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Comment les ARN porteurs augmentent-ils le rendement des expériences de séquençage ?

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J'aimerais savoir comment les ARN porteurs augmentent le rendement dans les expériences de séquençage ARN/ADN. Leur fonction principale est-elle dans les étapes de précipitation de chaque protocole (c'est-à-dire que de petites quantités sont difficiles à précipiter et que les ARN porteurs ajoutent du matériel), ou ont-ils également un rôle à d'autres étapes du processus ?


Si vous ajoutez de l'ARNt extrait au phénol-chloroforme, il s'agit d'un support pour les étapes de précipitation. Certaines personnes utilisent l'acrylamide linéaire dans le même but.


Lignes directrices pour les expériences utilisant des oligonucléotides antisens et des ARN double brin

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Faculté de médecine, Southern Illinois University, Carbondale, Illinois.

Département de chimie et de biochimie, Southern Illinois University, Carbondale, Illinois.

Adressez la correspondance à : David R. Corey, PhD, Départements de pharmacologie et de biochimie, UT Southwestern Medical Center à Dallas, 6001 Forest Park, Dallas, TX 75390

Départements de pharmacologie et de biochimie, UT Southwestern Medical Center à Dallas, Dallas, Texas.


Résumé

Les structures complexes d'ARN d'ordre supérieur jouent un rôle essentiel dans toutes les facettes de l'expression des gènes, cependant, les réseaux d'interaction à travers l'espace qui définissent les structures tertiaires et régissent l'échantillonnage de plusieurs conformations sont mal compris. Nous décrivons ici l'analyse de la structure de l'ARN à molécule unique dans laquelle plusieurs sites de modification chimique sont identifiés dans des brins d'ARN uniques par séquençage massivement parallèle, puis analysés pour les interactions corrélées et groupées. La stratégie identifie ainsi les groupes d'interaction d'ARN par profilage mutationnel (RING-MaP) et permet deux applications étendues. Tout d'abord, nous identifions les interactions à travers l'espace, créons des modèles 3D pour les ARN couvrant 80 à 265 nucléotides et caractérisons de larges classes d'interactions intramoléculaires qui stabilisent l'ARN. Deuxièmement, nous distinguons des conformations distinctes dans des ensembles de solutions et révélons des états cachés auparavant non détectés et des reconfigurations structurelles à grande échelle qui se produisent dans les ARN dépliés par rapport aux états natifs. L'interrogation de la structure de l'acide nucléique à molécule unique RING-MaP permet une analyse concise et facile des architectures globales et des conformations multiples qui régissent la fonction dans l'ARN.

L'ARN joue un rôle central dans l'expression et la régulation des gènes. Ces fonctions sont médiées par des niveaux d'information à plusieurs niveaux : la plus simple est la séquence primaire et la plus complexe est la structure d'ordre supérieur qui régit les interactions avec les ligands, les protéines et d'autres ARN (1, 2). De nombreux ARN peuvent former plus d'une structure stable, et ces conformations distinctes ont souvent des activités biologiques différentes (3, 4). Actuellement, le taux de description de nouvelles séquences d'ARN dépasse largement les capacités à examiner leurs structures.

Ici, nous caractérisons les interactions à travers l'espace et les conformations multiples dans des ARN uniques en fusionnant le sondage chimique et le séquençage massivement parallèle. Parce que le séquençage massivement parallèle rapporte les séquences de modèles uniques, chaque lecture est fondamentalement une observation d'une seule molécule (5). Nous avons d'abord modifié l'ARN avec un réactif sensible à la structure sous-jacente de l'ARN, puis avons détecté plusieurs adduits dans les brins d'ARN individuels (Fig. 1). Les adduits chimiques ont été détectés en tant que mutations de séquence sur la base de leur capacité à induire une mauvaise lecture efficace du nucléotide matrice par une enzyme transcriptase inverse, une approche appelée profilage mutationnel, ou MaP (6). Les données de sondage d'une molécule unique ont été utilisées de deux manières distinctes : pour détecter des modifications d'ARN corrélées reflétant des interactions à travers l'espace d'ordre supérieur (Fig. 1UNE) et d'examiner plusieurs conformations dans des ensembles uniques en solution (Fig. 1B).

Analyse de la structure de l'ARN d'une molécule unique par séquençage massivement parallèle. (UNE) Les molécules d'ARN subissent des variations structurelles locales et une « respiration » dans laquelle les nucléotides deviennent réactifs à une sonde chimique de manière corrélée. L'analyse d'association statistique est utilisée pour détecter et quantifier les forces de ces interdépendances. (B) Les molécules d'ARN peuvent adopter plusieurs conformations en solution. L'analyse de clustering spectral, basée sur la similitude des modèles de réactivité des nucléotides, peut être utilisée pour séparer les données sur les brins d'ARN individuels en différentes conformations.


PLANIFICATION STRATÉGIQUE

Lors de l'approche de la synthèse et de la purification d'un nouvel ARN d'intérêt pour l'analyse spectroscopique RMN, plusieurs décisions importantes doivent être prises concernant la conception de la construction, le marquage, la stratégie de purification et la composition du tampon. Dans cette section, nous aborderons les différentes options stratégiques et donnerons un petit guide sur la façon de planifier votre synthèse d'ARN en fonction de vos besoins spécifiques.

Conditions de travail sans RNase

Contrairement à d'autres biomolécules, travailler avec l'ARN pose ses propres défis lorsqu'il s'agit de manipuler des échantillons. Pour se protéger contre les virus à ARN, les humains ont développé une multitude de RNases, des enzymes dégradant l'ARN qui sont exprimées sur la peau et les cheveux. Par conséquent, des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter une contamination par la RNase qui entraînerait par la suite des dommages ou une dégradation de l'échantillon d'ARN produit en laboratoire. Ces mesures s'appliquent au comportement personnel du laboratoire ainsi qu'aux produits chimiques, aux solutions et au matériel de laboratoire utilisés lors de la manipulation de l'ARN.

Surtout, portez des gants en tout temps pour éviter méticuleusement d'amener votre peau en contact direct ou indirect avec un échantillon d'ARN. Utilisez autant que possible des consommables et des produits chimiques certifiés sans RNase par le fabricant. Si aucune option sans RNase n'est disponible dans le commerce, quelques autres mesures de protection peuvent être prises pour éviter la contamination par la RNase. Pour les liquides, on peut filtrer les solutions avant utilisation avec un seuil de 1 à 2 kDa ou ajouter un inhibiteur de ribonucléase (par exemple, RNasin ® de Promega) directement au mélange réactionnel. Les instruments ou le matériel de laboratoire peuvent être traités avec une solution de dicarbonate de diéthyle (DEPC), et la verrerie résistante à la chaleur peut également être chauffée à 200 °C pendant 2 heures.

Conception de construction

Étant donné que la transcription in vitro utilise principalement l'ARN polymérase T7 (T7 RNAP) pour la synthèse d'ARN, il faut considérer deux aspects cruciaux pour la conception de la construction. Premièrement, avec la séquence de promoteur T7 principalement utilisée (classe III), la polymérase nécessite au moins deux résidus guanosine comme nucléotides d'initiation afin de transcrire avec une efficacité appropriée et les rendements sont considérablement réduits en présence d'autres nucléotides de départ.

Comme illustré sur la figure 1, on peut soit utiliser un plasmide d'ADN linéarisé (Support Protocol 1) ou un produit de réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Support Protocol 2) comme matrice d'ADN pour la transcription in vitro.

Si la cassette de transcription d'ARN est codée par un plasmide, elle doit inclure un site de restriction approprié à l'extrémité 3' pour produire des transcrits de ruissellement lorsque le plasmide linéarisé est transcrit. Étant donné que la préparation de plasmides d'ADN nécessite le clonage, l'amplification dans des cellules bactériennes, la purification des plasmides et la linéarisation, cela prend beaucoup de temps, tandis que la PCR est l'option considérablement plus rapide. Néanmoins, nous constatons parfois une efficacité de transcription plus élevée lors de l'utilisation d'ADN plasmidique sur des matrices amplifiées par PCR, ce qui pourrait être attribué à la capacité des polymérases à lier l'ADN en amont du promoteur T7, puis à glisser le long du brin jusqu'à ce qu'il atteigne la séquence du promoteur. Dans le cas d'un produit PCR, ce balayage séquentiel de l'ARNP T7 n'est pas possible, de sorte que seules des rencontres plus directes avec le promoteur T7 conduisent à la transcription.

Marquage isotopique

La stratégie de marquage d'un ARN dépend fortement de l'objectif de l'étude. Pour l'évaluation initiale des structures secondaires via un motif de protons imino ou une affectation basée sur NOESY de petits ARN, un échantillon à haute concentration non marqué (>250 µM) est souvent déjà suffisant. De plus, l'utilisation de rNTP marqués par des isotopes disponibles dans le commerce pour la production d'ARN à l'échelle RMN peut être assez coûteuse et ne doit donc être envisagée que lorsque des protocoles de transcription et de purification sont établis, et les questions scientifiques ne peuvent pas être résolues avec des expériences ¹H.

