN a été mesurée par l'incorporation d'EdU. Le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été déterminé comme mesure de l'efficacité de l'infection (graphiques du bas). (F) Les cellules LH ont été infectées avec le virus Ad-GFP-NKX3.1, et l'effet des anticorps neutralisants contre le TNFα ou l'IgG de contrôle sur la suppression de la synthèse d'ADN médiée par NKX3.1 a été mesuré par incorporation d'EdU. Le pourcentage de cellules positives pour la GFP a été déterminé comme mesure de l'efficacité de l'infection (graphiques du bas).

réseau p53. Un autre réseau à score élevé présentait le suppresseur de tumeur p53 au centre avec des bords du premier degré à 8 nœuds. Bien que p53 n'ait été régulé à la hausse ni au niveau de l'ARNm ni de la protéine (figure 6C), une découverte qui est cohérente avec l'activation bien établie de p53 au niveau post-traductionnel, le réseau a indiqué une induction robuste de certains de ses gènes cibles connus. Comme le montre la figure 5B, cela comprenait la 14-3-3 sigma protein stratifin (SFN), un marqueur de différenciation épithéliale manquant dans de nombreux cancers de la prostate 56, 72, l'inhibiteur de kinase cycline-dépendante p21 (CDKN1A, 73) et le p53 effecteur de l'apoptose PERP 74 . L'induction de la protéine p21 par NKX3.1 a été confirmée par immunotransfert (figure 6C). L'annexine A8 (ANXA8) est également connue pour être régulée positivement par p53 75 . En utilisant l'ensemble de données 3×, nous avons identifié 7 ARNm supplémentaires qui sont régulés à la hausse par NKX3.1 en tant que cibles connues de p53 (figure supplémentaire S3). Ces résultats suggèrent que la voie du suppresseur de tumeur p53 est activée par induction aiguë de NKX3.1 dans les cellules LH. Le réseau contenait trois nœuds supplémentaires hautement connectés, la télomérase (TERT), l'EGF et le JUN, qui formaient un quadrilatère avec p53. Bien que l'ARNm de JUN n'ait pas été induit par NKX3.1, un effet positif de p53 sur JUN a été rapporté précédemment 76 .

Réseau MYC. Un autre réseau à score élevé obtenu avec l'ensemble de données 3× a été organisé autour de l'oncogène MYC (figure 5C). MYC lui-même était régulé à la baisse par 4 fois par l'expression de NKX3.1, un effet qui a été validé par immunoblot (figure 6C). Cela a coïncidé avec la régulation à la baisse de plusieurs gènes qui se sont avérés auparavant nécessiter la fonction MYC pour leur expression (TXNIP, IFI16 77). En outre, le partenaire d'interaction MYC PARP10 a été régulé à la baisse lors de l'expression de NKX3.1. À l'inverse, deux gènes régulés négativement par MYC ont été activés lors de l'expression de NKX3.1 (PERP 78, NDRG 79), suggérant que la régulation négative induite par NKX3.1 de MYC soulage son effet répressif sur ces gènes. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que la restauration de l'expression de NKX3.1 dans les cellules LH a conduit à une régulation négative des voies normalement activées par MYC. Cela peut contribuer à un blocage de la prolifération et favoriser la différenciation cellulaire par NKX3.1. L'antagonisme de NKX3.1 et MYC dans la régulation des gènes cibles et la tumorigenèse de la prostate a également été récemment démontré dans un modèle murin 16 .

Réseau PDGFB/TGFβ. Un autre réseau présentait PDGFβ (PDGFB et PDFGBB), qui a été induit 5,1 fois par NKX3.1. L'induction de l'ARNm de PDGFB et l'expression d'un grand nombre de ses nœuds d'interaction de premier degré sont cohérentes avec le fait que la signalisation PDGFB est régulée à la hausse par NKX3.1. Par exemple, trois nœuds régulés à la hausse par NKX3.1 (CRYAB, SERPINA3, CDKN1A) et deux nœuds régulés à la baisse (DAB2, TAGLN) étaient auparavant contrôlés par PDGFB de la même manière (Figure supplémentaire S4 80, 81) . PDGFB est également connu pour activer la transcription dépendante de PPAR/RXRα. Notamment, RXRα est lui-même régulé à la hausse par NKX3.1 (5,7 fois), expliquant ainsi la surreprésentation de la signalisation PPAR dans l'analyse de la voie canonique ci-dessus (figure 4C). Étant donné que la signalisation PPAR est connue pour supprimer la prolifération des cellules cancéreuses de la prostate 82, elle peut être pertinente pour la suppression tumorale médiée par NKX3.1.

