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Knockdown de gène vs knockout de gène vs knocksideways?

Knockdown de gène vs knockout de gène vs knocksideways?


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Comment les techniques : Knock-side, Knockout & Knockdown sont-elles différentes ?


Bonjour et bienvenue Adil Amchi.

En génétique et en biologie moléculaire, il existe des différences entre les termes knock-out, knock-down et (le terme moins connu) knock-side.

Frapper sur le côté : inactive les protéines. Pourrait être fait en utilisant des inhibiteurs de petites molécules.

Knock-out : élimination des gènes, pas d'expression des gènes. Peut être fait en utilisant CRISPR.

Knock-down : l'expression des gènes est réduite. Pourrait être fait en utilisant l'ARN d'interférence.

(Une autre référence pour Knock-sideways :

« Il est important de noter que la rapidité du système « knock-sideways » a permis aux chercheurs d'observer un phénotype distinct du knockdown médié par les siARN de la même protéine… »)


Coup de grâce génétique : la perte d'un gène peut être compensée par un autre gène

De nouvelles méthodes de modification du génome sont actuellement largement débattues : en utilisant CRISPR/Cas par exemple, les scientifiques peuvent supprimer des parties du code génétique d'un gène, le mettant ainsi KO. De plus, il existe des moyens d'inhiber la traduction d'un gène en une protéine. Les deux méthodes ont en commun d'entraver la production d'une protéine et devraient donc avoir des conséquences comparables pour un organisme. Cependant, il a été démontré que les conséquences peuvent différer, après qu'un gène est soit assommé, soit seulement bloqué. Un scientifique du MPI for Heart and Lung Research à Bad Nauheim a maintenant découvert que des gènes supplémentaires compensent un gène assommé et atténuent les conséquences ou compensent complètement les déficits. Les résultats suggèrent la prudence lors de l'interprétation des données d'études de biologie moléculaire ou du développement de thérapies géniques pour traiter diverses maladies.

Pour analyser la fonction d'un gène inconnu, les scientifiques éteignent souvent le gène et étudient les conséquences de ce traitement pour l'organisme. Pour ce faire, ils ont coupé des fragments d'ADN du gène à l'aide d'enzymes supprimant l'information génétique d'une protéine fonctionnelle. Une telle méthode est appelée « knock-out génétique ». En revanche, dans un « knockdown de gène », les scientifiques bloquent la production de protéines en utilisant des substances particulières, par ex. microARN.

Des études récentes, cependant, ont montré que les résultats peuvent varier entre les animaux knock-out et knock-down. Les scientifiques du groupe de Didier Stainier à l'Institut Max Planck de recherche cardiaque et pulmonaire en ont maintenant identifié la raison. Les chercheurs basés à Bad Nauheim ont étudié un gène appelé egfl7 chez le poisson zèbre. Le gène est impliqué dans la production de tissu conjonctif dans les parois des vaisseaux sanguins, les stabilisant ainsi. Ce faisant, egfl7 régule la croissance des vaisseaux sanguins.

Les biologistes du développement, cependant, ne sont pas sûrs de ce qui se passe dans un organisme de poisson, une fois que le gène egfl7 a été supprimé. "Si le gène a été bloqué lors d'un knockdown, les vaisseaux sanguins ne se développent pas normalement", explique Andrea Rossi, en collaboration avec Zacharias Kontarakis, premier auteur de l'étude. En revanche, si le gène lui-même est supprimé par une manipulation génétique, la croissance des vaisseaux sanguins n'est pas affectée.

Au début, les chercheurs de Max Planck ont ​​exclu les effets secondaires potentiels de la substance knockdown responsables d'interférences dans le développement vasculaire. À cette fin, ils ont injecté la substance dans des larves de poisson dans lesquelles le gène egfl7 avait déjà été supprimé. Cependant, les larves se sont presque développées normalement.

"Comme la substance n'a pas causé de perturbations dans la croissance des vaisseaux sanguins, nous avons pensé à un mécanisme différent : la perte de gènes pourrait être compensée par un autre gène prenant en charge la fonction", explique Kontarakis. "Par conséquent, nous recherchions des gènes de secours, qui auraient pu être produits chez des animaux sans gène egfl7 fonctionnel."

Les chercheurs ont comparé les molécules d'ARNm et les protéines chez les poissons avec ou sans gène egfl7 fonctionnel et ont détecté plusieurs ARNm et protéines présents en plus grande quantité chez les poissons sans egfl7. Un exemple est emilin 3B. Lorsque des animaux "knockdown" sont traités avec de l'emilin 3B après que egfl7 a été bloqué, les vaisseaux sanguins se développent presque normalement. "Cela nous indique qu'emilin 3B peut compenser la perte d'egfl7. Chez les poissons knock-out egfl7, la production d'emilin est régulée à la hausse. Ce n'est pas le cas chez les poissons knockdown", explique Stainier.

Comme prochaine étape, le groupe prévoit d'analyser comment les gènes "savent" qu'un autre gène a été supprimé, puis de compenser la perte. Plusieurs chercheurs du monde entier tentent de supprimer les gènes de la maladie pour des raisons thérapeutiques. Avant d'établir de telles thérapies, nous devons bien comprendre les conséquences que la perte ou le blocage d'un gène pourrait avoir. « De plus, notre étude illustre le pouvoir de comparer knockouts et knockdowns pour identifier des gènes modificateurs, un objectif qui reste un défi majeur dans le domaine de la génétique humaine », explique Stainier.


Knockdown d'ARNi contre Knock-out d'ADN - (28 juillet 2005 )

Je suis nouveau dans ce domaine et j'espère que quelqu'un pourra m'expliquer pourquoi je voudrais utiliser l'ARNi pour créer des souris knock-down plutôt que des souris knock-out.

Jusqu'à présent, je peux comprendre pourquoi l'ARNi à court terme utilisant l'ARNsi est bénéfique, car les résultats sont rapidement observés et temporaires. Mais le processus de création d'une souris knock-down semble presque le même que lors de la création d'une souris knock-out. alors ça te dérange?

ma compréhension du problème est que certains gènes ne peuvent pas être éliminés. ou si vous supprimez le gène de vos souris, elles deviennent très malades et ne se reproduiront pas, ce qui rend le long processus de création d'un knock-out pas particulièrement utile. Je n'ai pas utilisé l'ARNi chez la souris, donc jusqu'à ce que vous commentiez, je pensais que ce serait beaucoup plus facile que de concevoir et d'élever des souris knock-out.

Wow, je ne savais même pas qu'il était possible d'avoir des souris knock-down. Je ne le ferais pas vraiment de toute façon, car si votre protéine réduite au silence est cruciale pour les cellules, il est probable que vous les contre-sélectionnez ou que vous sélectionniez des cellules qui ont trouvé un moyen de contourner votre protéine réduite au silence ou encore plus de cellules mutées pour le traitement ARNi. Ai-je raison? Pour moi, cela semble encore plus dangereux avec des effets hors cible.


Les souris knock-in et knock-out sont toutes deux des souris génétiquement modifiées qui aident les chercheurs à comprendre les fonctions génétiques du corps humain à un niveau de détail plus élevé. Bien que la recherche génétique directement sur les humains et la modification des gènes dans les tissus humains ne soient toujours pas une option éthique et viable, les souris génétiquement modifiées peuvent offrir aux chercheurs une fenêtre d'opportunité que d'autres modèles n'offrent peut-être pas. Cela est dû au fait que le génome de la souris – bien que beaucoup plus simple – est extrêmement similaire au génome humain. Il contient bon nombre des mêmes gènes que les scientifiques devraient éliminer ou éliminer, en fonction de leurs objectifs de recherche. Bien que les deux méthodes soient utilisées pour la recherche génétique, c'est à peu près là que s'arrêtent les similitudes entre les souris knock-in et knock-out. En fait, les processus de génération des deux types de modèles sont assez différents. De plus, l'ensemble de l'approche de l'étude des souris knock-out est très différente de celle des souris knock-in, comme indiqué ci-dessous.

La différence la plus importante entre les deux types de modèles est que, dans le cas des souris knock-out, un gène est ciblé et inactivé, ou « assommé ». En revanche, générer des souris knock-in implique la technique inverse : modifier la séquence génétique de la souris afin d'ajouter du matériel génétique étranger sous la forme d'un nouveau gène hébergé par le locus spécifique ciblé par le chercheur. Les souris knock-out sont beaucoup plus anciennes et font l'objet de plus de recherches que les modèles knock-in. La première souris knock-out a été générée en 1989, tandis que la génération de souris knock-in est un processus qui n'a été perfectionné qu'au cours des dernières années. Cependant, cette technique a gagné en popularité à un rythme accéléré, alors que les méthodes d'obtention de souris knock-in continuent d'augmenter en nombre.

Les technologies knock-in et knock-out sont très différentes. Alors que les deux peuvent être utilisés sur des souris de laboratoire pour faciliter la recherche génétique sans avoir à expérimenter sur des sujets humains, la technologie et les méthodes spécifiques utilisées pour supprimer ou inactiver une partie de la séquence d'ADN sont distinctes et reconnues comme telles par les chercheurs qui connaissent les deux. knock-out et knock-in de gènes. Les knock-ins créent une substitution un pour un de la séquence d'ADN dans le génome. En particulier, la technologie knock-in se concentre sur un locus spécifique de la séquence, par rapport à la façon dont les technologies et méthodes de génération de souris knock-out se concentrent sur la conception d'une séquence d'ADN entièrement nouvelle, qui est très similaire à l'originale, mais conçue pour garantir que le gène devient inopérant.

Il est également important de prendre note de ce que les deux techniques sont conçues pour atteindre. Leurs utilisations varient de manière significative, dans la mesure où les chercheurs ont tendance à utiliser chacun pour différents types d'études. Les souris knock-out sont conçues pour aider les scientifiques à examiner en détail ce qui fait fonctionner les gènes et ce que fait chaque gène. Parce qu'ils sont capables d'empêcher des gènes spécifiques de remplir leurs fonctions, ils peuvent être utilisés pour étudier l'impact d'un gène spécifique sur les différentes fonctions de l'ensemble du corps. Cela aidera les chercheurs en médecine et en génétique à étudier plus facilement les maladies génétiques, ainsi que divers troubles affectés par l'altération d'un certain gène. En revanche, les knock-ins aident à étudier de plus près le génome humain en introduisant du matériel génétique humain dans le génome d'une souris. Les possibilités sont infinies, mais la plupart des progrès réalisés par les scientifiques en génétique ont été réalisés dans le domaine de la recherche sur l'immunodéficience et les cellules souches, ainsi que dans l'étude de diverses maladies nécessitant l'activation de gènes humains.


Knockdown de gène vs knockout de gène vs knocksideways? - La biologie

Quels sont les avantages et les inconvénients du knockdown shRNA par rapport au knock-out CRISPR ?