Avec l'augmentation de la taille de l'ARN, même les affectations basées sur les protons deviennent plus difficiles en raison du chevauchement spectral. Ici, des expériences de RMN hétéronucléaires plus sophistiquées peuvent fournir des informations supplémentaires sur l'identité des nucléotides. Le marquage 15 N des résidus de guanine et d'uracile, par exemple, fera progresser l'attribution des résonances spécifiques à la base grâce à l'utilisation d'expériences HSQC 15 N, tandis que les nucléotides marqués 13 C peuvent aider à résoudre les résonances des protons aromatiques et sucrés via des expériences HSQC 13 C. Surtout avec des ARN de longueur croissante, il est conseillé de marquer sélectivement seulement un ou deux types de nucléotides à la fois pour réduire considérablement le chevauchement des signaux. Dans le cas d'analyses structurales plus poussées, un marquage complet au 13 C et au 15 N, parfois associé à une deutération, est indispensable.

De plus, si votre projet nécessite une stratégie de marquage isotopique sélective plutôt qu'uniforme, nous vous recommandons d'utiliser l'approche de synthèse chimio-enzymatique décrite dans le protocole de base 2. Cette méthode permet non seulement l'incorporation d'un seul nucléotide marqué dans un autre non marqué. L'ARN, mais donne également lieu à des constructions d'ARN qui combinent des segments marqués différemment en un seul brin.

Purification d'ARN

Pour la purification de l'ARN afin de générer des échantillons RMN de concentration et de pureté suffisantes, trois voies principales sont disponibles.

Le protocole de base 1 décrit une approche chromatographique largement utilisée, où la chromatographie en phase liquide à échange rapide d'anions (FPLC) et la RP-HPLC « paire d'ions » sont utilisées pour éliminer successivement l'ARNP T7, la matrice d'ADN, les rNTP résiduels et les sous-produits d'ARN, y compris les ribozymes du ARN d'intérêt. Après les étapes chromatographiques, l'ARN est lyophilisé et dessalé avant d'être précipité par LiClO4/acétone. Enfin, l'ARN est replié en une conformation idéalement homogène et transféré dans un tampon RMN approprié. Notez que les conditions de repliement peuvent varier avec l'ARN d'intérêt et doivent donc être déterminées individuellement. Cette stratégie de purification est applicable aux ARN dans une large gamme de tailles et de structures.

S'il n'est pas possible de séparer complètement les ribozymes de votre ARN d'intérêt via RP-HPLC ou si un instrument HPLC n'est pas disponible, nous vous recommandons de passer à une approche d'électrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide, comme indiqué dans le protocole alternatif 1. Ici, les ARN sont séparés dans une électrophorèse sur gel dénaturant à grande échelle et l'ARN d'intérêt est ensuite extrait de la matrice de gel.

La voie de purification la plus rapide est décrite dans le protocole alternatif 2, où seuls les composants de faible poids moléculaire, tels que le Mg(OAc)₂ et les rNTP résiduels, sont retirés du mélange réactionnel et le tampon est échangé par des cycles de lavage répétés à l'aide de concentrateurs centrifuges (Helmling et al., 2015). Dans ce protocole, la conformation adoptée par l'ARN lors de la transcription est largement maintenue, car aucune étape de purification dénaturante n'est effectuée. Néanmoins, cette méthode ne doit être utilisée que lorsque la transcription produit un seul produit d'ARN, car les sous-produits d'ARN tels que les ribozymes ne sont pas séparés de l'ARN d'intérêt. Dans ce cas, l'homogénéité de l'extrémité 3' de l'ARN est obtenue grâce à l'utilisation d'amorces modifiées en 2'-méthoxy pendant la PCR. Un produit de PCR portant la modification 2'-méthoxy à l'extrémité 3' a montré qu'il augmentait significativement l'homogénéité du produit pour la transcription par ruissellement (Helmling et al., 2015). Nous recommandons d'utiliser cette stratégie de purification pour l'analyse de la structure de l'ARN à haut débit plutôt que les expériences de titrage, car la présence d'ARN T7 restant pourrait interférer avec la liaison du ligand.

Composition du tampon RMN

Les échantillons d'ARN RMN sont généralement préparés dans un tampon contenant le moins de protons possible (pour éviter d'utiliser des agents tampons deutérés) et présentant un pH légèrement acide (pour garantir la stabilité à long terme de l'échantillon et réduire l'échange de solvants des protons labiles). Typiquement, nous utilisons la composition de tampon suivante comme point de départ : 50 mM KCl, 25 mM K2HPO4/KH2Bon de commande4, et 5% (v/v) D2O à pH 6,2. Selon la nature de vos expériences et de l'ARN étudié, des cations bivalents tels que Mg²⁺ peuvent être ajoutés pour stabiliser la structure de l'ARN. En tant que substance de référence pour les spectres ¹H, nous recommandons le triméthylsilylpropanesulfonate de sodium (DSS), car son déplacement chimique du proton ne dépend ni de la température ni du pH. D'autres ajustements de la composition du sel et du tampon ou du pH peuvent être nécessaires pour des études individuelles, en particulier si l'ARN est étudié en tant que partie d'un complexe protéique d'ARN.

1 : PRÉPARATION D'ÉCHANTILLONS D'ARN MARQUÉS PAR ISOTOPE AVEC TRANSCRIPTION IN VITRO PAR RNAP T7, CHROMATOGRAPHIE DEAE ET PURIFICATION RP-HPLC

L'analyse des ARN par spectroscopie RMN nécessite la préparation d'un échantillon avec une quantité suffisante d'ARN pur. En règle générale, des échantillons entre 50 et 500 µM dans un volume de tampon de 300 µl sont utilisés, mais des concentrations d'échantillons plus élevées peuvent être avantageuses à condition que des conditions de repliement correctes puissent être établies. Dans ce qui suit, nous décrivons un protocole standard pour la préparation d'ARN marqué aux isotopes pour les applications RMN à l'aide de l'ARN T7. Cette polymérase peut être achetée ou préparée en interne les instructions respectives pour la préparation sont décrites dans le protocole de support 3. Dans une première étape, la matrice d'ADN à partir de laquelle l'ARN sera transcrit est amplifiée. Pour l'amplification, deux méthodes sont disponibles. Le premier nécessite un ADN plasmidique, qui est amplifié dans les cellules, linéarisé et ensuite purifié (Support Protocol 1). Une deuxième approche utilise une matrice d'ADN produite par synthèse en phase solide en combinaison avec une PCR utilisant l'ADN polymérase Phusion ® High-Fidelity (Support Protocol 2). Après amplification de l'ADN, des transcriptions de test sont utilisées pour optimiser les conditions de réaction afin d'obtenir le rendement le plus élevé de l'ARN cible. Dans ces conditions, la réaction de transcription préparative peut être effectuée et purifiée via le diéthylaminoéthanol (DEAE) et la chromatographie RP-HPLC. Des procédures alternatives pour la purification sont présentées dans les protocoles alternatifs 1 et

Matériaux

  • Eau bidistillée (ddH2O)
  • Modèle d'ADN (voir Protocoles de support 1 et 2)
  • T7 ARN polymérase (T7 RNAP voir Support Protocol 3)
  • Pyrophosphatase inorganique de levure (YIPP voir Support Protocol 4)
  • Tampon tris/glutamate 500 mM, pH 8,1 (acide glutamique Merck, n° cat. G1149)
  • Spermidine (Merck, n° cat. 85558)
  • Acétate de magnésium (Mg(OAc)2 Carl Roth, chat. non. 0275.1)
  • rNTP marqués par des isotopes (Silantes/Eurisotop)
  • TNT (Carl Roth, réf. 6908.4)
  • Diméthylsulfoxyde (DMSO Carl Roth, n° cat. A994.2)
  • Tampon de chargement d'ARN dénaturant (voir recette)
  • Solution gel PAGE dénaturante (voir recette)
  • Dénaturer le tampon de fonctionnement PAGE (1× TBE voir recette)
  • Diéthylaminoéthyl-Sépharose (DEAE-Sepharose ® GE Healthcare, n° cat. 17-0709-01)
  • Acétate de sodium 3 M (NaOAc), pH 5,5 (Carl Roth, n° cat. 6773.2)
  • 0,1 % (v/v) de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC Carl Roth, n° cat. K028.2)
  • Éthanol absolu (Merck, n° cat. 32205-2.5L-M)
  • Tampon HPLC A (50 mM de phosphate de potassium, pH 5,9, 2 mM d'hydrogénosulfate de tétrabutylammonium)
  • Tampon HPLC B (tampon HPLC A plus 60 % d'acétonitrile acétonitrile, Thermo Fisher Scientific, référence A-0627/17)
  • 2% (w/v) de perchlorate de lithium (LiClO4)/acétone (LiClO4, Acros Organics, cat. non. 194711000)
  • 40% (v/v) de glycérol (tampon de charge d'ARN natif Carl Roth, n° cat. 3783.1)
  • Solution de gel PAGE natif (voir recette)
  • Tampon de fonctionnement natif PAGE (1× TA voir recette)
  • Tampon RMN (voir recette)
  • Chlorure de magnésium (MgCl2 Carl Roth, chat. non. HN03.2)
  • Oxyde de deutérium (D2Deutéro, chat. non. 00507)
  • 3-(Triméthylsilyl)propane-1-sulfonate, sel de sodium (DSS)
  • Incubateur
  • Incubateur à secousses
  • Chambre de coulée PAGE et plaques de verre (Biometra multigel de la société Analytik Jena)
  • Bloc thermique
  • Colonne en verre pour DEAE-Sepharose ® (par exemple, Econo)
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Congélateur (−20°C/−80°C)
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Lyophilisateur/concentrateur sous vide centrifuge (Alpha 2-4, Christ sous vide concentrateur plus, Eppendorf)
  • Mixeur
  • Appareil HPLC (Elite LaChrom VWR-Hitachi)
  • Colonne HPLC (par exemple, PerfectSil™ RP18, taille des pores : 300 Å, taille des particules : 5 µm, 10 × 250 mm)
  • Plaque de chromatographie sur couche mince (CCM) (ALUGRAM ® Xtra SIL G/UV Macherey-Nagel)
  • Lampe ultraviolette (UV), 245 nm (Hanau Fluotest Heraeus)
  • Concentrateur centrifuge (par exemple, Vivaspin™, Sartorius™)
  • Tube RMN (Deutero, Shigemi)