PDGFB partage un certain nombre de nœuds avec un autre facteur de croissance, TGFβ (Figure 5D). Bien que l'ARNm du TGF㬡 n'ait pas été altéré par NKX3.1, le TGF㬢 le plus abondamment exprimé était régulé à la baisse (tableau supplémentaire 5). La plupart des nœuds de premier degré émanant de TGF & # x03b2 ont été régulés à la baisse par l'expression NKX3.1 (Figure supplémentaire 3). 25 gènes supplémentaires dans la voie de signalisation TGFβ ont été régulés à la baisse ou inchangés par NKX3.1, suggérant en outre que NKX3.1 n'active pas la signalisation TGFβ (tableau supplémentaire 5). Étant donné que le TGFβ est un puissant moteur de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT, 83), la suppression médiée par NKX3.1 de la signalisation TGFβ peut contribuer à son activité induisant la différenciation.

Dans une tentative d'obtenir une vue plus cohérente des effets globaux de NKX3.1 sur l'expression des gènes de la prostate, nous avons fusionné des réseaux individuels. Pour plus de simplicité, seuls les bords d'expression ont été inclus dans la figure 7A. Non seulement TNFα et p53 étaient directement liés via une arête basée sur l'expression, mais plusieurs de leurs nœuds individuels de premier degré étaient la cible d'arêtes émanant à la fois de TNFα et de p53. Par exemple, TFP12 et CASP4 sont régulés positivement à la fois par TNFα et par p53 76 , 84 – 86 .

Figure 7. Cadre du programme transcriptionnel NKX3.1.

( A ) Le réseau fusionné TNFα-p53. Les liens réseau sont surlignés en jaune. Les bords directs entre TNFα, p53 et JUN sont soulignés en bleu. ( B ) Construction d'un réseau contenant les principaux facteurs impliqués dans le programme transcriptionnel NKX3.1, y compris FOS/AP1, MYC et p53. Les modules activés par l'expression NKX3.1 sont ombrés en rouge et ceux supprimés en vert. (C) Cadre provisoire des modifications dépendant de NKX3.1 aux modules cellulaires. Sur la base de l'induction de l'ARNm du TNFα et du FOS par NKX3.1 et des effets antagonistes des inhibiteurs de JNK sur l'expression génique et la prolifération cellulaire médiées par NKX3.1, le cadre propose que la signalisation du TNFα entraîne l'activation de l'AP1 et la modulation des gènes en aval et des modules fonctionnels (les carrés rouges symbolisent la régulation positive/activation, les carrés verts la régulation négative). Des voies supplémentaires (lignes pointillées) peuvent empiéter sur le SRF et d'autres facteurs de transcription (non illustrés).

La sous-unité du facteur de transcription AP1 JUN, qui faisait partie du réseau p53 (figure 5B) était liée à TNFα résultant en une configuration triangulaire (figure 7A). Alors que le TNFα et le p53 sont connus pour stimuler l'expression de l'activité JUN et AP1 76, 87, l'expression de NKX3.1 n'a pas affecté de manière significative le niveau d'ARNm de cJUN (-1,21 fois changement) ou JUND (+1,25 fois changement ). Cependant, le partenaire d'interaction JUN FOS a été multiplié par 3,9 par NKX3.1. Étant donné que FOS maintient exactement les mêmes bords au sein du réseau que JUN (données non présentées), l'activité transcriptionnelle d'AP1 semble être régulée à la hausse en réponse à l'expression de NKX3.1.

Enfin, nous avons intégré manuellement le réseau TNFα avec les connexions à tous les principaux facteurs que l'analyse du réseau avait impliqués dans le programme de transcription NKX3.1, y compris FOS/AP1, MYC et p53. Malgré la complexité du réseau résultant, un cadre provisoire pour les changements transcriptomiques induits par NKX3.1 devient facilement apparent (figure 7B, C). Selon ce cadre, l'expression de NKX3.1 dans les cellules LH entraîne l'activation de la voie TNFα. Cela conduit à son tour à l'activation des voies p53, Notch, PDGFB et AP1. Inversement, les voies MYC et interféron/STAT sont désactivées. Grâce à la Q-PCR et à l'immunotransfert, nous avons déjà confirmé plusieurs de ces prédictions (voir la figure 3C pour p53, Notch, PDGFB, STAT et la figure 6 pour TNFα, MYC et p53). De plus, la transduction avec le virus exprimant NKX3.1 a conduit à une inhibition de la croissance des cellules LH par rapport au virus exprimant la GFP seul (figure 6D). Notamment, l'inhibition de la croissance a été partiellement sauvée par l'inhibiteur de JNK et par un anticorps neutralisant contre le TNFy03b1 (figure 6E, F). Ces observations confirment en outre un rôle de NKX3.1 dans l'induction d'un blocage de la division cellulaire et la promotion de la différenciation cellulaire via des voies dépendantes du TNFα/JNK/AP1.