Le knock-down médié par shRNA ou le knock-out médié par la nucléase (par exemple CRISPR ou TALEN) peut être une approche expérimentale précieuse pour étudier les effets de perte de fonction d'un gène d'intérêt en culture cellulaire. Afin de décider quelle méthode est optimale pour votre application spécifique, vous devez prendre en compte quelques éléments.

Mécanismes

Vecteurs de renversement

Les vecteurs Knockdown expriment des ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) qui répriment la fonction des ARNm cibles au sein de la cellule en induisant leur clivage et en réprimant leur traduction. Par conséquent, les vecteurs shRNA knockdown ne sont associés à aucun changement de séquence au niveau de l'ADN du gène d'intérêt.

Vecteurs de knock-out

CRISPR et TALEN fonctionnent tous deux en dirigeant des nucléases pour couper des sites cibles spécifiques dans le génome. Ces coupures sont ensuite réparées de manière inefficace par la machinerie cellulaire, ce qui entraîne des mutations permanentes, telles que de petites insertions ou délétions, au niveau des sites de réparation. Un sous-ensemble de ces mutations entraînera une perte de fonction du gène d'intérêt en raison de décalages du cadre de lecture, de codons d'arrêt prématurés, etc. entraîner la délétion de la région intermédiaire.

Efficacité

Le knockdown médié par shRNA ne réprimera jamais complètement l'expression du gène cible. Même pour les shRNA les plus efficaces, une certaine expression résiduelle du gène cible restera. En revanche, dans une fraction des cellules traitées, CRISPR et TALEN peuvent générer des mutations permanentes pouvant entraîner une perte complète de la fonction génique.

Cohérence et uniformité

Les vecteurs shRNA fournissent généralement une uniformité élevée de cellule à cellule dans le pool de cellules traitées et des résultats très cohérents entre les expériences. En revanche, CRISPR et TALEN produisent des résultats très hétérogènes d'une cellule à l'autre en raison de la nature stochastique des mutations introduites. Pour éliminer complètement le gène d'intérêt dans une cellule, toutes les copies du gène dans la cellule doivent être désactivées. Étant donné que les cellules normales ont deux copies de n'importe quel gène (à l'exception des gènes liés à X ou Y) alors que les cellules cancéreuses peuvent avoir plus de deux copies, ces cellules knock-out complètes peuvent représenter une très petite fraction de toutes les cellules traitées. Pour cette raison, les expériences d'inactivation induite par la nucléase nécessitent le criblage de clones par séquençage pour identifier le sous-ensemble dans lequel toutes les copies du gène d'intérêt ont été inhibées.

Effets hors cible

Des effets hors cible ont été rapportés à la fois pour le knock-down médié par shRNA et le knock-out médié par la nucléase. Le ou les phénotypes hors cible peuvent être estimés en utilisant plusieurs shRNA différents pour cibler le même gène. Si un gène renversé par plusieurs shRNA différents entraîne un ou plusieurs phénotypes cohérents, il s'oppose alors à ce que le ou les phénotypes soient causés par des effets hors cible. Pour le knock-out médié par CRISPR ou TALEN, plusieurs clones contenant des mutations par perte de fonction doivent être analysés afin de prendre en compte tout phénotype pouvant être dû à des mutations hors cible. De plus, des sites hors cible identifiés de manière bioinformatique pourraient être séquencés dans les clones pour voir s'ils ont été mutés.


Transgénèse animale : un aperçu

Les animaux transgéniques sont largement utilisés pour étudier la fonction des gènes in vivo ainsi que pour modéliser des maladies humaines. La technologie pour produire des animaux transgéniques existe pour une variété d'espèces de vertébrés et d'invertébrés. La souris est l'organisme le plus utilisé pour la recherche sur les maladies neurodégénératives. Les techniques les plus couramment utilisées pour produire des souris transgéniques impliquent soit l'injection pronucléaire de transgènes dans des ovocytes fécondés, soit le ciblage de gènes à médiation par des cellules souches embryonnaires. La technologie des cellules souches embryonnaires a été le plus souvent utilisée pour produire des mutants nuls (inactivations génétiques), mais peut également être utilisée pour introduire des modifications génétiques subtiles jusqu'au niveau de modifications d'un seul nucléotide dans les gènes endogènes de la souris. Des méthodes sont également disponibles pour induire des knock-outs de gènes conditionnels ainsi qu'un contrôle inductible de l'expression du transgène. Ici, nous passons en revue les principales stratégies d'introduction de modifications génétiques chez la souris, ainsi que chez d'autres espèces de vertébrés et d'invertébrés. Nous passons également en revue un certain nombre de méthodologies récentes pour la production d'animaux transgéniques, y compris le transfert de gènes à médiation par des rétrovirus, le knockdown de gènes à médiation par ARNi et la mutagenèse de cellules somatiques combinées au transfert nucléaire, des méthodes qui peuvent être plus largement applicables aux espèces où l'injection pronucléaire et l'ES la technologie cellulaire s'est avérée moins pratique.


Down and Out avec RNAi et CRISPR

Les gènes peuvent être renversés avec l'interférence ARN (ARNi) ou désactivés avec CRISPR-Cas9. L'ARNi, le cheval de bataille du criblage, détruit la traduction des gènes en induisant une dégradation rapide du transcrit d'un gène cible.

CRISPR-Cas9, la nouvelle mais déjà célèbre technologie d'édition du génome, clive des séquences d'ADN spécifiques pour rendre les gènes inopérants. Bien que mécaniquement différentes, les deux techniques se complètent et, lorsqu'elles sont utilisées ensemble, facilitent la découverte et la validation des découvertes scientifiques.

Les technologies ARNi ainsi que d'autres développements dans le criblage génomique fonctionnel ont été discutés par les leaders de l'industrie lors de la récente conférence Discovery on Target. La conférence, qui a mis l'accent sur l'identification et la validation de nouvelles cibles médicamenteuses et l'exploration de voies cellulaires inconnues, comprenait un symposium sur le développement de thérapies basées sur CRISPR.

Le criblage d'ARNi peut être effectué dans des formats groupés ou en réseau. Le criblage groupé offre une option de paillasse abordable, mais nécessite une déconvolution back-end et un séquençage en profondeur pour identifier le shRNA à l'origine du phénotype spécifique. Les cibles sont beaucoup plus faciles à identifier en utilisant le format en réseau puisque chaque clone shRNA se trouve dans un puits individuel.

« CRISPR complète les cribles ARNi », a commenté Ryan Raver, Ph.D., chef de produit mondial de la génomique fonctionnelle chez Sigma-Aldrich. « Vous pouvez faire un criblage du génome entier avec un petit ARN interférent (siRNA) ou un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA), puis valider avec des CRISPR individuels pour vous assurer qu'il s'agit d'un résultat réel. »

Une méthode de validation puissante et utile pour les études knock-down ou knock-out consiste à utiliser des cadres de lecture ouverts (ORF) lentiviraux pour la réexpression de gènes, pour des expériences de sauvetage ou pour détecter si le phénotype de type sauvage est restauré. Cependant, l'ORF s'intègre de manière aléatoire dans le génome. De plus, avec cette technique de validation, l'expression génique n'agit pas sous le promoteur endogène. En conséquence, des niveaux physiologiquement pertinents du gène peuvent ne pas être exprimés à moins qu'ils ne soient contrôlés via un système inductible.

À l'avenir, les activateurs CRISPR pourraient fournir des moyens plus efficaces d'exprimer non seulement des formes de gènes de type sauvage mais également des formes mutantes de gènes sous le promoteur endogène.

Le choix de la technique de dépistage dépend du chercheur et de la question de recherche. Un knock-out de gène entier peut être nécessaire pour observer un phénotype, tandis qu'un knock-down partiel peut être nécessaire pour étudier les fonctions de gènes essentiels ou mortels. L'utilisation des deux techniques est recommandée pour identifier toutes les cibles potentielles.

Par exemple, récemment, un criblage d'ARNsi du génome entier sur une lignée cellulaire de glioblastome humain a identifié un gène, connu sous le nom de FAT1, en tant que régulateur négatif de l'apoptose. Un knock-out du gène médié par CRISPR a également conféré une sensibilité à l'apoptose induite par le récepteur de la mort avec un phénotype encore plus fort, validant ainsi le nouveau rôle et le lien de FAT1 avec l'apoptose extrinsèque, un nouveau système modèle.

Le Dr Raver a indiqué que les bibliothèques d'ARNi de nouvelle génération adaptées aux microARN pourraient avoir une réduction plus robuste de l'expression des gènes, jusqu'à 90 à 95 % dans certains cas. Les bibliothèques ultracomplexes d'ARNsh aident à minimiser les taux de faux négatifs et de faux positifs en ciblant chaque gène avec

25 shRNA indépendants et en incluant des milliers de shRNA à contrôle négatif.

Récemment, un article pertinent a émergé du laboratoire de Jonathan Weissman, Ph.D., professeur de pharmacologie cellulaire et moléculaire à l'Université de Californie à San Francisco. L'article décrit comment une nouvelle bibliothèque d'ARNsh regroupée ultracomplexe a été optimisée au moyen d'un système adapté aux microARN. Ce système, capable d'atteindre une spécificité élevée dans la détection des gènes hit, a produit des résultats solides. En fait, ils étaient comparables aux résultats obtenus avec un écran poolé CRISPR. Les membres du groupe Weissman ont systématiquement optimisé les contextes de promoteur et de microARN pour l'expression de shRNA ainsi qu'une sélection de brins guides.

À l'aide d'une sous-bibliothèque de gènes de protéostase (ciblant 2 933 gènes), les chercheurs ont comparé les cribles combinés CRISPR et ARNi. Les données ont montré 48 hits uniques à RNAi, 40 uniques à CRISPR, et un chevauchement de 21 hits (avec un seuil de 5% de taux de fausses découvertes). Ensemble, les technologies ont fourni une histoire de recherche plus complète.


L'interférence ARN (ARNi) fait taire, ou renverse, la traduction d'un gène en induisant la dégradation du transcrit d'un gène cible. Pour faire progresser les applications d'ARNi, Thermo Fisher Scientific a développé deux types de petites molécules d'ARN : les ARN interférents courts et les microARN. La société propose également des produits pour l'analyse ARNi in vitro et in vivo, notamment des bibliothèques pour des applications à haut débit.

Écrans CRISPR en réseau

"Les criblages d'ARN sont bien acceptés et continueront d'être utilisés, mais il est important sur le plan biologique que les chercheurs s'éloignent du mécanisme de l'ARN pour étudier et valider leurs résultats afin d'éliminer les biais potentiels", a expliqué Louise Baskin, chef de produit senior, Dharmacon, partie de GE Santé. « La progression naturelle consiste à adopter CRISPR dans les étapes ultérieures. »

L'ARNi utilise le mécanisme endogène de la cellule. Tous les composants requis pour le knockdown du gène sont déjà dans la cellule, et la livraison de l'ARNsi démarre le processus. Avec le système d'édition de gènes CRISPR, qui est dérivé d'un système de défense immunitaire bactérien, l'administration à la fois de l'ARN guide et de la nucléase Cas9, souvent le limiteur de débit en termes d'efficacité de knock-out, est requise.