1. Travaillez sans RNase. Travail sur glace.

2. Préparer la matrice d'ADN pour la transcription in vitro via l'amplification plasmidique (voir Support Protocol 1) ou PCR (voir Support Protocol 2).

3. Préparez T7 RNAP conformément au protocole de support 3.

4. Préparez le YIPP conformément au protocole d'assistance 4.

5. Préparez toutes les solutions mères pour les réactions de transcription, y compris toutes les réactions d'optimisation (voir les étapes 7 à 12).

Les concentrations suivantes pour les solutions mères peuvent être utiles : 500 mM de tampon tris/glutamate, 200 mM de spermidine, 300 mM de Mg(OAc)2, jusqu'à 100 mM de mélange rNTP et 1 M de DTT.

Transcription in vitro

6. Vérifier toutes les transcriptions de test avec une PAGE dénaturante analytique (denat. PAGE).

La composition exacte d'un denat. La solution PAGE doit être ajustée pour chaque échantillon. Il faut tenir compte de la longueur de l'ARN cible et de ses ribozymes (le cas échéant) et de l'efficacité de séparation requise. Pour les ARN inférieurs à 20 nt, 20 % de denat. PAGE peut être utilisé. Pour des ARN allant jusqu'à 50 nt, un denat de 15 %. PAGE peut être utilisé. Pour les ARN de plus de 50 nt, 8 à 10 % de denat. PAGE peut être utilisé. Pour plus d'instructions, voir l'article Current Protocols : Andrus & Kuimelis, 2000 .

7. Optimiser la réaction de transcription (voir étape 13) sur une échelle de test et commencer par l'optimisation de la concentration de rNTP par rapport au Mg(OAc)2 concentration (Fig. 2).

Pour les tests-transcriptions, un volume de 50 µl est suffisant. Utilisez des rNTP non étiquetés pour l'optimisation. Vous pouvez optimiser la composition de rNTP en fonction du rapport de nucléotides dans la séquence d'ARN transcrite. Les concentrations peuvent se situer dans une plage de 2 à 5 mM par rNTP et de 5 à 60 mM de Mg(OAc)2. Mg final (OAc)2 la concentration dépend en outre du type de matrice d'ADN (produit PCR ou plasmide).Si l'ARN contient un ribozyme, vous devrez choisir un Mg(OAc) plus élevé2 concentration pour aider le clivage. Le but de cette optimisation est un produit propre et un rendement maximum d'ARN cible avec une quantité raisonnable de sous-produit, qui peut être éliminé par la suite.

8. Optimisez la quantité d'ADN via des tests de transcription.

Utiliser 4%-10% (v/v) de produit PCR. Il peut être utilisé directement après la PCR sans aucune étape de purification si le produit est homogène ou si des sous-produits potentiels ne sont pas transcrits. Lorsque vous utilisez de l'ADN plasmidique, optimisez 25-200 ng/µl.

9. Effectuez des tests de transcription avec jusqu'à 20 % (v/v) de DMSO.

Le DMSO peut augmenter l'homogénéité de l'ARN cible mais doit être testé à l'avance. Nous observons un effet positif principalement pour les transcriptions avec des matrices d'ADN PCR.

10. Optimiser le temps d'incubation à 37°C via un test-transcription.

Préparez une transcription de test et prélevez des échantillons pour analyse à des intervalles appropriés. Le temps d'incubation peut varier considérablement avec différentes constructions d'ARN. Vous pouvez incuber de 4 à 24 heures.

11. Optimiser la concentration du tampon tris/glutamate, si nécessaire. Utilisez 100-200 mM de tampon tris/glutamate.

12. Effectuez un test de transcription avec les paramètres optimisés et les rNTP marqués par des isotopes.

13. Effectuer la transcription préparatoire avec les conditions optimisées dans un tube de réaction de 50 ml selon le schéma de pipetage décrit dans le tableau 1.

Si vous utilisez une matrice d'ADN PCR, un volume de transcription de 10 ml est suffisant. Si vous utilisez une matrice d'ADN plasmidique, un volume de 25 ml est généralement requis. Ajouter la matrice d'ADN au mélange dans l'ordre indiqué dans le tableau 1, car une concentration élevée de Mg 2+ peut entraîner une précipitation de l'ADN. Vous pouvez ajouter 9,6 µg/ml de YIPP après 1-2 heures d'incubation. Ajoutez les enzymes en dernier.

Réactif Quantité
ddH2O Ajoutez jusqu'à 10-25 ml
Tampon tris/glutamate (pH 8,1) 100-200 mm
spermidine 2 mm
Mg(OAc)2 5-60 mm
rNTP 2-5 mm
TNT 20 mm
ADN Comme optimisé
DMSO Jusqu'à 20%
YIPP 9,6 µg/ml
ARN polymérase T7 20 µg/ml

14. Incuber la réaction de transcription à 37°C et 120 rpm maximum tant qu'elle est optimisée.

15. Vérifiez si l'ARN cible a été transcrit avec un denat. PAGE.

Chromatographie d'échange d'anions

  1. Verser environ 10 ml de résine DEAE Sepharose dans une colonne de chromatographie vide et laisser la résine se déposer complètement. Égoutter le surnageant EtOH de la colonne DEAE et laver avec 20 ml de ddH2O.
  2. Pour l'inactivation d'éventuelles contaminations par la RNase, laver la colonne avec 50 ml de DEPC à 0,1 % (v/v) puis incuber avec 0,1 % (v/v) de DEPC pendant la nuit.

Égoutter la solution DEPC à 0,1% (v/v) et laver la colonne avec 100 ml chaud (∼60° à 90°C) ddH2O et équilibrer avec 50 ml de NaOAc 0,1 M.

Essayez d'éviter de perturber la résine de la colonne en versant soigneusement l'eau le long de la paroi interne de la colonne. Pour chaque étape de lavage, assurez-vous que la résine est complètement déposée avant de commencer l'élution.

Centrifuger la réaction de transcription (15 min, 4 000 × g, 4°C) et transférer le surnageant sur la colonne.

Assurez-vous que la résine est complètement déposée avant de commencer l'élution.

Facultatif : Laver la pastille de sel avec 5 ml H2O et centrifuger à nouveau pendant 15 min avant de regrouper les deux surnageants.

Recueillir l'écoulement en fractions de 10 ml. Charger et éluer successivement avec 50 ml de solution de NaOAc 0,6 M, 1,0 M, 2,0 M et 3,0 M.

Attendez-vous à ce que l'ARN s'élue à environ 2 M de NaOAc.

17. Utiliser la spectroscopie d'absorption UV/vis pour identifier les fractions avec une absorption élevée à 260 nm et vérifier les fractions correspondantes sur un denat analytique. PAGE pour déterminer les fractions contenant de l'ARN.

18. Diluer la concentration en sel des fractions du produit avec ddH2O à 0,3-0,6 M de NaOAc.

Une concentration inférieure en NaOAc garantit que le sel reste en solution pendant la précipitation.

19. Ajouter quatre volumes d'éthanol absolu glacé aux fractions de produit.

20. Incuber à -80°C pendant la nuit.

21. Centrifuger à 10 000 × g et 4°C pendant 30-60 min.

Déterminer la vitesse maximale tolérée par le tube échantillon.

22. Retirer le surnageant et le conserver pour une précipitation supplémentaire.

Parfois, l'ARN ne précipite pas quantitativement. Répétez les étapes 20-22 deux fois avec le surnageant pour s'assurer qu'aucun ARN ne reste dans la solution. Incuber le surnageant de la précipitation pendant 3 à 6 heures à -80°C.