Enrichissement des sites de liaison des facteurs de transcription

Nous avons ensuite utilisé la plate-forme NextBio pour relier nos données d'expression aux données génomiques à grande échelle précédemment publiées. Un ensemble de données qui correspondait à une signification statistique élevée (p = 4,5E-11) comportait un ensemble de 1082 gènes contenant des sites de liaison génomique conservés au cours de l'évolution pour AP1 88 . Vingt-six de ces gènes étaient représentés dans notre liste de

150 gènes sensibles à NKX3.1 dont 20 induits par NKX3.1 (tableau supplémentaire 1, tableau supplémentaire 2, figure supplémentaire 5A, ensemble de données 2D). Combiné avec les preuves de l'analyse du réseau et de la régulation à la hausse des FOS, ces résultats suggèrent que NKX3.1 provoque l'activation d'AP1 et/ou coopère avec AP1 dans l'activation des gènes. Conformément à cette conjecture, l'induction bien connue de l'activité de la kinase N-terminale (JNK) de JUN par la signalisation TNFα, qui améliore l'activité transcriptionnelle de JUN. Enfin, NF㮫, qui est également induit par la signalisation TNFα, peut coopérer avec AP1 au niveau de certains promoteurs 89 .

Un deuxième motif de liaison à l'ADN qui était surreprésenté (p = 1,6E -5 ) dans les gènes sensibles à NKX3.1 se conforme à un site de liaison pour le facteur de réponse sérique (SRF). 216 gènes humains contiennent le motif d'élément de réponse sérique (SRE) dans un contexte proximal de promoteur qui est conservé chez la souris, le rat et le chien 88 . Ces 216 gènes comprenaient 9 gènes qui étaient représentés dans notre ensemble de données, dont tous sauf un ont été supprimés par NKX3.1 (tableau supplémentaire 2, figure supplémentaire 5B, ensemble de données 2E). Depuis NKX3.1 est connu pour interagir physiquement avec SRF 17, nos données suggèrent fortement que NKX3.1 coopère avec SRF dans la suppression transcriptionnelle.

Comparaison avec les données sur le cancer de la prostate chez l'homme

L'analyse Nextbio a également révélé une correspondance hautement significative avec une étude comparant l'expression des gènes dans les tissus humains du cancer de la prostate 33 . Cette étude a profilé 22 lignées cellulaires dérivées d'échantillons chirurgicaux de patients atteints d'un cancer de la prostate avec une maladie cliniquement localisée et l'absence de traitement hormonal néo-adjuvant avant la chirurgie. Conformément à ces critères de sélection pour les cancers précoces, les lignées cellulaires (et les tumeurs primaires dont elles étaient dérivées) avaient subi une perte de 8p21 (c'est-à-dire NKX3.1) mais ne présentaient pas d'anomalies génétiques typiques des cancers de la prostate plus avancés (par exemple, perte de PTEN , amplification de MYC et récepteur aux androgènes). 3415 ARNm ont été significativement modifiés dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate par rapport à la prostate normale.

Sur les 153 gènes exprimés de manière différentielle dans notre ensemble de données, 82 (53 %) ont également été modifiés dans les lignées cellulaires dérivées du cancer de la prostate (PCaDCL), un chevauchement hautement significatif (p = 2,0E -36, jeu de données supplémentaire de la figure 6 2F). Sur les 82 gènes qui se chevauchent, 60 ont été régulés à la baisse et 22 ont été régulés à la hausse dans PCaDCL par rapport à PrEC. Étonnamment, 93% des ARNm régulés à la baisse dans PCaDCL ont été induits par l'expression de NKX3.1 dans les cellules LH (tableau supplémentaire 1). En outre, 19 des 20 gènes régulés à la hausse dans PCaDCL ont été régulés à la baisse par NKX3.1 (tableau supplémentaire 2). De plus, bon nombre des changements d'expression de l'ARNm observés dans l'étude sur microréseaux PCaDCL ont été confirmés de manière indépendante au niveau des protéines par immunohistochimie d'échantillons de tissus du cancer de la prostate (tableau supplémentaire 1 et tableau supplémentaire 2). Ces analyses suggèrent fortement que les principaux réseaux de régulation génique qui sont affectés par l'expression de NKX3.1 dans les cellules LH sont inversement perturbés dans le cancer de la prostate humain précoce marqué par la perte de ce suppresseur de tumeur.