Dans les approches groupées, la cellule doit soit abandonner, soit surexprimer pour pouvoir être triée, ce qui limite les types de questions biologiques adressables. Une approche CRISPR-array ouvre la porte à l'utilisation d'autres outils analytiques, tels que l'imagerie à haut contenu, pour identifier les hits d'intérêt.

Pour faciliter l'utilisation de CRISPR, GE a récemment introduit des bibliothèques d'ARN CRISPR synthétiques Dharmacon Edit-R (crRNA) qui peuvent être utilisées pour effectuer une analyse en réseau à haut débit de plusieurs gènes. Plutôt qu'un ARNg basé sur un vecteur ou un plasmide pour guider le ciblage du clivage Cas9, un ARNcr et un ARNtracr synthétiques sont utilisés. Ces réactifs crRNA conçus par algorithme peuvent être délivrés dans les cellules de la même manière que les siRNA, ouvrant ainsi la possibilité de cribler plusieurs régions cibles pour de nombreux gènes différents simultanément.

GE a montré un très fort chevauchement entre CRISPR et ARNi en utilisant cette approche en réseau pour valider les résultats de l'écran ARNi avec crRNA synthétique. Les données ont conclu que CRISPR peut être utilisé pour la validation à moyen ou haut débit d'études de précipitation.

"Nous continuerons à voir beaucoup de coopération entre l'ARNi et l'édition de gènes", a déclaré Baskin. "L'utilisation du mécanisme CRISPR pour knockin pourrait introduire des mutations pour aider à comprendre la fonction des gènes à un niveau beaucoup plus profond, y compris une analyse fonctionnelle plus approfondie des gènes non codants.

«Ces ARN régulateurs agissent souvent dans le noyau pour contrôler la traduction et la transcription. Par conséquent, pour éliminer ces gènes avec l'ARNi, il faudrait une exportation vers le cytoplasme. L'édition de précision des gènes, qui a lieu dans le noyau, nous aidera à comprendre le transcriptome non codant et à approfondir la façon dont ces gènes régulent la progression de la maladie, le développement cellulaire et d'autres aspects de la santé humaine et de la biologie.


Les réactifs synthétiques crRNA:tracrRNA peuvent être utilisés de la même manière que les réactifs siRNA pour l'évaluation des phénotypes dans une population cellulaire. Rangée du haut: Une lignée cellulaire rapporteur exprimant de manière stable la nucléase Cas9 a été transfectée avec le système crRNA:tracrRNA synthétique Edit-R de GE Dharmacon, qui a été utilisé pour cibler trois gènes de contrôle positif (PSMD7, PSMD14 et VCP) et un gène de contrôle négatif (PPIB). Les cellules vertes indiquent que la signalisation EGFP se produit à la suite d'une perturbation de la voie du protéasome. Rangée du bas: Un pool d'ARNsi siGENOME ciblant les mêmes gènes a été utilisé dans la même lignée cellulaire rapporteur.

Sélection d'outils

L'outil de génomique fonctionnelle devrait s'adapter à la biologie spécifique, la biologie ne devrait pas être forcée de s'adapter à l'outil. Les points à considérer incluent la régulation de l'expression, la lignée cellulaire ou le système modèle, ainsi que l'échelle et la conception de l'essai. Par exemple, il peut y avoir un besoin d'expression régulable. Il peut y avoir des limitations autour de la lignée cellulaire ou du système modèle. Et l'échelle et la conception de l'essai peuvent inclure les conditions et le calendrier de livraison pour terminer de manière optimale les perturbations et les rapports.

« Les stratégies de modulation génique basées sur l'ARNi et CRISPR présentent des avantages et des inconvénients qui doivent être pris en compte en fonction de la biologie des gènes étudiés », a commenté Gwen Fewell, Ph.D., directeur commercial, Transomic Technologies.

Les réactifs ARNi, qui peuvent produire des états de suppression de gènes hypomorphes ou transitoires, sont bien connus pour leur utilisation dans le sondage de cibles médicamenteuses. De plus, ces réactifs enrichissent les études sur la fonction des gènes. Les réactifs CRISPR-Cas9, qui produisent des mutations hétérozygotes et nulles propres, sont importants pour l'étude des suppresseurs de tumeurs et d'autres gènes où une perte complète de fonction est souhaitée.

Le moment de la lecture des effets d'une perturbation génétique doit être pris en compte pour s'assurer que l'essai biologique est réalisable. Les effets knockdown du gène ARNi peuvent être observés en aussi peu que 24 à 72 heures, et un knockdown génique inductible et réversible peut être réalisé. Les effets knock-out de gènes basés sur CRISPR peuvent devenir complets et permanents seulement après 10 jours.

Les réactifs ARNi et CRISPR fonctionnent bien pour les écrans de sélection positive regroupés, cependant, pour les écrans de sélection négative, l'ARNi est l'outil le plus mature. Les versions actuelles des réactifs regroupés CRISPR peuvent produire des populations mixtes contenant une fraction de mutations non nulles, ce qui peut réduire la précision globale de la lecture.

Pour répondre aux besoins de questions biologiques variées et complexes, Transomic Technologies a développé des outils ARNi et CRISPR avec des options pour une expression, une sélection et une échelle de dosage optimales. Par exemple, les réactifs shRNA shERWOOD-UltramiR de la société intègrent des avancées en matière de conception et de traitement de petits ARN pour produire une puissance et une spécificité accrues du knockdown, particulièrement important pour les cribles groupés.

Les bibliothèques de criblage d'ARNsh regroupées à séquence vérifiée offrent une flexibilité dans le choix du promoteur, des formats in vitro, des formats in vivo et un choix de vecteurs viraux pour une livraison et une expression optimales dans des lignées cellulaires biologiquement pertinentes, des cellules primaires ou in vivo.

La gamme de réactifs CRISPR-Cas9 à base de lentiviraux de la société comporte des marqueurs sélectionnables variables tels que les vecteurs exprimant l'ARN et Cas9, y compris Cas9 inductible, peuvent être co-délivrés et sélectionnés dans la même cellule pour augmenter l'efficacité de l'édition. Des options de promoteur sont disponibles pour garantir l'expression dans une gamme de types de cellules.

« Les chercheurs utilisent les réactifs ARNi et CRISPR individuellement et en combinaison comme outils de validation croisée, ou pour concevoir des modèles basés sur CRISPR afin d'effectuer des tests basés sur l'ARNi », explique le Dr Fewell. "Les plus excitants sont les cribles CRISPR et ARNi parallèles qui ont un potentiel énorme pour découvrir une nouvelle biologie."


Schéma d'un flux de travail de criblage de shRNA mis en commun développé par Transomic Technologies. Les cellules sont transduites et des criblages de sélection positifs ou négatifs sont effectués. L'amplification PCR et le séquençage du shRNA intégré dans le génome de la cellule cible permettent de déterminer la représentation du shRNA dans la population.

Technologies convergentes

La convergence de la technologie ARNi avec des outils d'édition du génome, tels que CRISPR-Cas9 et des nucléases effectrices de type activateur de transcription, combinée au séquençage de nouvelle génération permettra aux chercheurs de disséquer les systèmes biologiques d'une manière qui n'était pas possible auparavant.

« D'un point de vue purement technique, les défis pour les criblages ARNi traditionnels se résument à une livraison efficace des réactifs ARNi et à ce que ces réactifs fournissent une suppression significative, cohérente et durable des ARNm cibles », déclare Ross Whittaker, Ph.D., un chef de produit pour les produits d'édition du génome chez Thermo Fisher Scientific. « Nous avons relevé ces défis avec une série de réactifs et de bibliothèques d'ARNsi conçus pour augmenter le succès des criblages d'ARNi. »

Thermo Fisher fournit des réactifs RNAiMax de transfection lipidique, qui délivrent efficacement des siRNA. De plus, les bibliothèques d'ARNsi Silencer et Silencer Select de la société fournissent une suppression cohérente et significative des ARNm cibles. Ces bibliothèques d'ARNsi utilisent des conceptions bioinformatiques très strictes qui assurent un ciblage précis et puissant pour les études de silençage génique. La technologie Silencer Select ajoute un niveau plus élevé d'efficacité et de spécificité en raison des modifications chimiques avec la chimie des acides nucléiques verrouillés (LNA).

Les bibliothèques atténuent les inquiétudes concernant les données faussement positives ou faussement négatives. La puissance élevée permet une utilisation moindre des réactifs, ainsi, plus d'écrans ou de validations peuvent être effectués par bibliothèque.

Le Dr Whittaker pense que les chercheurs migreront régulièrement entre la technologie ARNi et CRISPR-Cas9 à l'avenir. CRISPR-Cas9 sera utilisé pour créer des lignées cellulaires modifiées non seulement pour valider les hits d'ARNi, mais également pour suivre les mécanismes sous-jacents. Les lignées cellulaires conçues avec CRISPR-Cas9 seront utilisées dans les criblages ARNi. À long terme, le criblage CRISPR-Cas9 remplacera probablement le criblage ARNi dans de nombreux cas, en particulier avec l'introduction de bibliothèques CRISPR en réseau.

Validation des anticorps avec l'ARNi

La spécificité peu fiable des anticorps est un problème répandu pour les chercheurs, mais l'ARNi apaise les inquiétudes des scientifiques en tant que méthode de validation.

La procédure introduit des ARN en épingle à cheveux courts (shRNA) pour réduire les niveaux d'expression d'une protéine ciblée. L'anticorps associé suit. Avec sa protéine renversée, un anticorps vraiment spécifique montre un signal considérablement réduit ou aucun signal sur un transfert Western. À court de modèles animaux knock-out, l'ARNi est sans doute la méthode la plus efficace pour valider les anticorps de recherche.

La méthode n'est pas courante chez les fournisseurs d'anticorps - le temps et le coût étant les principaux obstacles à son adoption, bien que certaines entreprises commencent à adopter la validation ARNi.


Surmonter les inconvénients du silencing génique avec l'ARNi

Le silençage génique par interférence ARN est devenu un outil clé dans la recherche et la découverte de médicaments depuis sa découverte par Andrew Fire et Craig Mello. L'ARNi permet le knockdown spécifique à la séquence des gènes cibles avec une analyse phénotypique ultérieure, ce qui représente une méthode simple pour attribuer des fonctions aux gènes.

Les avantages de l'ARNi incluent la haute efficacité du knockdown du gène, la capacité de cibler facilement le gène d'intérêt, ainsi qu'un silence stable et à long terme en exprimant des shRNA. Cela en fait un outil puissant qui a été appliqué avec succès pour répondre à de nombreuses questions en biologie cellulaire. Cependant, il existe également des risques lors de l'utilisation de l'ARNi qui doivent être examinés avec soin.

Les chercheurs ont démontré que les séquences d'ARNi ne se lient pas qu'à une seule cible. Ces changements dans le modèle d'expression génique de la cellule et potentiellement du phénotype donnent lieu à une signature hors cible. Les effets non identifiés d'une telle signature présentent un risque élevé de créer des résultats faussement positifs qui peuvent mettre en péril un projet complet. De plus, même les conceptions de séquences basées sur des algorithmes les plus récentes montrent une efficacité de précipitation qui est généralement de 80 % ou moins.