23. Sécher le culot à l'air ou utiliser un concentrateur sous vide pendant 2 min et reconstituer le culot d'ARN dans ∼1 ml ddH2O. Un DO260 de ∼100 convient.

24. Purifier l'échantillon d'ARN par HPLC. Les gradients appropriés pour les différentes longueurs d'ARN que nous utilisons dans nos laboratoires sont indiqués dans les tableaux 2 et 3. Dans ce cas, une HPLC RP à paire d'ions avec la colonne PerfectSil RP18 est utilisée à 60 °C, ce qui convient pour des longueurs d'ARN allant jusqu'à 180 nt . Cette colonne est équilibrée avec du tampon HPLC A pendant 10-15 min et un débit de 5 ml/min est habituellement utilisé. Un autre appareil ou une autre colonne peut nécessiter un gradient légèrement modifié.

Si une nouvelle construction d'ARN est purifiée, une analyse doit être effectuée pour déterminer un gradient approprié. Le gradient dépend non seulement de la longueur de l'ARN mais aussi de sa structure, de sa séquence et des impuretés potentielles.

25. Retirer le tampon HPLC avec un lyophilisateur ou un concentrateur centrifuge sous vide.

26. Reconstituer le culot dans 1 ml ddH2O.

27. Ajouter cinq volumes de 2% (w/v) LiClO4/acétone et incuber 2 h à -20°C.

28. Centrifuger à 10 000 × g et 4°C pendant 30-60 min.

Vous pouvez centrifuger à une vitesse plus élevée si possible. Respectez la vitesse limite spécifiée dans le manuel de l'appareil du tube de réaction.

29. Retirer le surnageant et reconstituer le culot dans ddH2Tampon O ou RMN selon la méthode de repliement.

Si vous utilisez un concentrateur centrifuge de 20 ml, vous pouvez reconstituer dans un volume ∼ 10 ml.

Pliage et échange de tampon

Le protocole de repliement devra peut-être être adapté pour chaque construction d'ARN individuelle. Par conséquent, certaines voies de pliage courantes sont introduites ici. L'ARN peut être replié dans l'eau ou dans du tampon RMN ainsi qu'à une concentration élevée ou faible en ARN. Tenir compte du fait que des concentrations élevées de sel et d'ARN peuvent induire une dimérisation. Ne pas congeler l'échantillon après le pliage.

30. Vérifiez la présence d'un pli homogène via une PAGE native. L'échantillon chargé doit avoir une concentration d'un échantillon RMN (>100 µM). Chargez 500 nmoles d'ARN. Utilisez l'ombrage UV pour révéler les bandes.

Ne pas utiliser d'urée ou d'EDTA pour la PAGE native. De plus, gardez à l'esprit la température, car l'ARN ne doit pas être exposé à une température supérieure à 25°C. Par conséquent, la puissance ne doit pas dépasser 1 W et un système de refroidissement doit être appliqué si possible.

31. Optimisez les conditions de repliement de l'ARN cible si elles sont inconnues et vérifiez via une PAGE native.

Pour un repliement lent, dénaturez l'ARN (3-5 min, 95°C) et laissez l'échantillon sur le bloc chauffant éteint jusqu'à ce qu'il atteigne la température ambiante. Pour un pliage rapide, placez l'échantillon directement sur la glace après dénaturation. Après dénaturation, l'ARN peut être replié par dilution rapide avec du ddH glacé cinq à dix fois2O ou tampon RMN glacé. Cette optimisation peut être effectuée à ce stade dans ddH2O ou à l'étape 36 dans le tampon RMN.

32. Pliez l'échantillon d'ARN en une seule conformation. Le pliage peut avoir lieu maintenant ou à l'étape 40.

Ne pas congeler l'échantillon après le pliage.

33. Préparez un concentrateur centrifuge comme décrit dans le manuel de l'appareil.

Choisissez un seuil de poids moléculaire (MW), qui correspond à environ un tiers de la taille de l'ARN cible. De cette façon, la construction d'ARN ne passera pas à travers le filtre.

34. Transférer l'échantillon d'ARN dans le tampon RMN à l'aide du concentrateur centrifuge et centrifuger à la vitesse recommandée.

Respectez la vitesse limite spécifiée par le fabricant, sinon la membrane pourrait être endommagée. La température à l'intérieur de la centrifugeuse doit être comprise entre 4 et 25 °C, selon le type et la stabilité de l'ARN cible. Si un concentrateur centrifuge de 20 ml est utilisé, centrifuger jusqu'à ce que le volume soit réduit à 1 ml.

35. Remplir le concentrateur centrifuge avec du tampon RMN et le mélanger soigneusement avec une pipette pour ne pas endommager la membrane du concentrateur. Ensuite, centrifugez-le pour obtenir un dixième du volume.

Le mélange de l'échantillon empêche l'agrégation de l'ARN car la concentration augmente progressivement vers la membrane. De plus, cela peut conduire à des cycles de répétition plus rapides.

36. Répétez l'étape 35 trois à dix fois pour éliminer les sels restants.

Le nombre total de cycles de répétition dépend fortement de la construction d'ARN, des conditions de tampon HPLC et de la pureté de l'ARN requise pour les expériences ultérieures. Certains ARN ont tendance à s'agréger pendant l'échange de tampon. Ils doivent être récupérés après chaque cycle et doivent subir au moins six fois le cycle d'échange de tampon décrit à l'étape 35.

37. Centrifuger après la dernière itération pour réduire le volume à 200-300 µl.

38. Retirer l'ARN du concentrateur centrifuge via une pipette.

Les ARN peuvent coller à la membrane et doivent donc être éliminés vigoureusement avec une pipette. Il est recommandé que la solution d'ARN soit pipetée le long de l'intérieur de la membrane et que la membrane soit lavée de la même manière avec une petite quantité supplémentaire de tampon RMN (∼50 µl) après le retrait.

39. Déterminer la concentration d'ARN par spectroscopie d'absorption UV/vis.

Tenir compte du MgCl2, RÉ2O, et DSS qui peuvent être ajoutés par la suite et dilueront l'échantillon. Nous recommandons une concentration d'ARN d'au moins 300 µM.

40. Pliez l'ARN à moins qu'il n'ait été plié auparavant et vérifiez le pli final via une PAGE native (voir étape 30 et Fig. 3).

Si l'ARN a tendance à s'agréger pendant l'échange de tampon, il doit être replié par la suite.

41. Ajouter du MgCl2 si nécessaire, à moins qu'il n'ait été ajouté auparavant.

Les ions Mg 2+ peuvent stabiliser la structure de l'ARN. Chaque nouvelle construction d'ARN doit être titrée avec du MgCl2. Par conséquent, ajoutez MgCl2 étape par étape jusqu'à l'ARN (1 mM) et mesurer un spectre RMN 1 H-1D après chaque étape, pour détecter les différences dans la structure et la stabilité de l'ARN. Vous pouvez ajouter du MgCl2 à l'échantillon d'ARN après repliement car l'étape de dénaturation doit être effectuée en l'absence d'ions Mg 2+. MgCl2 peut également être ajouté au tampon RMN qui est utilisé pour l'échange de tampon (voir étapes 35 et 36).

42. Ajouter 5% D2O et 100 µM DSS à l'échantillon d'ARN.

Si la solution mère DSS est préparée en D2O, vérifier si supplémentaire D2O doit être ajouté. Sinon, préparez une solution mère DSS hautement concentrée dans un tampon RMN.

43. Laver le tube de Shigemi avec ddH2O et incuber avec une solution de DEPC à 0,1% (v/v) pendant la nuit. Laver à plusieurs reprises le tube avec ddH2O (au moins cinq fois ou plus) et séchez-le via un lyophilisateur ou une étuve.

44. Remplir le tube de Shigemi avec l'échantillon RMN (hauteur de remplissage optimale : 300 µl) et placer l'insert au-dessus de l'échantillon afin qu'aucune bulle d'air ne soit piégée entre l'insert et l'échantillon.

Il peut être utile de pousser l'insert avec une vitesse et une pression élevées dans le tube. La partie inférieure de l'insert doit être entourée de solution d'échantillon.

45. Sceller le tube Shigemi avec un film d'étanchéité (par exemple, Parafilm) et étiqueter le tube. Conserver l'échantillon à 4°C.

L'étanchéité stabilise l'insert.

46. ​​Effectuer des expériences de RMN essentielles (par exemple, 1 H 1D, 1 H 2D NOESY, 1 H, 15 N-HSQC) pour l'attribution de l'ARN. Pour les expériences de RMN de base pour l'ARN, nous nous référons à l'article de synthèse : RMN spectroscopy of RNA (Fürtig, Richter, Wöhnert, & Schwalbe, 2003). Pour des expériences hétéronucléaires plus sophistiquées, voir Protocoles de base 3-7.