Nous avons utilisé une série d'approches globales pour explorer la fonction suppresseur de tumeur de NKX3.1. L'interactome NKX3.1 a révélé un schéma complexe d'interactions avec les protéines de réparation de l'ADN et avec d'autres régulateurs transcriptionnels tels que ILF2 et BANF1 qui prédisent un programme transcriptionnel tout aussi complexe édicté par NKX3.1. En effet, l'analyse globale du modèle d'expression génique activé par l'expression aiguë de NKX3.1 dans des cellules épithéliales de la prostate humaine immortalisées avec un phénotype basal (cellules LH 25, 90) a révélé une reprogrammation rapide et étendue avec 158 ARNm changeant ≥ 5 -fold et 331 ARNm changeant ≥ 3 fois. Ce modèle complexe a été interrogé par analyse de réseau pour tenir compte de la reconnaissance que la représentation des processus et des réactions cellulaires sous forme de voies linéaires est souvent une simplification excessive qui ne reflète pas avec précision la complexité du câblage intracellulaire 91 .

L'analyse du réseau a indiqué une modulation dépendante de NKX3.1 d'une série de modules fonctionnels interconnectés et a permis un cadre provisoire pour le programme transcriptionnel induit par NKX3.1 dans les cellules épithéliales de la prostate humaine. D'une manière générale, l'activation de NKX3.1 culmine dans la régulation négative de la motilité cellulaire ainsi que l'activité MYC et IFN/STAT et dans la régulation positive de l'activité p53, la voie Notch et la signalisation PDGF (Figure 7C). Bon nombre de ces changements sont facilement compatibles avec la fonction suppresseur de tumeur de NKX3.1 observée chez les souris knock-out 3 &# x2013 5 .

Surtout, l'analyse du réseau nous a permis d'identifier plusieurs voies imprévues sur lesquelles NKX3.1 semble empiéter. Par exemple, l'analyse a suggéré un rôle majeur pour le TNFα dont l'ARNm a été induit par NKX3.1. Le TNFα est un inducteur bien établi de la signalisation des MAP kinases, y compris les kinases JNK et p38. De manière significative, IL1α a également été induite par NKX3.1 (tableau supplémentaire 1), augmentant ainsi davantage l'activation de MAPK. JNK active l'activité transcriptionnelle d'AP1 rationalisant ainsi facilement la forte surreprésentation des sites de liaison AP1 dans les gènes sensibles à NKX3.1. La signalisation localisée du TNFα-JNK médiée par NKX3.1 dans les cellules épithéliales de la prostate peut favoriser et maintenir leur état de différenciation, supprimant ainsi la tumorigenèse. Le rôle important de la signalisation JNK dans la différenciation cellulaire est bien établi 92, 93 . La découverte que les cytokines pro-inflammatoires déstabilisent également la protéine NKX3.1 35 indique une boucle de rétroaction négative qui peut contrecarrer leur fonction pro-apoptotique (figure 7C).

Il est important de noter que la signature génique induite par NKX3.1 est, dans une large mesure, une image miroir du modèle d'expression génique trouvé dans les cancers de la prostate humains précoces dépourvus de NKX3.1 33 . Ce schéma inverse suggère en outre que NKX3.1 est un facteur clé de la différenciation des cellules luminales, alors que la perte de NKX3.1 permettrait aux cellules luminales de se dédifférencier dans un état avec une capacité de prolifération plus élevée, les rendant ainsi plus vulnérables à l'acquisition d'événements oncogènes supplémentaires peut-être augmentée par des défauts concomitants dans la réparation de l'ADN. Il est clair que de tels événements supplémentaires sont essentiels pour la carcinogenèse de la prostate étant donné que PIN chez les souris knock-out NKX3.1 ne progresse pas vers un cancer de la prostate manifeste, à moins que d'autres changements génétiques ne surviennent 5 – 8 .

Les données référencées par cet article sont sous copyright avec la déclaration de copyright suivante : Copyright : � 2014 Yang CC et al.

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figshare : expression NKX3.1 et interactions Dataset. Doi : 10.6084/m9.figshare.1002064 94