Les effets d'un tel knockdown spécifique mais faible peuvent être masqués par la signature hors cible, les changements phénotypiques étant indétectables. Ces problèmes peuvent rendre l'ARNi imprévisible, lente et risquée, en particulier dans la découverte de médicaments, où la vitesse et la fiabilité des résultats sont des facteurs cruciaux. Sirion Biotech a développé des technologies qui aident à surmonter les inconvénients de l'interférence ARN.


Figure 1. Criblage de 10 séquences de shRNA (shRNA1-10) pour l'extinction de Hsp90b : Le shRNA5 a été identifié avec une efficacité knockdown de plus de 95 %. L'efficacité de la séquence a été confirmée à la fois au niveau de l'ARNm et de la protéine dans les cellules NIH-3T3 qui ont été transduites avec un vecteur adénoviral exprimant shRNA5.

Dépistage des shRNA actifs

Un défi particulier avec les shRNA est de trouver des séquences très efficaces avec une efficacité validée de plus de 80 %. Sirion a développé RNAiONE™ pour une identification rapide et fiable de la séquence la plus efficace pour un gène spécifique.

RNAiONE a été utilisé dans le silençage de Hsp90b murine, une cible difficile en raison de son abondance. Dix vecteurs de validation contenant différentes séquences shRNA évaluées bioinformatiquement ciblant Hsp90b ont été transfectés dans un système cellulaire optimisé exprimant la protéine Hsp90b marquée par GFP à partir du même vecteur.

L'analyse microscopique initiale a fourni la première preuve de l'efficacité du shRNA sur la base de la lecture de la GFP. La validation du knockdown a ensuite été réalisée en mesurant le taux d'ARNm par PCR en temps réel et confirmée par analyse Western blot. Les résultats montrent que l'efficacité peut varier énormément pour différentes séquences cibles avec un knockdown compris entre 0 et plus de 90 % (Figure 1), démontrant la nécessité d'un protocole de validation approprié.

Les données illustrent également qu'une séquence hautement efficace pourrait être identifiée avec succès, malgré la forte abondance de Hsp90b dans la cellule. De plus, les résultats obtenus avec RNAiONE peuvent être appliqués de manière fiable aux différentes plates-formes de vecteurs viraux de Sirion, offrant un accès immédiat à l'analyse génique ultérieure et à la génération de modèles cellulaires de test. L'efficacité globale de RNAiONE permet à Sirion d'identifier l'ARNsh pour la plupart des gènes et d'émettre des garanties à ses laboratoires clients.


Figure 2. VariCHECK permet un basculement simultané entre une protéine de type sauvage et la protéine ectopique non dégradable en ajoutant simplement de la Doxycycline dans le milieu cellulaire.

Un modèle cellulaire avec contrôle intégré ARNi

Une condition préalable pour mener avec succès des expériences shRNA significatives, cependant, n'est pas seulement un knockdown élevé et validé, mais également l'utilisation de contrôles appropriés. VariCHECK™ sert en tant que tel un contrôle intégré parfait pour les expériences d'ARNi qui permet la confirmation des phénotypes ciblés. Ce système permet l'épuisement d'un targetX endogène, tout en surexprimant simultanément la forme ectopique indégradable de targetX, qui sauve alors un phénotype spécifique (Figure 2).

La base de VariCHECK est le système lentiviral inductible par vecteur All-In ONE de Sirion basé sur la dernière technologie 3G de Clontech. Le transactivateur constitutif dépendant de la TET est exprimé simultanément avec le gène d'intérêt inductible par la TET ou le shRNA validé. Les cellules sont transduites avec un premier vecteur qui contient le shRNA inductible ciblant le gène d'intérêt de type sauvage (GOI) et un second vecteur avec la forme indégradable ectopique indégradable du GOI.


Figure 3A. VariCHECK sert de contrôle intégré parfait pour les expériences d'ARNi. L'épuisement de la cible oncologique GOIx réduit considérablement la prolifération cellulaire dans les cellules A549.

Sans Doxycycline (Dox), ni shRNA ni expression ectopique de GOI n'ont lieu et la protéine endogène de type sauvage est présente dans la cellule. En revanche, avec Dox, les transcrits de type sauvage sont dégradés par le shRNA exprimé, tandis que la protéine ectopique est présente.

La validité de VariCHECK a été démontrée avec succès pour l'analyse fonctionnelle d'une cible oncologique (GOIx). Une lignée cellulaire stable a été générée qui a exprimé le shRNA inductible par TET contre GOIx, précédemment validé avec RNAiONE. Le knockdown du gène a été quantifié, et le clone cellulaire le plus performant avec un knockdown presque quantitatif a ensuite été transduit avec le vecteur lentiviral 2 qui a codé le GOIx ectopique indégradable inductible.

L'expression de GOIx en l'absence et en présence de Dox a été quantifiée par PCR en temps réel et analyse Western blot, respectivement, confirmant un passage presque quantitatif du type sauvage à une forme de GOIx exprimée de manière ectopique sur l'ARNm ainsi que le niveau de protéine. De plus, l'effet inhibiteur de la précipitation de GOIx sur la prolifération cellulaire a été entièrement récupéré par l'expression ectopique du GOIx indégradable, démontrant la prolifération réduite en tant que phénotype réel sur la cible (Figures 3A–C).


Figure 3B. La surexpression simultanée de la prolifération ectopique indégradable GOIx a entièrement restauré, confirmant un véritable phénotype sur la cible.

Outre sa fonction de contrôle intégré ARNi, VariCHECK peut également être appliqué pour basculer de manière réversible l'expression entre la protéine de type sauvage et une version mutante définie dans une seule lignée cellulaire. Cette approche peut être utilisée pour entreprendre une analyse fonctionnelle des protéines et de leurs mutations d'une manière rapide et tout aussi fiable, ce qui est particulièrement intéressant pour l'analyse des mutants d'échappement des médicaments anticancéreux.

Depuis sa découverte en 1998, l'inhibition de l'ARNi est devenue la méthode de choix pour les études de phénotype. Cependant, certains risques doivent être pris en compte, notamment un effet knock-down insuffisant et des effets potentiels hors cible. Cela peut être très critique dans la découverte et le développement de médicaments, et ajouter un autre point d'interrogation dans la validation des composés et des cibles, un processus qui est déjà long et risqué. Des technologies telles que RNAiONE et VariCHECK rendent l'utilisation de l'ARNi pour les scientifiques plus rapide, plus prédictive et fiable, en particulier dans la découverte de médicaments.


Figure 3C. Western blot confirme le passage quasi quantitatif du type sauvage à l'expression ectopique de GOIx après traitement Dox.


Résultats et discussion

Présentation de l'algorithme MAgeCK

Un schéma de l'algorithme MAGeCK est présenté à la figure 1. En bref, les comptes de lecture de différents échantillons sont d'abord normalisés à la médiane pour ajuster l'effet de la taille des bibliothèques et des distributions du nombre de lectures. Ensuite, la variance du nombre de lectures est estimée en partageant les informations entre les caractéristiques, et un modèle binomial négatif (NB) est utilisé pour tester si l'abondance de sgRNA diffère significativement entre les traitements et les contrôles. Cette approche est similaire à celles utilisées pour l'analyse différentielle RNA-Seq [7],[8],[13]. Nous classons les sgRNA en fonction de P-valeurs calculées à partir du modèle NB, et utilisent un algorithme d'agrégation de classement robuste (RRA) modifié [16] nommé α-RRA pour identifier les gènes sélectionnés positivement ou négativement. Plus précisément, α-RRA suppose que si un gène n'a pas d'effet sur la sélection, alors les sgRNA ciblant ce gène devraient être uniformément répartis sur la liste classée de tous les sgRNA. α-RRA classe les gènes en comparant l'asymétrie des classements au modèle nul uniforme, et priorise les gènes dont les classements sgRNA sont systématiquement plus élevés que prévu. α-RRA calcule la signification statistique du biais par permutation, et une description détaillée de l'algorithme est présentée dans la section Matériaux et méthodes. Enfin, MAGeCK rapporte les voies sélectionnées positivement et négativement en appliquant α-RRA au classement des gènes dans une voie.

Présentation de l'algorithme MAgeCK. Les comptes de lecture bruts correspondant aux ARN monoguidés (sgRNA) de différentes expériences sont d'abord normalisés à l'aide de la normalisation médiane et la modélisation moyenne-variance est utilisée pour capturer la relation entre la moyenne et la variance dans les réplicats. La signification statistique de chaque ARNsg est calculée à l'aide du modèle de moyenne-variance appris. Les gènes essentiels (à la fois sélectionnés positivement et négativement) sont ensuite identifiés en recherchant les gènes dont les sgRNA sont classés systématiquement plus haut (par importance) à l'aide d'une agrégation de rangs robuste (RRA). Enfin, les voies enrichies sont identifiées en appliquant l'algorithme RRA à la liste classée des gènes.

Ensembles de données d'écran knockout CRISPR/Cas9

Nous avons examiné trois expériences d'écran knockout CRISPR/Cas9 récemment publiées [3],[4],[6]. La première expérience (ou « ensemble de données ESC ») a effectué une sélection négative sur des cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour dépister les gènes essentiels.La deuxième expérience (ou « ensemble de données sur la leucémie ») [3] a réalisé des expériences de sélection négative similaires sur la lignée cellulaire de leucémie myéloïde chronique KBM7 et la lignée cellulaire de leucémie aiguë promyélocytaire HL-60. Les contrôles pour ces études étaient des cellules avant l'activation de Cas9. La troisième expérience (ou « jeu de données sur le mélanome ») [4] était basée sur une lignée cellulaire de mélanome humain (A375), qui héberge une mutation V600E dans le BRAF gène de protéine kinase. Dans cette étude, une sélection positive a été effectuée pour identifier les gènes dont les knock-out ont entraîné une résistance au traitement de 7 et 14 jours avec l'inhibiteur de BRAF vemurafenib (PLX), et les contrôles étaient des cellules traitées avec du diméthylsulfoxyde (DMSO).

MAgeCK surpasse les autres méthodes dans la détection de sgRNA et de gènes sélectionnés de manière significative

Nous avons comparé MAGeCK avec deux catégories différentes de méthodes, y compris des méthodes d'évaluation statistique du nombre de lectures de séquençage à haut débit à l'aide de modèles NB (edgeR et DESeq) et des méthodes conçues à l'origine pour classer les gènes dans les écrans ARNi à l'échelle du génome (RIGER et RSA). Un résumé des comparaisons entre MAGeCK et ces algorithmes est présenté dans le tableau 1.