1 : PURIFICATION DE L'ARN MARQUÉ PAR ISOTOPE À PARTIR DE LA TRANSCRIPTION IN VITRO AVEC PAGE PRÉPARATIVE

Le protocole alternatif 1 décrit une deuxième approche pour la purification d'ARN marqués par des isotopes à partir de la transcription in vitro. Cette méthode utilise la PAGE préparative au lieu de la RP-HPLC et constitue donc une alternative si aucun appareil HPLC n'est disponible ou si l'appareil ne sépare pas suffisamment le produit d'ARN cible des sous-produits (article sur les protocoles actuels : Hengesbach et al., 2008 Petrov, Wu, Puglisi, & Puglisi, 2013). Ce protocole commence après la transcription réussie in vitro de l'ARN cible et donne un échantillon RMN pur. Cette méthode ne convient pas si l'échantillon RMN doit être exempt d'impuretés d'acrylamide, qui pourraient être éluées avec l'ARN de la PAGE préparative. Si l'acrylamide affecte les résultats, une analyse HPLC pour le séparer de l'ARN est inévitable.

Matériaux supplémentaires (voir aussi Protocole de base 1 )

  • Eau bidistillée (ddH2O)
  • Diéthylaminoéthyl-Sépharose (DEAE-Sepharose ® GE Healthcare, n° cat. 17-0709-01)
  • Acétate de sodium 3 M (NaOAc), pH 5,5 (Carl Roth, n° cat. 6773.2)
  • 0,1 % (v/v) de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC Carl Roth, n° cat. K028.2)
  • Solution de gel PAGE dénaturant, 8%-15% (voir recette)
  • Formamide (tampon de charge d'ARN dénaturant pour PAGE Merck préparative, n° cat. 47671)
  • Dénaturer le tampon de fonctionnement PAGE (1× TBE voir recette)
  • Tampon de chargement contenant du colorant (voir recette)
  • Tampon d'élution : acétate de sodium 0,3 M (NaOAc), pH 5,5
  • Éthanol absolu (Merck, n° cat. 32205-2.5L-M)
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Colonne NAP™ (GE Healthcare)
  • Colonne en verre pour DEAE-Sepharose ® (par exemple, Econo)
  • Concentrateur centrifuge (par exemple, Vivaspin™, Sartorius™)
  • Filtres stériles, 0,2 µm (Carl Roth)
  • Chambre de coulée PAGE et plaques de verre (Société Biometra multigel Analytik Jena)
  • Bloc thermique
  • Surface stérile
  • Plaque de chromatographie sur couche mince (CCM) (ALUGRAM ® Xtra SIL G/UV Macherey-Nagel)
  • Lampe UV, 245 nm (Hanau Fluotest Heraeus)
  • scalpel stérile
  • Seringue
  • Mixeur
  • Congélateur (−20°C/−80°C)
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Concentrateur sous vide centrifuge (concentrateur sous vide plus Eppendorf)

REMARQUE: Ce protocole débute par la purification d'un ARN préalablement transcrit. Pour la transcription in vitro, reportez-vous au protocole de base 1, étapes 1-15.

2. Transcrivez l'ARN comme décrit dans le protocole de base 1, étapes 1 à 15.

3. Déterminez la quantité d'ARN et le volume d'échantillon à purifier et vérifiez quelle taille de PAGE correspond à l'échantillon d'ARN. Tenez compte du formamide supplémentaire (voir l'étape 9 ci-dessous) et de l'efficacité de séparation requise, par exemple, la différence de taille entre les bandes de produit.

Une midi PAGE (distance de migration ∼20 cm) est généralement suffisante pour la quantité d'ARN obtenue à partir d'une transcription de 15 ml si aucun sous-produit n'apparaît, alors qu'une maxi PAGE (distance de migration ∼50 cm) convient si la transcription a été réalisée dans une échelle de 25 ml ou si une plus grande efficacité de séparation est requise. Ce cas se produit si davantage de sous-produits sont produits ou si les ribozymes ont une longueur similaire à celle du produit d'ARN cible.

4. Retirer les rNTP libres et l'excès de sel de la réaction de transcription soit par chromatographie DEAE selon le protocole de base 1, une colonne NAP, soit via un concentrateur centrifuge.

Vous pouvez précipiter l'ARN pour éliminer le DMSO et réduire le volume si vous utilisez une colonne NAP.

5. Préparez le tampon TBE selon les besoins pour votre appareil de diffusion PAGE.

Assurez-vous qu'il y a suffisamment de tampon pour remplir le dispositif de coulée PAGE en cas de fuite.

6. Préparer une solution de gel PAGE à 8 % à 15 % et filtrer avec des filtres stériles (0,2 µm).

Déterminer un pourcentage d'acrylamide approprié. Des concentrations plus élevées peuvent être plus appropriées pour des constructions plus petites. Des concentrations plus faibles augmentent généralement le rendement d'élution. Utilisez des béchers appropriés. Environ deux fois le volume de solution de gel PAGE devrait être suffisant. Le volume final de la solution de gel dépend de votre appareil PAGE. Dans le cas d'un gel midi avec une distance de migration 20 cm, 70 ml de solution de gel PAGE pourraient suffire. Pour un maxi gel avec une distance de migration ∼ 50 cm, 250 ml de solution de gel PAGE peuvent être préparés. Assurez-vous qu'il y a un excès de solution de gel en cas de fuite dans certains cas, une recharge rapide ou une injection sélective de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) peut aider.

7. Placez les plaques de verre PAGE et vérifiez s'il y a des fuites.

Vérifiez l'épaisseur égale des entretoises et des peignes. Le dispositif PAGE et les plaques de verre doivent être sans RNase.

8. Ajouter du persulfate d'ammonium (APS) et du TEMED à la solution de gel PAGE pour démarrer la polymérisation immédiatement avant de verser.

Ajustez APS et TEMED au volume souhaité et tenez compte du temps nécessaire pour couler le gel. 0,1% (w/v) APS et 0,1% (v/v) TEMED doivent être utilisés pour les gels midi PAGE. Pour les gels maxi PAGE, utilisez environ 0,06 % (p/v) d'APS et 0,06 % (v/v) de TEMED. Le temps de polymérisation est de 10-20 min.

9. Ajoutez au moins 0,5 volume de formamide à votre échantillon et dénaturez l'ARN 3-5 min à 95°C.

Vérifiez si le volume final de l'échantillon s'insère dans les poches de gel (voir étape 3). Ne pas utiliser de colorants.

10. Placez le gel dans l'appareil PAGE. Si vous utilisez un maxi gel, pré-exécutez le gel pendant 30 min.

Rincer soigneusement les puits avec un tampon de coulée directement après la prise du gel et avant de charger le gel pour éviter la sédimentation de l'urée.

11. Ajouter 20 µl de tampon de chargement contenant un colorant dans une poche de gel de rechange pour déterminer la progression du gel.

12. Chargez l'échantillon d'ARN dénaturé dans des poches de gel libres.

Si vous n'avez qu'un seul type de peigne à portée de main (avec plusieurs poches), vous pouvez détruire les poches en douceur, pour augmenter le volume de chargement de l'échantillon. Utilisez une aiguille ou une spatule stérile.

Les paramètres d'exécution dépendent du type de PAGE et de la taille de l'ARN cible. Pour les PAGE midi, réglez ∼30 W et pour les PAGE maxi, 50 W suffisent. Vérifiez la fuite de tampon en cours d'exécution PAGE après 15-30 min. Si nécessaire et disponible, démarrez le ventilateur après 30 min pour empêcher l'échantillon de tourbillonner. D'autres types de refroidissement peuvent être démarrés depuis le début. Le temps d'exécution dépend fortement de la longueur de votre ARN cible. Par conséquent, suivez la progression de la teinture.

14. Retirer le gel des plaques de verre et le placer sur une surface stérile.

Assurez-vous que le rayonnement UV traverse la surface stérile. Des sacs en plastique stériles peuvent être utilisés. Coupez le sac avec un scalpel stérile et placez le gel à l'intérieur.

15. Placer une plaque TLC fluorescente sous le gel.

La plaque doit être enveloppée d'un film plastique transparent et propre au cas où vous couperiez la surface stérile.

16. Recherchez une ombre UV causée par l'ARN à l'aide d'une lampe UV (245 nm). Identifiez la bande d'ARN souhaitée et marquez la bande avec un scalpel stérile.

Soyez prudent et n'éclairez le gel que brièvement avec la lampe UV pour éviter les dommages UV de l'ARN. Une image de la mini PAGE de l'échantillon peut aider à trouver la bande d'ARN cible plus rapidement.

17. Découpez la bande désirée dans le gel, puis coupez-la en petits morceaux.

18. Mélanger les morceaux de gel avec 10-20 ml de tampon d'élution et presser le mélange à travers une seringue.

Ce processus augmente la surface du gel pour une meilleure élution.

19. Agiter les morceaux de gel à 4°-25°C pendant une nuit pour éluer l'ARN dans le tampon d'élution.

Congeler et décongeler éventuellement des tranches de gel pour rompre la matrice de gel et augmenter l'efficacité d'élution de l'ARN. Après l'élution pendant la nuit, une incubation à 65°C pendant 15 min et une agitation supplémentaire pendant 30 min à 1 300 tr/min peuvent aider à augmenter la quantité d'ARN élué.