Nous avons d'abord comparé MAgeCK avec edgeR et DESeq. Les trois algorithmes modélisent la variance élevée des sgRNA avec un nombre moyen de lectures plus élevé (figure S1 dans le fichier supplémentaire 1). Les modèles de variance de MAGeCK et DESeq sont similaires, tandis que edgeR a une estimation de variance plus faible lorsque le nombre de lectures est faible. Nous avons également évalué le FDR de différents algorithmes en effectuant des comparaisons entre les échantillons de contrôle et entre les réplicats des échantillons de traitement dans les ensembles de données ESC et mélanome (il n'y avait pas d'échantillons de traitement répliqués dans l'ensemble de données sur la leucémie). Étant donné que le système knock-out CRISPR/Cas9 ne devrait montrer aucune différence de préférence de sélection entre les échantillons de contrôle ou entre les échantillons de traitement répliqués, une bonne méthode ne devrait pas détecter de nombreux sgRNA et gènes significativement sélectionnés entre ces échantillons. MAgeCK a identifié moins d'ARNsg significativement sélectionnés à l'aide du modèle NB que edgeR et DESeq (voir la section A des documents supplémentaires dans le fichier supplémentaire 1 pour plus de détails). La distribution des calculs P-Les valeurs pour tous les sgRNA se rapprochent d'une distribution uniforme (Figure S4 dans le fichier supplémentaire 1), ce qui indique que notre modèle contrôle la spécificité pour les comparaisons où nous n'attendons aucun vrai positif.

Ensuite, nous avons comparé les performances de MAgeCK avec deux algorithmes de criblage d'ARNi, RIGER et RSA, au niveau du sgRNA et du gène. MAgeCK classe les sgRNA en fonction du NB P-valeurs, tandis que le classement de RIGER est basé sur le rapport signal sur bruit. RSA classe les sgRNA en fonction de leur changement de pli entre le traitement et les contrôles, mais cette approche introduit un biais en faveur des sgRNA avec moins de nombres de lectures (Figure S5 dans le fichier supplémentaire 1). Au niveau des gènes, la sensibilité de RIGER était plus faible, et il a identifié moins de 30 gènes sélectionnés de manière significative dans tous les ensembles de données, et a manqué de nombreux gènes essentiels (par exemple, les gènes ribosomiques) dans deux études de dépistage négatives [3], [6] ( Figure 2a). RSA avait une faible spécificité et a signalé un nombre élevé de gènes, même lors de la comparaison des contrôles ou des réplicats (Figure S6 dans le fichier supplémentaire 1, tableau S1 dans le fichier supplémentaire 2). En revanche, MAGeCK a pu détecter des gènes significatifs lors de la comparaison des traitements avec des contrôles, tout en donnant très peu de faux positifs lors de la comparaison des contrôles ou des réplicats (Figure 2a Tableau S1 dans le fichier supplémentaire 2).

Une comparaison de MAgeCK avec deux autres algorithmes d'écran d'interférence ARN, RIGER et RSA. (une) Le nombre de gènes sélectionnés de manière significative identifiés par MAGeCK, RIGER et RSA dans différentes comparaisons. Pour les comparaisons entre des échantillons de contrôle ou entre des réplicats de la même condition (surlignés en jaune), idéalement aucun gène significativement sélectionné ne doit être détecté. Les comparaisons entre les traitements et les témoins sont surlignées en vert. Voir le tableau S1 dans le fichier supplémentaire 2 pour une comparaison complète. (b) Le chevauchement des gènes les mieux classés entre le dépistage knock-out CRISPR/Cas9 et le dépistage ARNi sur l'ensemble de données sur le mélanome. L'expérience de criblage positif a été réalisée de la même manière que pour l'ensemble de données sur le mélanome [17], sauf que le criblage des shRNA groupés a été utilisé à la place du criblage knock-out CRISPR/Cas9.

Enfin, nous avons comparé les résultats de dépistage de l'ensemble de données sur le mélanome avec ceux d'une étude indépendante qui a utilisé des shRNA regroupés pour cribler les cellules A375 traitées par PLX [17]. Nous avons appliqué MAgeCK, RIGER et RSA aux écrans knock-out CRISPR/Cas9 et aux écrans shRNA et vérifié la cohérence des gènes les mieux classés (figure 2b). Bien que la cohérence globale des gènes appelés à partir des différents criblages était faible (moins de 5% de chevauchement), MAGeCK a toujours identifié des gènes plus cohérents que RIGER et RSA à des seuils différents. Cela montre que MAGeCK peut être utilisé à la fois pour les écrans ARNi et les écrans knock-out CRISPR/Cas9, et que MAGeCK identifie plus de résultats consensuels entre différentes technologies de dépistage que d'autres méthodes (tableau S2 dans le fichier supplémentaire 2).

MAgeCK rapporte des résultats solides avec différentes profondeurs de séquençage et différents nombres de sgRNA par gène

La profondeur de séquençage et le nombre de sgRNA de ciblage par gène affectent considérablement les résultats de l'expérience de dépistage par KO CRISPR/Cas9. Pour étudier l'effet de la profondeur du séquençage sur les performances, nous avons échantillonné au hasard des lectures de séquençage dans un ensemble de données de dépistage négatif (l'ensemble de données sur la leucémie) et un ensemble de données de dépistage positif (l'ensemble de données sur le mélanome), et avons utilisé MAGeCK pour identifier des sgRNA et des gènes sélectionnés de manière significative. Nous avons comparé le nombre de sgRNA et de gènes sélectionnés de manière significative qui sont identifiés pour différents nombres de lectures sous-échantillonnées (Figures 3 et 4, voir Matériels et méthodes pour plus de détails). Au niveau des sgRNA, moins de 10 % des sgRNA ont pu être détectés dans les ensembles de données avec un million de lectures (ou 3,3 % et 5,7 % des lectures dans les ensembles de données sur la leucémie et le mélanome, respectivement) par rapport aux ensembles de données complets. Au niveau des gènes, cependant, MAGeCK pouvait encore détecter, en moyenne, plus de 40 % et 80 % des gènes dans les ensembles de données complets sur la leucémie et le mélanome, respectivement. Cela suggère que l'approche d'agrégation de rangs robuste rend MAGeCK robuste à la profondeur de séquençage. Fait intéressant, MAGeCK a pu détecter plus de 30 % des sgRNA sélectionnés de manière significativement positive dans l'ensemble de données sur le mélanome en utilisant seulement 1 million de lectures (Figure 4), une fraction beaucoup plus importante par rapport aux gènes sélectionnés négativement dans les deux ensembles de données. En effet, les lectures correspondant à ces sgRNA dominent la population de la bibliothèque (Figure S7 dans le fichier supplémentaire 1) et la profondeur de séquençage requise pour détecter les sgRNA sélectionnés positivement est bien moindre dans les écrans de sélection positive.

MAgeCK est robuste contre la profondeur de séquençage et le nombre de sgRNA de ciblage par gène. (une) Le nombre de sgRNA et de gènes sélectionnés de manière significative dans l'ensemble de données sur la leucémie à l'aide de différentes profondeurs de séquençage. La profondeur de séquençage maximale pour tous les échantillons est de 30 millions. Voir Matériaux et méthodes pour les détails de l'échantillonnage. (b) Le nombre de sgRNA et de gènes sélectionnés de manière significative dans l'ensemble de données sur le mélanome à l'aide de différentes profondeurs de séquençage. La profondeur de séquençage maximale pour tous les échantillons est de 17,5 millions. Voir Matériaux et méthodes pour les détails de l'échantillonnage. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois expériences d'échantillonnage indépendantes.

Le nombre de sgRNA identifiés positivement et négativement à différentes profondeurs de séquençage. (un B). Les nombres de sgRNA sélectionnés positivement et négativement dans l'ensemble de données sur la leucémie (a) et l'ensemble de données sur le mélanome (b) sous différentes profondeurs de séquençage sont affichés. Les nombres sont normalisés par le nombre de sgRNA identifiés aux profondeurs de séquençage maximales (30 millions pour l'ensemble de données sur la leucémie, 17,5 millions pour l'ensemble de données sur le mélanome).

Nous avons ensuite évalué les performances des différents algorithmes après avoir réduit le nombre de sgRNA dans un écran knock-out CRISPR/Cas9. L'ensemble de données sur la leucémie a été utilisé car, en moyenne, >10 sgRNA ont été conçus pour cibler chaque gène. Comme les véritables gènes essentiels sont inconnus, nous avons sélectionné 168 gènes « de référence » qui sont régulièrement classés parmi les 5 % supérieurs par les trois méthodes en utilisant 10 ARNsg/gène. Nous avons ensuite testé si les algorithmes pouvaient détecter ces gènes « de référence » en utilisant moins d'ARNsg (Figure 5, voir Matériels et méthodes pour plus de détails). MAgeCK et RSA ont tous deux détecté plus de gènes de référence que RIGER, et pouvaient encore identifier plus de 80 % de ces gènes « de référence » avec quatre à six ARNsg par gène (Figure 5). Cela suggère que lorsqu'il y a moins de sgRNA disponibles pour certains gènes, MAGeCK et RSA peuvent toujours faire des appels robustes.

MAgeCK est robuste au nombre de sgRNA de ciblage par gène. Cette figure montre l'effet de différents nombres de sgRNA de ciblage par gène. Chaque barre indique le pourcentage de gènes de « référence » les mieux classés qui sont identifiés par MAGeCK, RIGER et RSA en utilisant différents nombres de sgRNA par gène. Les gènes de « référence » sont ceux qui figurent dans le top 5 % des gènes classés dans les trois méthodes lors de l'utilisation de 10 ARNsg par gène. Voir Matériaux et méthodes pour les détails de l'échantillonnage. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois expériences d'échantillonnage indépendantes.

MAgeCK identifie des gènes et des voies connus et nouveaux d'intérêt biologique

Nous avons appliqué MAGeCK aux études originales de criblage de knock-out CRISPR/Cas9 pour identifier les gènes et les voies sélectionnés positivement et négativement. Les gènes dans les voies des bases de données KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) et REACTOME ont été évalués pour l'enrichissement des voies (tableaux S3 à S10 dans le fichier supplémentaire 2, tableaux S11 à S18 dans le fichier supplémentaire 3). Dans les études de dépistage de la leucémie et ESC CRISPR/Cas9, des gènes sélectionnés négativement ont été enrichis dans de nombreuses voies fondamentales (tableaux S9 et S10 dans le fichier supplémentaire 2, tableaux S10 à S14 dans le fichier supplémentaire 3) [3],[6]. Les gènes de pluripotence et les gènes bien connus pour être essentiels à la prolifération des CES ont également été sélectionnés négativement, conformément aux observations rapportées dans l'étude originale (tableau 2). Dans l'ensemble de données sur le mélanome, la voie de phosphorylation oxydative a été négativement sélectionnée dans des conditions normales (traitées avec du DMSO à 14 jours contre DMSO à 7 jours), soutenant l'hypothèse que les cellules de mélanome sont dépendantes de la phosphorylation oxydative [18]. Dans la condition traitée par PLX, en plus des gènes qui ont été signalés auparavant [4] (tableau S7 dans le fichier supplémentaire 2), MAGeCK a également identifié plusieurs nouveaux gènes sélectionnés positivement (tableau 2), tels que CDH13 (FDR = 1,7e-2, classé 9e sur 17 419) et PPT1 (FDR = 8,5e-2, classé 14e sur 17 419). Mutations de perte de fonction de PPT1 provoquent des céroïdes lipofuscinoses neuronales et sont résistantes à l'induction de l'apoptose [3]-[6],[19]. CDH13, un suppresseur de tumeur qui régule négativement la croissance cellulaire, est fréquemment hyperméthylé et contribue à la tumorigenèse dans les mélanomes, les cancers du poumon et colorectal [7],[8],[20],[21]. Fait intéressant, ces cancers hébergent souvent une mutation BRAF V600E qui peut être traitée avec l'inhibiteur BRAF PLX, et cette mutation est également présente dans la lignée cellulaire de mélanome utilisée dans ce criblage knock-out CRISPR/Cas9. Nos résultats impliquent que les patients atteints de tumeurs portant des mutations BRAF V600E pourraient avoir une réponse sous-optimale au traitement PLX si leurs tumeurs ont CDH13 hyperméthylation.

MAgeCK permet un criblage bidirectionnel et un criblage spécifique au type cellulaire

Bien que les études originales sur la leucémie et l'ESC soient des dépistages négatifs et que l'étude sur le mélanome soit un dépistage positif, MAGeCK est également capable d'effectuer une analyse bidirectionnelle pour rechercher simultanément des gènes sélectionnés positivement et négativement. Cette fonctionnalité permet à MAgeCK d'obtenir des informations biologiques au-delà de la conception originale de l'écran. Par exemple, MAGeCK a identifié plusieurs gènes sélectionnés positivement à partir des deux écrans de sélection négative (les ensembles de données sur la leucémie et l'ESC) et des gènes sélectionnés négativement dans l'écran de sélection positive (l'ensemble de données sur le mélanome) (tableau 2, tableaux S4 et S8 dans le fichier supplémentaire 2, tableau S12 dans le fichier supplémentaire 3). Dans l'ensemble de données sur la leucémie, MAGeCK a identifié 23 gènes sélectionnés positivement, dont le knock-out induit la prolifération cellulaire. Ils comprennent MAP4K3 (FDR = 0,14, classé 9e sur 7 115), une kinase suppresseur de tumeur dans la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) qui induit l'apoptose [9]-[11],[22], et EPM2A (FDR = 0,14, classé 10e sur 7 115), une autre protéine phosphatase qui régule négativement la progression du cycle cellulaire [7],[23]. À partir de l'ensemble de données ESC, TRP53, un orthologue de souris de l'humain TP53 Le gène suppresseur de tumeur [8],[24], a été classé premier parmi les trois gènes identifiés positivement. Les fonctions régulatrices négatives de ces gènes sont cohérentes avec nos résultats selon lesquels leur suppression confère un avantage sélectif pour la croissance cellulaire. À partir de l'ensemble de données sur le mélanome, MAGeCK n'a identifié qu'un seul gène sélectionné négativement, RREB1, dans le traitement PLX de 14 jours. RREB1 (FDR = 0,05, classé 1er sur 17 419) est un facteur de transcription et un activateur en aval de la voie de signalisation RAS-RAF [12],[25],[26], qui est étroitement liée à la BRAF mutation trouvée dans les cellules A375 [13], [27]. Fait intéressant, MAgeCK a également trouvé EGFR (FDR = 0,025, classé 6e sur 17 419) et ses voies associées à sélectionner négativement dans les échantillons traités au PLX à 7 jours, ce qui implique que les cellules traitées au PLX sont plus dépendantes de EGFR. Notre résultat est cohérent avec les études récentes liant ectopique EGFR expression dans les cellules de mélanome à la résistance au PLX [14],[28] et avec l'efficacité améliorée de BRAF et EGFR inhibition combinée dans les cellules cancéreuses colorectales avec la mutation BRAF V600 [15],[29].

Enfin, nous avons appliqué MAGeCK pour identifier les gènes et les voies essentiels spécifiques au type de cellule qui diffèrent entre la lignée cellulaire de leucémie myéloïde chronique KBM7 et la lignée cellulaire de leucémie promyélocytaire aiguë HL-60, qui font partie de l'ensemble de données sur la leucémie [3],[7] ,[8],[13] (tableaux S15 à S18 dans le dossier supplémentaire 3). MAgeCK a identifié la voie de « leucémie myéloïde chronique » de KEGG comme essentielle dans KBM7 (FDR = 9.00e-4, classé 6e sur 181), distinguant correctement les différences de type cellulaire entre KBM7 et HL-60. Au niveau des gènes, IGF1R (FDR = 1,98e-3, classé 1er sur 7 115) s'est avéré être spécifiquement essentiel dans HL-60, ce qui est cohérent avec l'observation selon laquelle un IGF1R l'inhibiteur réduit la prolifération et induit l'apoptose dans les cellules HL-60 [16], [30]. De plus, MAgeCK a identifié RBC (FDR = 1,60e-3, classé 7e sur 7 115) et ABL1 (FDR = 1,98e-3, classé 18e sur 7 115) comme spécifiquement essentiel dans KBM7, ce qui est cohérent avec la présence du BCR-ABL fusion dans cette lignée cellulaire [3],[4],[6],[31]. La capacité de MAGeCK à identifier les gènes essentiels spécifiques à un type de cellule sera très utile à mesure que davantage de données de criblage par inactivation CRISPR/Cas9 deviendront accessibles au public.


Introduction

La robustesse génétique est la capacité d'un organisme vivant à maintenir sa viabilité et sa forme physique malgré les variations génétiques, y compris les perturbations. Les perturbations génétiques jouent un rôle important dans l'évolution, cependant, les organismes ont besoin de systèmes tampons pour assurer des résultats de développement similaires malgré des différences mineures dans la constitution génétique ou les conditions environnementales, un processus connu sous le nom de robustesse ou de canalisation [1, 2]. En 1932, la compensation de dose a été signalée comme le premier exemple de robustesse génétique. Il a été rapporté que les mouches des fruits mâles présentaient une multiplication par deux de la transcription à partir de leur chromosome X unique, entraînant les mêmes niveaux d'expression génique que les femelles avec deux chromosomes X actifs [3, 4]. En revanche, chez les mammifères, les femelles subissent l'inactivation de l'un de leurs chromosomes X par hétérochromatisation, permettant des résultats de développement similaires chez les deux sexes [5-7]. Le concept de robustesse génétique a été étayé par plusieurs études récentes : par exemple, seulement 20 % des gènes codant pour des protéines chez la levure ont été signalés comme essentiels à la croissance dans des conditions de laboratoire [8], et un manque de phénotype a été signalé pour plusieurs souris [9], poisson zèbre [10], et Arabidopsis [11] mutants.

La robustesse génétique peut provenir de gènes redondants, la perte d'un gène pouvant être compensée par un autre avec des fonctions et un schéma d'expression qui se chevauchent, comme indiqué pour plusieurs mutants dans une gamme d'organismes modèles [12–19] (examiné dans [20]). Une autre forme de robustesse découle des réseaux cellulaires étroitement régulés, notamment les réseaux métaboliques, de signalisation et de transcription. La perturbation de la fonction d'un gène particulier dans un réseau peut altérer l'expression d'autres gènes au sein du même réseau, maintenant ainsi le bien-être cellulaire [21, 22]. De plus, en réponse à un knock-out génique, des organismes tels que la levure peuvent accumuler des mutations dans un ou plusieurs gènes modulant la voie affectée, sauvant ainsi partiellement ou totalement le résultat final [23, 24].

Alors que les modes de robustesse génétique mentionnés ci-dessus peuvent survenir à la suite de la perte de fonction d'une protéine spécifique, un certain nombre d'études suggèrent une forme différente de robustesse génétique, celle qui est déclenchée en amont de la fonction de la protéine (ci-après dénommée compensation ou adaptation transcriptionnelle [Tableau 1]) [25–27]. L'utilisation croissante d'avancées récentes dans les outils de génétique inverse a révélé des différences phénotypiques entre les knock-out (c'est-à-dire les mutants) et les knockdowns (p. Arabidopsis [28-30], souris [31-34], Drosophile [35], le poisson zèbre [10, 36] et les lignées cellulaires humaines [37-39]. Alors que certaines études ont attribué ces différences phénotypiques à la toxicité ou aux effets hors cible des réactifs knockdown [40-43] (examiné dans [44]), une étude récente chez le poisson zèbre a proposé des changements d'expression génique et une compensation conséquente chez les animaux mutants mais pas knockdown comme la raison des différences observées [25]. Alors que le renversement de egfl7, un gène de la matrice extracellulaire endothéliale (MEC), entraîne de graves anomalies vasculaires, la plupart egfl7 les mutants ne présentent aucun défaut évident. Cet écart a été attribué au moins en partie à la régulation à la hausse d'autres protéines ECM, en particulier Emilins, dans egfl7 des mutants mais pas des embryons injectés antisens. De plus, les auteurs ont observé des défauts vasculaires mineurs ou inexistants egfl7 injections de MO dans egfl7 mutants, indiquant que les différences phénotypiques ne sont pas dues à la toxicité des MO. De plus, cette étude a rapporté une régulation à la hausse de végétarienne niveaux d'ARNm dans vegfaa des animaux mutants mais pas knockdown. Alors que les mécanismes déclenchant la réponse d'adaptation transcriptionnelle dans vegfaa les animaux mutants restent inconnus, les auteurs proposent qu'il se situe en amont de la fonction protéique, comme la surexpression de Vegfaa dominant-négatif, ce qui provoque une vegfaa phénotype de type mutant, n'a pas conduit à une augmentation de végétarienne niveaux d'ARNm. Dans cette revue, nous nous concentrons sur les études rapportant l'adaptation transcriptionnelle et/ou la compensation génétique chez les eucaryotes supérieurs et décrivons les mécanismes moléculaires sous-jacents possibles.

La compensation génétique en réponse au knock-out du gène est un phénomène répandu

La régulation à la hausse de gènes apparentés à la suite d'un knock-out de gène peut être une conséquence directe de la perte de la fonction protéique. Par exemple, les souris dépourvues du gène ribosomique Rpl22 ne présente aucun défaut de traduction en raison de la régulation à la hausse de son paralogue, Rpl22l1, dont l'expression est normalement inhibée par RPL22 [46]. La régulation à la hausse de gènes apparentés due à la perte d'une boucle de rétroaction négative peut être la première hypothèse à tester lorsqu'un mutant ne parvient pas à montrer un phénotype, et une approche knockdown peut aider à le tester. Par exemple, l'humain RBL2 les lymphocytes T mutants prolifèrent normalement et présentent une fonction immunitaire normale en raison de la régulation positive de RBL1, une régulation positive également détectée lors RBL2 knockdown dans les lignées cellulaires du cancer du sein humain [47, 48], suggérant une boucle de rétroaction négative. De même, les KO et les knockdowns de HDAC-1 conduire à la régulation positive de HDAC-2 dans plusieurs lignées cellulaires et tissus humains et murins, et vice versa [49-51].