20.Filtrez le tampon d'élution avec un filtre stérile (0,2 µm) et conservez les morceaux de gel pour une élution ultérieure.

Dans certains cas, l'élution de l'ARN est difficile et peut ne pas être achevée du jour au lendemain. Par conséquent, ajoutez du NaOAc 0,3 M frais aux morceaux de gel séparés et répétez les étapes 19 et 20.

21. Ajouter deux et demi à quatre volumes d'éthanol absolu glacé pour précipiter l'ARN et placer le mélange à -20°C pendant la nuit.

Une incubation à -80°C pendant 2 heures peut également être suffisante.

22. Centrifuger à 10 000 × g et 4°C pendant 30-60 min.

Vous pouvez centrifuger à une vitesse plus élevée si possible. Respectez la vitesse limite spécifiée dans le manuel de l'appareil du tube de réaction.

23. Retirer le surnageant et le conserver pour une précipitation supplémentaire.

Dans certains cas, l'ARN ne précipite pas entièrement. Dans ce cas, l'incubation et la centrifugation peuvent être répétées.

24. Faire sécher le granulé à l'air ou au concentrateur sous vide pendant 2 min et le reconstituer en ddH2O.

Exécutez un denat analytique. PAGE pour vérifier la pureté de l'ARN cible.

25. Procédez au pliage, à l'échange de tampon et à la préparation d'échantillons RMN comme décrit dans le protocole de base 1, étapes 30-46.

2 : PURIFICATION D'ÉCHANTILLONS D'ARN MARQUÉS PAR ISOTOPE À PARTIR DE LA TRANSCRIPTION IN VITRO PAR CONCENTRATION CENTRIFUGE

Ce protocole alternatif 2 décrit une méthode de purification rapide pour les ARN marqués aux isotopes à partir de la transcription in vitro à l'aide d'un concentrateur centrifuge (voir Fig. 4). C'est la méthode de purification la plus rapide parmi les stratégies de purification décrites dans ce protocole. Cependant, cette méthode ne doit être appliquée que lorsque la transcription produit un seul produit d'ARN, car les sous-produits d'ARN ou d'autres ARN transcrits tels que les ribozymes ne sont pas séparés. Par conséquent, il est important de générer une homogénéité 3'-end de l'ARN transcrit en utilisant des matrices d'ADN PCR avec 2'-O-méthyl-modifications au niveau des deux derniers nucléotides de l'extrémité 5' (Helmling et al., 2015 Kao, Zheng, & Rüdisser, 1999 Support Protocol 2). Nous vous conseillons également de ne pas utiliser cette procédure de purification pour les expériences de titrage RMN, car les enzymes restantes en solution pourraient interférer avec la liaison du ligand.

Matériaux

  • ARN transcrit (voir Protocole de base 1, étapes 1-15)
  • Eau bidistillée (ddH2O)
  • Tampon tris/glutamate 500 mM, pH 8,1 (acide glutamique Merck, n° cat. G1149)
  • Tampon RMN (voir recette)
  • Tampon de chargement d'ARN dénaturant (voir recette)
  • Solution gel PAGE dénaturante (voir recette)
  • Dénaturer le tampon de fonctionnement PAGE (1× TBE voir recette)
  • Concentrateur centrifuge (par exemple, Vivaspin™, Sartorius™)
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Chambre de coulée PAGE et plaques de verre (Société Biometra multigel Analytik Jena)
  • Bloc thermique

1. Préparez le concentrateur centrifuge comme décrit dans le manuel de l'appareil.

Choisissez un seuil MW, qui sera d'environ un tiers de la taille de votre ARN cible. De cette façon, l'ARN ne passera pas à travers le filtre.

2. Retirez le pyrophosphate de magnésium précipité en centrifugant le mélange de transcription à 3 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, transférez le surnageant dans le concentrateur centrifuge.

3. Laver le mélange de transcription avec 5 ml de tampon tris/glutamate (pH 8,1) pour éliminer le pyrophosphate restant.

4. Concentrer la solution à 1,0-0,3 ml et laver avec 60-160 ml de tampon RMN en fonction de l'échelle de transcription.

Mélanger soigneusement l'échantillon entre les étapes avec une pipette, sans toucher la membrane. Respectez la vitesse limite spécifiée par le fabricant, sinon la membrane pourrait être endommagée. La température à l'intérieur de la centrifugeuse doit être comprise entre 4 et 25 °C, selon le type et la stabilité de l'ARN cible. Une température plus élevée augmentera le débit.

5. Analyser l'écoulement et la solution au-dessus de la membrane (ARN cible) par spectroscopie d'absorption UV/vis et PAGE dénaturante analytique pour s'assurer qu'aucun ARN n'a traversé la membrane du concentrateur centrifuge.

6. Lors de la dernière étape de lavage, concentrer la solution à 200-300 µl et retirer l'ARN du concentrateur centrifuge avec une pipette.

L'ARN peut coller à la membrane et doit donc être éliminé vigoureusement avec une pipette. Il est recommandé que la solution d'ARN soit pipetée le long de l'intérieur de la membrane et que la membrane soit lavée avec une petite quantité supplémentaire de tampon RMN (∼50 µl) après le retrait.

7. Déterminer la concentration d'ARN par spectroscopie d'absorption UV/vis.

Tenir compte du MgCl2, RÉ2O, et DSS qui seront ajoutés par la suite et dilueront l'échantillon.

8. Procédez au pliage et à la préparation de l'échantillon RMN comme décrit dans le protocole de base 1, étapes 30-46.

1 : PRÉPARATION DU MODÈLE D'ADN À PARTIR DE PLASMIDE

Chaque ARN polymérase dépendante de l'ADN utilisée dans une transcription in vitro nécessite une matrice d'ADN à partir de laquelle la séquence peut être lue et un brin d'ARN peut être synthétisé. Une matrice couramment utilisée est un plasmide d'ADN linéarisé codant pour la cassette de transcription d'ARN. Avec la linéarisation directement en aval de la cassette de transcription, aucun terminateur de transcription n'est requis, mais à la place, la polymérase créera des transcrits de ruissellement (Diaz, Rong, McAllister et Durbin, 1996). Dans ce protocole de support 1, nous fournissons des instructions étape par étape sur la façon de préparer une matrice d'ADN plasmidique.

Matériaux

  • Eau bidistillée (ddH2O)
  • DH5 compétent Escherichia coli cellules (par exemple, New England Biolabs)
  • Milieu SOC (fourni avec des cellules compétentes pour la transformation plasmidique)
  • Plaques de gélose LB avec 100 µg/ml d'ampicilline
  • LB moyen (voir recette)
  • 100 mg/ml d'ampicilline
  • 50% de glycérol (pour le bouillon de glycérol voir étape 6)
  • Kit de purification d'ADN plasmidique (par exemple, Macherey Nagel)
  • Enzyme de restriction (par exemple, New England BioLabs)
  • Tampon de réaction 10× CutSmart ® (New England Biolabs, n° cat. B7204S fourni avec l'enzyme)
  • Solution de gel d'agarose (voir recette)
  • Tampon de chargement d'ADN (par exemple, Gel Loading Dye : Purple, New England Biolabs ou voir la recette)
  • Tampon de fonctionnement ADN (1× TAE voir recette)
  • Solution d'alcool phénol-chloroforme-isoamylique (PCI) (p. ex. ROTI ® , n° cat. A156.1)
  • Chloroforme (Thermo Fisher Scientific, n° de cat. 10293850)
  • Acétate de sodium 3 M (NaOAc), pH 5,5
  • Éthanol absolu (Merck, n° cat. 32205-2.5L-M)
  • 2-Propanol (VWR Chemicals, n° de cat. 20842.330)
  • Incubateur à secousses
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Agarose chambre de coulée du gel et des plaques de verre
  • Congélateur (−20°C/−80°C)

Transformation et amplification

Ce protocole suppose l'insertion réussie précédente de la cassette de transcription d'ARN dans un plasmide bactérien approprié. Tout plasmide avec une séquence de promoteur T7 (classe III) et une résistance à l'ampicilline devrait convenir.

1. Effectuer la transformation du plasmide en DH5α compétent E. coli cellules selon les instructions du fabricant.

2. Préparer 5 ml, 50 ml et 1 L de milieu LB avec 100 µg/ml d'ampicilline dans des flacons appropriés.

Ajouter de l'ampicilline directement avant utilisation.

3. Choisissez un clone isolé de la plaque de gélose LB (par exemple, avec un embout de pipette stérile) et transférez-le dans le flacon de culture de 5 ml.

Vous pouvez également ensemencer avec un bouillon de glycérol préalablement préparé. Pour cela, décongelez brièvement le stock de glycérol et ajoutez 20 à 50 µl à votre culture de 5 ml ou transférez une partie du stock de glycérol congelé directement à l'aide, par exemple, d'un embout de pipette stérile.

4. Cultiver les cellules ∼4-6 heures à 37°C et 120 tr/min avant de transférer la culture starter de 5 ml dans 50 ml de culture starter. Incuber la culture de 50 ml à 37°C et 120 rpm pendant la nuit.

5. Mesurer la DO600 de la culture starter et transférer le volume approprié dans la culture principale pour ajuster la DO initiale600 à ∼0.1.

6. Incuber la culture principale encore 6 à 10 heures à 37 °C et 120 tr/min.

Pour une conservation à long terme et une inoculation rapide, nous vous recommandons de préparer un bouillon de glycérol. Par conséquent, pendant la phase exponentielle de croissance cellulaire, prélevez 0,5 ml de culture cellulaire et mélangez-la soigneusement avec 0,5 ml de glycérol à 50 %. Congeler la suspension cellulaire dans de l'azote liquide et conserver à -80°C. Utiliser le stock de glycérol pour les futures inoculations.

7. Centrifuger le milieu de culture à 4 000 × g pendant 15 min et 4°C pour récolter les cellules.

8. Isoler l'ADN plasmidique selon les instructions d'un kit de purification d'ADN plasmidique.

Linéarisation

9. Effectuer une digestion de restriction sur une échelle analytique de 50 µl. Pour cela, préparer un mélange réactionnel selon le protocole du tableau 4.

Bien que le volume total d'enzyme nécessaire dépende de la concentration définie par le fabricant, assurez-vous que le volume d'enzyme ne dépasse pas 10 % du volume total de la réaction pour éviter l'activité des étoiles due à un excès de glycérol. Si nécessaire, augmentez le volume du mélange réactionnel.

10. Mélanger tous les composants de la réaction, l'enzyme étant le dernier composant à être ajouté.

Réactif Quantité
Enzyme de restriction 10 unités
Tampon de réaction 10× Cutsmart 5 µl (1×)
ADN plasmidique 1 µg
ddH2O Ajouter jusqu'à 50 µl

11. Incuber la réaction de digestion 1 h à la température optimale pour l'enzyme de restriction.

Vérifiez les spécifications de l'enzyme, généralement il est de 25°C ou 37°C.

12. Vérifier l'efficacité de la linéarisation avec une électrophorèse sur gel en utilisant un gel d'agarose à 1 %. Appliquer ∼150 ng d'ADN par échantillon.

13. Après un test de linéarisation réussi, préparez une digestion à l'échelle préparative. Calculer la quantité d'enzyme nécessaire pour digérer la quantité totale de plasmide (par exemple, 1 U/µg d'ADN). Consultez les spécifications et les protocoles du fabricant de votre enzyme individuelle si nécessaire.

La quantité d'enzyme utilisée pour une digestion préparative peut être considérablement réduite lorsque le temps d'incubation est prolongé. Pour un temps d'incubation de 8 ou 16 heures, seulement 0,25 ou 0,13 U par µg d'ADN sont nécessaires, respectivement. Vérifiez les informations du fabricant de votre enzyme de restriction pour voir si elle convient à une digestion prolongée.

Le volume d'enzyme ne doit pas dépasser 10 % du volume réactionnel total pour empêcher l'activité en étoile due à un excès de glycérol.

Extraction phénol-chloroforme-alcool isoamylique

14. Ajouter un volume de solution PCI à la solution de réaction de digestion et mélanger vigoureusement avant de centrifuger pendant 10 min à 9 000 × g à 4°C.

15. Transférer avec précaution la phase aqueuse (phase supérieure) dans un nouveau tube et répéter l'extraction avec un volume de PCI frais. Transférer à nouveau la phase aqueuse dans un nouveau tube.

16. Ajouter un volume de chloroforme à la phase aqueuse. Bien mélanger et centrifuger pendant 10 min à 9 000 × g. Transférer avec précaution la phase aqueuse (phase supérieure) dans un nouveau tube.

Dans cette étape de chloroforme, les traces résiduelles de phénol sont éliminées.

17. Ajouter un dixième de volume de NaOAc 3 M à la phase aqueuse, mélanger et précipiter avec 0,7 volume de 2-propanol ou 2,5 volumes d'éthanol absolu. Incuber à -20°C pendant 1h.

18. Centrifuger 30 min à 9 000 × g et 4°C, décanter soigneusement le surnageant et laver le culot avec 5 ml d'éthanol à 70%, avant de centrifuger à nouveau pendant 15 min à 4°C et 9.000 × g.

19. Décanter le surnageant et sécher à l'air le culot 5-10 min. Résoudre l'ADN dans ∼500-2.000 µl ddH2O.

20. Déterminer la concentration par absorption UV/vis à 260 nm et effectuer une électrophorèse sur gel d'agarose avec un plasmide linéarisé et un plasmide non digéré comme contrôle.

Voir la figure 5 pour référence. Le plasmide linéarisé doit fonctionner différemment (généralement plus haut) dans le gel d'agarose que le plasmide superenroulé.

2: PRÉPARATION DE L'ADN PCR COMME MODÈLE

La PCR est une méthode rapide et pratique pour l'amplification d'ADN (Mullis et al., 1986). L'ADN matrice pour cette méthode est généralement acheté ou synthétisé en interne par synthèse en phase solide. La conception correcte de ce modèle d'ADN est décrite dans Planification stratégique. Si une homogénéité 3′ est requise, utiliser 2′-OLes amorces inverses modifiées par -méthyle sont une solution alternative à l'application de ribozymes. Le groupe méthoxy à l'extrémité 5' de l'ADN matrice PCR arrête la transcription car il déstabilise le complexe entre la polymérase et la matrice, empêchant la synthèse d'ARN sans matrice (Kao et al., 1999).

Pour une quantité maximale de produit PCR pur, les conditions de réaction telles que l'amorce, la matrice et le MgCl2 les concentrations doivent être optimisées. De plus, la température d'annelage doit être optimisée afin d'obtenir un rendement élevé en ADN produit. Toutes les optimisations et la procédure pour une PCR réussie sont décrites dans ce protocole de support.

Matériaux

  • Eau bidistillée (ddH2O)
  • ADN matrice PCR (Eurofins Genomics)
  • Amorce ADN directe (Eurofins Genomics)
  • Amorce d'ADN inverse (Eurofins Genomics)
  • ADN polymérase haute fidélité Phusion ® (New England Biolabs, n° cat. M0530)
  • Tampon Phusion haute fidélité (HF)/GC (New England Biolabs, référence B0518S/B0519S)
  • dNTP (New England Biolabs, référence N0447L)
  • Solution de gel PAGE natif pour l'ADN (voir recette)
  • solution sur gel d'agarose (voir la recette)
  • Tampon de chargement d'ADN (par exemple, Gel Loading Dye : Purple, New England Biolabs ou voir la recette)
  • Tampon de fonctionnement ADN (1× TAE voir recette)
  • Diméthylsulfoxyde (DMSO)
  • Thermocycleur (Biometra Tone Analytik Jena Company)
  • Chambre de coulée de gel d'agarose et plaques de verre
  • Chambre de coulée PAGE et plaques de verre (Société Biometra multigel Analytik Jena)
  • Congélateur (−20°C/−80°C)

1. Concevoir l'ADN de la matrice PCR (voir Planification stratégique) et les amorces. Achetez des constructions ou préparez-les via une synthèse en phase solide (par exemple, Eurofins Genomics).

Les amorces doivent avoir une température de fusion similaire. De plus, ils doivent avoir une longueur de 10 à 20 nt. Gardez à l'esprit que la séquence d'amorce pourrait potentiellement apparaître à plusieurs reprises dans la séquence d'ADN cible, entraînant une erreur d'amorçage et des sous-produits indésirables.

2. Reconstituer l'ADN matrice PCR lyophilisé avec ddH2O pour obtenir une concentration de 100 µM.

Préparer une solution mère d'ADN diluée avec une concentration de 1 µM, pour éviter les cycles répétés de décongélation et de congélation de la solution mère d'origine pour chaque expérience PCR.

3. Reconstituer les amorces lyophilisées avec ddH2O pour obtenir une concentration de 100 uM.

4. Vérifiez les étapes d'optimisation suivantes sur une PAGE native pour l'ADN ou un gel d'agarose.

Une PAGE native pour l'ADN révélera des bandes plus nettes qu'un gel d'agarose. Cependant, pour les constructions d'ADN plus grandes (>1 kpb), un gel d'agarose est plus approprié, car l'ADN migre plus rapidement à travers la matrice de gel.

5. Optimiser la température de recuit et le nombre de cycles (Fig. 6). Optimisez le temps d'allongement en fonction de la longueur du gabarit. Un exemple de programme est présenté dans le tableau 5.

3°C au-dessus de la température de fusion du primaire est un bon choix pour une température de recuit initial. Optimiser dans une plage de ±10°C autour des températures de fusion du primaire. Pour le nombre de cycles, utilisez jusqu'à 30 cycles.