En revanche, l'absence de réponse compensatoire chez les animaux knockdown par rapport à leurs mutants correspondants indique qu'un déclencheur en amont de la fonction protéique est en jeu, peut-être la lésion génomique elle-même ou l'ARNm mutant (tableau 2). Par exemple, l'épuisement de la TET1 induit par les petits ARN interférents (ARNsi), une enzyme qui convertit la 5-méthylcytosine (5mC) en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs) conduit à une réduction significative des niveaux de 5hmC et une perte de morphologie indifférenciée en contraste, Tet1 les mESC mutants ne présentent qu'une légère diminution des niveaux de 5hmC et conservent une morphologie indifférenciée [52], suggérant une compensation possible par l'enzyme étroitement apparentée, TET2, dans les mESC mutants mais pas knockdown [53]. De plus, alors qu'il a été rapporté que le knockdown de l'un des trois membres de la famille des cyclines D inhibe la prolifération dans plusieurs lignées cellulaires [54-56], les souris dépourvues d'une seule isoforme développent des défauts minimes, suggérant une compensation par l'un des autres gènes [57-59 ]. En effet, KO de deux Cycline D gènes chez la souris conduit à la régulation à la hausse du troisième Cycline D gène. En conséquence, les souris à double knock-out présentent des phénotypes mineurs uniquement dans les tissus qui ne parviennent pas à réguler à la hausse le troisième Cycline D gène [60]. De plus, la souris Cycline D2 les lymphocytes B mutants ne présentent aucun phénotype prolifératif évident en raison de la régulation positive de Cycline D3 [61]. De plus, le knockdown médié par l'ARN en épingle à cheveux court (shRNA) Importationα5 a été rapporté pour inhiber la différenciation neurale des cellules mESCs [62] cependant, Importationα5 les souris mutantes présentent un développement cérébral normal, probablement en raison de la régulation positive de l'expression d'IMPORTINα4 [63]. knockdown médié par siARN de Kindlin-2, qui code pour un coactivateur d'intégrine, dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) a été signalé comme diminuant l'activation d'INTEGRIN β1 et empêchant l'augmentation du nombre d'adhérence focale médiée par INTERLEUKIN 1β [64]. Cependant, Kindlin-2 les cellules mutantes étaient capables de former des adhérences focales en raison de la régulation positive de KINDLIN-1 [65].

Dans un autre exemple, le knockdown à médiation antisens de Tau a été rapporté pour inhiber l'élongation axonale dans les cellules neuronales en culture [77, 78]. Cependant, l'élongation axonale n'a pas été affectée dans les neurones cultivés de Tau mutants, probablement en raison de la régulation positive de la protéine 1A associée aux microtubules (MAP1A) [79]. Il est intéressant de noter qu'une telle régulation à la hausse n'a pas été détectée lors de Tau knockdown dans les oligodendrocytes de souris [80]. Dystrophine Il a été rapporté que les souris mutantes ne développent pas de phénotype de dystrophie musculaire sévère en raison de la régulation positive d'un certain nombre de gènes, y compris celui codant pour la protéine liée à la dystrophine UTROPHIN [81, 82]. Fait intéressant, la régulation à la hausse d'UTROPHIN n'a pas été détectée dans Dystrophine souris knockdown [83].

Par ailleurs, -actine On a signalé que les souris mutantes présentaient une régulation à la hausse de la transcription de plusieurs autres Actine gènes, y compris -actine et -actine [27, 84, 85]. Fait intéressant, la restauration de -actine expression dans -actine les MEF mutants n'ont pas conduit à une réduction de la -actine réponse de régulation à la hausse transcriptionnelle, impliquant que cette réponse d'adaptation transcriptionnelle est déclenchée en amont de la fonction β-ACTIN [27]. En outre, -actine KO, mais pas knockdown, dans les MEF conduit à αsm-régulation positive de l'ACTINE [85]. De plus, alors que la déplétion médiée par les siARN de la protéine centrosomique AZI1 dans les MEF entraîne une diminution significative de la ciliogenèse, les MEF dérivés de azi1 les souris mutantes ne présentent aucun défaut de ciliogenèse [26]. Les auteurs ont également rapporté que azi1 les MEF mutants étaient résistants à azi1 siRNA, excluant les effets hors cible des siRNA et les conduisant à émettre l'hypothèse de l'existence d'une réponse compensatoire dans les MEF mutants. Il est intéressant de noter que cette compensation potentielle n'est pas observée lors de la formation des flagelles des spermatozoïdes. Cette approche consistant à tester le réactif antisens dans des cellules mutantes a ensuite été utilisée par Rossi et al. chez le poisson zèbre [25] et peut être un outil puissant pour identifier les cas de compensation chez les mutants par rapport aux effets non spécifiques des réactifs knockdown.

Études de perte de fonction globale versus conditionnelle

La réduction ou l'absence d'un phénotype chez plusieurs mutants de la lignée germinale par rapport à leurs homologues conditionnels a été rapportée dans un certain nombre d'études chez la souris. Par exemple, des mutants de lignée germinale pour Pkm2 sont viables et fertiles [86] cependant, la suppression conditionnelle de Pkm2 dans les MEF limite la synthèse des nucléotides, conduisant à l'arrêt du cycle cellulaire [87]. De la même manière, Sirt1 les souris mutantes n'ont pas d'anomalies hépatiques évidentes, tandis que des souris spécifiques aux hépatocytes Sirt1 les souris mutantes développent une stéatose hépatique [88]. Souris avec conditionnel Fgfr3 la délétion dans les chondrocytes présente des lésions de type chondrone plus sévères (et une incidence plus élevée) par rapport aux souris mutantes globales [89]. De plus, la perte conditionnelle du suppresseur de tumeur RETINOBLASTOMA (RB1) permet la réentrée dans le cycle cellulaire des MEF primaires au repos, tandis que les MEF au repos dérivés de Rb1 les animaux mutants sont incapables de réintégrer le cycle cellulaire, du moins en partie à la régulation positive compensatrice de p107 [90]. De plus, alors que CD44 les souris mutantes globales ne présentent que des phénotypes légers [91, 92], les souris mutantes spécifiques des kératinocytes présentent une rigidité épidermique réduite et un retard de cicatrisation, ainsi qu'une prolifération réduite des kératinocytes en réponse au 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate [93]. Alors que des effets non autonomes cellulaires peuvent sous-tendre certaines de ces divergences, une hypothèse alternative est qu'un réseau compensatoire s'établit au cours de la maturation de la lignée germinale ou du développement embryonnaire, permettant à l'organisme de s'adapter à la mutation. Des données récentes chez le poisson zèbre suggèrent cependant qu'une mutation n'a pas besoin de traverser la lignée germinale pour induire une réponse compensatoire [25], indiquant que de multiples mécanismes peuvent sous-tendre ce processus.

Mécanismes sous-jacents à la réponse d'adaptation transcriptionnelle

Sur la base des observations rapportées jusqu'à présent, on peut identifier au moins deux déclencheurs possibles de la réponse d'adaptation transcriptionnelle : (1) la lésion de l'ADN et (2) l'ARNm mutant. Nous allons d'abord spéculer sur la façon dont chacun de ces déclencheurs potentiels pourrait conduire à une adaptation transcriptionnelle, puis passer brièvement en revue d'autres déclencheurs potentiels, y compris certains qui pourraient induire une adaptation post-transcriptionnelle.

Lésion de l'ADN comme déclencheur de la réponse d'adaptation transcriptionnelle.

Cette section se concentrera sur la lésion de l'ADN étant le déclencheur de la réponse d'adaptation transcriptionnelle et explorera principalement le rôle potentiel des changements épigénétiques suite à des dommages à l'ADN.

Suite à des dommages à l'ADN, une réorganisation globale de la chromatine et une décondensation sont détectées [94, 95], des actions médiées par plusieurs remodeleurs de la chromatine et des enzymes modifiant les histones (revues dans [96]). Une possibilité est qu'en réponse à une mutation, la réorganisation globale de la chromatine puisse affecter positivement l'accessibilité de la chromatine autour du ou des gènes compensateurs, entraînant ainsi une augmentation des niveaux d'expression (figure 1A). Une partie d'un tel modèle est cohérente avec le processus de compensation de dosage dans Drosophile où les protéines létales spécifiques aux mâles (MSL), ainsi que d'autres protéines, forment un complexe sur le chromosome X mâle conduisant à l'acétylation de H4K16 et à l'induction subséquente d'une configuration de chromatine ouverte, qui est plus accessible pour la transcription [97]. Le long de ces lignes, un Caenorhabditis elegans étude a attribué la pénétrance incomplète des phénotypes intestinaux dans skn-1 mutants [98] à la grande variabilité de l'expression du gène compensateur fin-1 [99]. Fait intéressant, cette variabilité de fin-1 l'expression a été attribuée à des différences dans le remodelage de la chromatine au niveau des loci contrôlant fin-1 expression. Il sera donc intéressant de comparer l'accessibilité de la chromatine au niveau des régions régulatrices des gènes régulés à la hausse dans des échantillons de type sauvage, mutants et knockdown.

(UNE) La réponse aux dommages de l'ADN peut induire une réorganisation de la chromatine, augmentant l'accessibilité de la chromatine dans les régions régulatrices des gènes compensatoires. (B) Les mutations peuvent conduire à des transcrits ciblés pour la dégradation par des voies de surveillance de l'ARNm. Les fragments d'ARN résultants peuvent déclencher la réponse compensatoire. En tant qu'effet secondaire de la dégradation de l'ARNm du gène muté, les RBP ou les miARN agissant normalement sur les ARNm des gènes mutés ainsi que les gènes compensateurs deviennent plus disponibles pour exercer leurs effets stabilisants sur les ARNm des gènes compensateurs. Abréviations : miARN, microARN RBP, protéines de liaison à l'ARN TF, facteurs de transcription.

La réorganisation de la chromatine peut s'accompagner de changements dans la boucle de l'ADN et l'organisation nucléaire [100], qui peuvent également affecter l'expression des gènes. Les interactions interchromosomiques sont bien documentées (examinées dans [101]), et il a été démontré que différents types de stress, tels que la température, augmentent les interactions interchromosomiques dans Drosophile [102]. Le stress induit par les dommages à l'ADN pourrait également conduire à des modifications des interactions interchromosomiques, y compris celles entre le gène muté et certains autres loci conduisant à une régulation positive de gène spécifique. Des études de capture de chromosomes dans des échantillons de type sauvage et mutants pour identifier les changements dans les interactions interchromosomiques peuvent aider à tester ce modèle.

Menant à un modèle potentiel différent, un certain nombre d'études ont rapporté la génération de petits ARN non codants (ARNnc) à partir de régions couvrant une cassure double brin (DSB), appelés ARN induits par DSB (diARN) [103, 104] ( examiné dans [105]). Les auteurs ont proposé que ces diARN soient essentiels pour la réparation des dommages à l'ADN (DDR), peut-être en agissant comme guides pour les remodeleurs de la chromatine ou les protéines importantes pour la DDR. Ainsi, les diARN pourraient également guider des facteurs de transcription (TF) spécifiques ou des remodeleurs de la chromatine vers les régions régulatrices des gènes compensateurs par le biais d'interactions basées sur l'homologie, conduisant à une transcription accrue. Un tel modèle de petits ARNnc guidant des facteurs de transcription spécifiques ou des remodeleurs de la chromatine pour moduler l'expression des gènes est cohérent avec les publications décrivant que roX1 et roX2 Les ARN sont essentiels pour la réponse dose-compensation dans Drosophile mâles en guidant l'assemblage du complexe protéique MSL sur le chromosome X et les modifications subséquentes des histones [106–108] (revue dans [97]).

Une question pour ces modèles impliquant le remodelage de la chromatine concerne la transmission de la réponse d'adaptation transcriptionnelle à la génération suivante. L'empreinte génomique via la modification des histones [109-111] (revue dans [112]) est un mécanisme possible.

De plus, l'induction de GADD45A Il a été rapporté que l'expression suite à des dommages à l'ADN induisait une déméthylation globale de l'ADN dans les cellules HEK293T, conduisant à une activation accrue des promoteurs inhibés par la méthylation [113]. Ainsi, il convient également d'évaluer l'état de méthylation des régions régulatrices des gènes régulés à la hausse. Cependant, à notre connaissance, aucun lien n'a été établi à ce jour entre les lésions de l'ADN et les changements dans les modèles de méthylation de l'ADN à des loci spécifiques (c'est-à-dire de compensation).

Étant donné que tous ces modèles sont basés sur des lésions de l'ADN, il sera important d'évaluer l'adaptation transcriptionnelle après avoir induit différents types de mutations. On s'attendrait à une régulation positive des mêmes gènes suite à tous les types de mutations, y compris celles non délétères.

L'ARNm mutant comme déclencheur de la réponse d'adaptation transcriptionnelle.

Cette section se concentrera sur l'ARNm mutant étant le déclencheur de la réponse d'adaptation transcriptionnelle. Après avoir passé en revue quelques exemples, nous nous concentrerons spécifiquement sur la façon dont la fragmentation de l'ARN par différentes voies de surveillance de l'ARNm pourrait déclencher une telle réponse.

Les mutations conduisent souvent à des ARNm avec un codon de terminaison prématurée (PTC), des structures secondaires qui bloquent la translocation ribosomique ou, moins fréquemment, des ARNm dépourvus de codon d'arrêt. La présence de tels ARNm déclenche respectivement les voies de décomposition non-sens (NMD), no-go decay ou no-stop, qui entraînent une dégradation de l'ARNm (examiné dans [114-116]). Une étude récente chez le poisson zèbre a rapporté que deux mutations différentes dans le même exon de mt2 entraîner différents degrés de sévérité phénotypique. Étonnamment, l'allèle mutant avec le phénotype le plus doux présentait un degré plus élevé de NMD. L'inactivation antisens de la voie NMD et la diminution conséquente de la dégradation de l'ARNm mutant ont conduit à un phénotype plus sévère, cohérent avec la possibilité que la NMD déclenche une réponse compensatoire qui diminue la gravité du phénotype mutant [117]. Une hypothèse est que les fragments d'ARN résultant des voies de surveillance de l'ARNm fonctionnent pour réguler l'expression des gènes. Alors que la compréhension actuelle dans le domaine est que les voies de surveillance de l'ARNm conduisent à une dégradation processive de l'ARNm [114, 118], il est possible que des intermédiaires de dégradation de courte durée et relativement rares soient présents.

Si les fragments sont suffisamment longs, on peut émettre l'hypothèse qu'ils agissent de manière similaire aux longs ARN non codants (examinés dans [119]) et, par exemple, guident des facteurs de transcription spécifiques ou des remodeleurs de la chromatine vers les régions régulatrices des gènes compensateurs par homologie. appariement de bases médié (Fig 1B). D'autres études ont rapporté que l'injection de fragments d'ARN courts (20-22 nt) à partir d'un ARNm spécifique conduit à une transcription accrue du locus correspondant [120, 121]. D'un point de vue mécanique, les auteurs rapportent que les fragments d'ARN sens injectés peuvent former des duplex d'ARN double brin (ARNdb) avec de courts transcrits antisens normalement produits à partir du locus. Les ARNdb résultants peuvent ensuite être utilisés par la machinerie d'interférence ARN (ARNi) d'une manière dépendante d'ARGONAUTE pour induire des modifications de la chromatine au locus et augmenter les marques d'histones d'euchromatine ou diminuer les marques d'histones d'hétérochromatine. Bien que la machinerie exacte sous-jacente à ces changements épigénétiques induits par l'ARNdb reste inconnue, ce modèle est cohérent avec plusieurs autres études rapportant une activation transcriptionnelle par modification des histones après ciblage de l'ARNdb vers la région promotrice de divers gènes [122-125]. Des analyses antérieures du transcriptome murin et humain ont identifié plusieurs transcrits antisens qui peuvent participer à la formation de paires sens/antisens [126-130]. Ainsi, on pourrait émettre l'hypothèse que les fragments d'ARN agissent de manière similaire et forment des duplex d'ARNdb avec des transcrits antisens à partir des loci de compensation, conduisant à une régulation à la hausse de la transcription.

Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) peuvent également réguler l'expression des gènes de plusieurs manières (examinées dans [131]), dont l'une consiste à augmenter l'expression des gènes en stabilisant les ARNm [132]. La liaison hautement dynamique des RBP est régulée par les conditions cellulaires. Par conséquent, la régulation des interactions RBP à la suite d'un stress génotoxique peut être un mécanisme permettant à la cellule de compenser un gène perdu. Le long de ces lignes, les ARNm qui codent pour des protéines fonctionnellement apparentées ont tendance à être corégulés par des RBP spécifiques, formant ce que l'on appelle des opérons d'ARN ou des régulons d'ARN [133-135] (examinés dans [136]). Ainsi, les gènes mutants et compensateurs pourraient être régulés par les mêmes RBP, et si l'ARNm mutant est soumis à une dégradation ou si sa structure secondaire est affectée par la mutation (affectant ainsi la liaison RBP), les RBP deviendraient disponibles pour stabiliser les gènes compensatoires. ' ARNm (figure 1B).

Outre leur fonction bien connue de silençage de l'expression des gènes [137], les micro-ARN (miARN) peuvent améliorer l'expression des gènes par plusieurs mécanismes. Bien que les miARN ciblent normalement les ARNm, miARN-373 a été signalé comme liant les régions promotrices de CDH1 et CSDC2 dans les cellules PC3 (une lignée cellulaire humaine du cancer de la prostate) et induisent leur expression par un mécanisme inconnu [138]. les miARN peuvent également augmenter la traduction de certains ARNm par exemple, dans des conditions de privation d'acides aminés, miARN10a a été rapporté pour se lier à la 5'UTR des ARNm de protéines ribosomiques et améliorer leur traduction [139]. Les miARN ont plusieurs ARNm cibles [140, 141] et, ainsi, si une mutation entraîne une dégradation de l'ARNm, les miARN ciblant le gène affecté deviendront disponibles pour moduler d'autres cibles (Fig 1B).

Étant donné que ces modèles reposent sur la génération et la dégradation potentielle d'ARNm à partir du locus muté, on ne s'attendrait pas à une régulation à la hausse de gènes potentiellement compensateurs en l'absence de transcription active de l'ARNm mutant. Il sera donc important d'évaluer l'adaptation transcriptionnelle dans les allèles où un ARNm n'est pas produit.

Autres mécanismes potentiels pour la réponse compensatoire.

Cette brève section se concentrera sur l'augmentation de la réponse traductionnelle suite à la perte mutationnelle de gènes spécifiques et évoquera des processus tels que les modifications de l'ARNm et les cadres de lecture ouverts en amont.

En réponse au stress (comme le choc thermique), la pseudouridylation ou la N6-méthylation des adénosines (m6A) a été rapportée comme étant enrichie sur certains ARNm, augmentant ainsi leur stabilité ou favorisant leur traduction [142, 143] (revue dans [144]) . Cependant, comme c'est le cas pour la méthylation de l'ADN, il n'y a eu jusqu'à présent aucun rapport sur les ARNm de loci sélectifs modifiés de cette manière.

Les cadres de lecture ouverts en amont (uORF) sont des éléments régulateurs présents dans les 5'UTR d'environ 50 % des ARNm des vertébrés [145, 146]. Ils peuvent agir comme des répresseurs traductionnels, car la traduction des uORF peut se produire au détriment de celle de la séquence codante de l'ARNm [147, 148].Dans des conditions de stress cellulaire, il existe une tendance à inhiber la traduction globale en phosphorylant eIF2α, qui agit alors comme un inhibiteur compétitif du facteur d'initiation de la traduction eIF2B, réduisant ainsi les taux de réinitiation de la traduction [149]. Ce mécanisme peut permettre l'augmentation de la traduction de certains ARNm sous stress cellulaire. Par exemple, le gène du facteur de transcription de levure GCN4 a 4 uORF et dans des conditions normales, les 4 uORF sont traduits avec moins de réinitiation au niveau de l'ORF principal. Sous stress nutritionnel, le premier uORF est traduit efficacement, cependant, en raison de la phosphorylation d'eIF2α, les uORF restants sont mal traduits et la réinitiation ne se produit qu'au niveau du principal ORF, augmentant ainsi la production de GCN4 [150]. Il est donc possible que certaines mutations géniques induisent un stress cellulaire, permettant un saut d'uORF et une traduction accrue des gènes compensateurs. Cependant, comme c'est le cas pour les modifications de la méthylation de l'ADN et de l'ARN mentionnées ci-dessus, il n'est pas clair comment la spécificité, en termes de régulation positive des protéines sélectives, surviendrait.


Conclusion:

Le mécanisme de silençage génique rend les gènes inactifs, nous le savons maintenant. Mais il peut parfois causer des effets indésirables même dans les plantes. C'est pourquoi les techniques de manipulation génique, d'édition génique et de silençage génique doivent être utilisées avec une autorisation préalable.

Les scientifiques sont maintenant presque prêts avec la nouvelle approche de silençage génique médiée par l'interférence ARN pour la maladie de Huntington. De plus, diverses approches de différentes maladies génétiques sont maintenant en phase de recherche.


Voir la vidéo: EENVOUDIG DIAMOND SYSTEEM VOOR IEDERE BILJARTER! Carambole Biljarten (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Aodh

    Je trouve que c'est l'erreur.

  2. Erhardt

    Il s'est avéré entrer uniquement via Internet Explorer =)

  3. Basho

    C'est dommage que je ne puisse pas parler maintenant - il n'y a pas de temps libre. Mais je reviendrai - j'écrirai certainement ce que je pense sur cette question.

  4. Daikree

    Bravo, c'est tout simplement magnifique idée



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