Étape Température Temps
1. Dénaturer 98°C 2 minutes
2. Recuit 50°-60°C 20 s
3. Allongement 72°C 15 s
4. Dénaturer 98°C 10 s
5. Passez à l'étape 2. Répétez 20-30 fois

6. Optimiser les concentrations d'amorces pour maximiser le rendement en ADN cible (Fig. 7). Essayez 0,5-1,0 µM pour chaque amorce.

7. Optimiser la concentration d'ADN de la matrice PCR pour maximiser le rendement en ADN cible et éviter des sous-produits supplémentaires (voir Dépannage). Essayez un modèle de 1 à 3 ng/µl.

8. Optimiser la concentration de DMSO en cas de sous-produits pour faciliter la liaison des amorces. Utilisez jusqu'à 3% de DMSO.

Si vous utilisez du DMSO, réduisez la température d'annelage (∼1°-2°C) car le DMSO diminue la température de fusion des oligonucléotides. Une optimisation supplémentaire de la température de recuit avec du DMSO peut être réalisée.

9. Déterminer la quantité d'ADN requise pour la réaction de transcription préparatoire.

10. Placez un master mix avec tous les réactifs dans un tube de réaction de 2 ml comme indiqué dans le schéma de pipetage (tableau 6) et répartissez-le dans des tubes de réaction PCR. Chaque tube doit contenir 50 µl de mélange réactionnel.

Réactif Quantité
ddH2O Pour cibler le volume
Tampon HF/GC
ADN matrice PCR 1-3 ng/µl
Amorce avant 0,5-1,0 µM
Apprêt inversé 0,5-1,0 µM
mélange dNTP 200 µM
DMSO (facultatif) Jusqu'à 3%
Phusion DNAP 1 U / ul de 50 PCR

11. Effectuez une PCR avec les conditions optimisées.

12. Combinez les échantillons des tubes de réaction PCR individuels et exécutez une électrophorèse analytique sur gel d'agarose ou une PAGE native pour l'ADN pour confirmer une réaction réussie.

13. Utilisez le produit PCR directement pour la transcription sans aucune étape de purification dans le cas d'un seul produit pur.

Si des sous-produits sont formés mais ne sont pas transcrits, le produit PCR peut être utilisé pour une transcription supplémentaire sans purification. Conserver à -20°C s'il n'est pas utilisé directement.

3 : PRÉPARATION DE L'ARN POLYMÉRASE T7 (T7 RNAP)

Bien que T7 RNAP soit disponible dans le commerce, l'achat de la quantité requise pour une transcription d'ARN in vitro à l'échelle RMN peut être assez coûteux. Ce protocole de support offre une alternative simple et économique au produit commercial. De plus, nous recommandons d'utiliser le mutant P266L de l'ARNP T7 car il améliore significativement la transcription in vitro, notamment à partir de matrices portant des séquences initiales défavorables (Guillerez et al., 2005).

Matériaux

  • BL21 DE3 E. coli cellules portant le plasmide pBH161 (le plasmide était un don de M. Dreyfus, CNRS, Paris, France cellules fournies par New England Biolabs)
  • milieu LB ou TB (voir la recette)
  • 100 mg/ml d'ampicilline
  • Émulsion antimousse Y-30 (par exemple, MilliporeSigma)
  • 1 M IPTG
  • Tampon A RNAP T7 (voir recette)
  • Tampon B RNAP T7 (voir recette)
  • Gel d'empilage et de résolution SDS (voir recette)
  • SDS tampon en cours d'exécution (voir la recette)
  • un tampon d'échantillon SDS (voir la recette)
  • Solution de coloration de Coomassie (voir recette)
  • Tampon RNAP T7 C (voir recette)
  • Glycérol (Carl Roth, n° cat. 3783.1)
  • Incubateur à secousses
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Homogénéisation à haute pression (par exemple, Microfluidizer ® M-110 P Microfluidics)
  • Système FPLC
  • Colonne d'affinité Ni-NTA de 5 ml (par exemple, colonne GE HisTrap HP de 5 ml)
  • Chambre de coulée SDS et plaques de verre (XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System)
  • Colonne d'exclusion stérique préparative (par exemple, colonne de filtration sur gel GE HiLoad 26/600 Superdex 200 pg)
  • Congélateur (−20°C/−80°C)

Expression et récolte cellulaire

1. Préparer 50 ml de culture starter et 1 L de culture principale contenant du milieu LB ou TB avec 100 µg/ml d'ampicilline.

Bien que le milieu LB soit plus couramment utilisé dans les cultures cellulaires bactériennes, le milieu TB peut produire une densité cellulaire jusqu'à trois fois plus élevée, ce qui entraîne une quantité accrue de protéine exprimée. Sur la base des expressions précédentes, 1 L de milieu TB donne entre 5 et 10 mg de protéine purifiée.

Ajouter de l'ampicilline directement avant utilisation.

2. Inoculer la culture starter avec un stock de glycérol de BL21 DE3 E. coli cellules contenant le plasmide pBH161 et incuber à 37°C et 120 tr/min pendant une nuit.

3. Mesurer la DO600 de la culture starter et transférer le volume approprié dans la culture principale pour ajuster la DO initiale600 à ∼0.1.

Si vous prévoyez d'ajouter une émulsion antimousse à la culture principale pour éviter la formation de mousse, considérez que l'antimousse augmentera la densité optique du milieu de culture et doit être ajouté à la culture principale avant toute mesure à blanc.

4. Incuber la culture principale à 37°C et 120 rpm jusqu'à OD600 de 0,6-0,8 pour le milieu LB ou de 1-2 pour le milieu TB est atteint.

En raison de la densité cellulaire maximale plus élevée dans le milieu TB, le point d'induction idéal dans la croissance exponentielle est à une DO plus élevée600 valeur. OD600 de 0,6-0,8 est généralement atteint dans les 3-4 heures, OD600 de 1-2 dans les 4-5 heures.

5. Ajouter IPTG à une concentration finale de 0,5 mM pour induire l'expression de la protéine.

6. Cultiver les cellules à 37°C jusqu'à OD600 de 10-15 est atteint. Cela prend généralement 3 heures de plus.

7. Centrifuger le milieu de culture à 4 000 × g et 4°C pendant 15 min pour récolter le culot cellulaire.

Purification

Effectuer toutes les étapes de purification à 4°C.

8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le tampon A RNAP T7 (∼ 25 ml de lysat pour 1 L de culture cellulaire).

9. Lyser la suspension cellulaire par homogénéisation à haute pression.

Réglez la pression du système à 15 000 psi. Après avoir lavé l'homogénéisateur avec 300 à 400 ml d'eau suivis de 200 ml de tampon A RNAP T7, le lysat est recyclé cinq à six fois dans le système tout en maintenant constamment la glace du bécher à serpentin refroidie. Sachez que ces volumes s'appliquent au Microfluidizer ® et peuvent changer avec les différents modèles ou méthodes d'homogénéisation. Pour plus de détails, reportez-vous aux protocoles du fabricant.

10. Centrifuger le lysat à >35 000 × g pendant 30 min à 4°C.

11. Décanter le surnageant et filtrer avec une taille de pores de 0,8 µm si des précipités sont visibles.

12. Équilibrer une colonne Ni-NTA de 5 ml avec dix volumes de colonne (CV) T7 RNAP tampon A.

Pour les débits et les limites de pression, utilisez les réglages conformément aux spécifications de la colonne.

13. Chargez la solution de protéines sur la colonne.

14. Laver la colonne avec dix tampons CV T7 RNAP A.

15. Laver la colonne avec dix CV 5% de tampon B RNAP T7.

16. Laver la colonne avec dix CV 10 % de tampon B RNAP T7.

17. Appliquer un gradient de tampon B 100 % T7 RNAP sur 100 ml et recueillir l'éluat en fractions de 5 ml (voir la figure 8A pour référence).

18. Exécutez une SDS-PAGE à 12% de toutes les fractions et fractions de pool qui contiennent T7 RNAP (voir Fig. 9A pour référence).

19. Équilibrer une colonne de filtration sur gel avec 1,5 CV 2,5 × T7 RNAP tampon C.

20. Chargez T7 RNAP dans la colonne d'exclusion de taille.

Le volume maximum à charger dépend de la taille et des spécifications de la colonne. Vérifiez les recommandations du fabricant pour assurer une séparation optimale. Si nécessaire, réduisez le volume de la solution enzymatique par concentration centrifuge.

21. Éluer avec un CV de 2,5 x tampon C RNAP T7 et recueillir l'éluat en fractions de 5 ml (voir la figure 8B pour référence).

22. Exécutez une SDS-PAGE à 12% de toutes les fractions et fractions de pool qui contiennent T7 RNAP (voir Fig. 9B pour référence).

23. Vérifier les fractions sélectionnées pour la contamination par la RNase en incubant une quantité analytique de chaque fraction avec ∼15 pg d'ARN de choix pendant une nuit à température ambiante ou pendant 4 heures à 37°C. Inclure également un échantillon témoin sans protéine. Vérifiez sur une PAGE dénaturante si l'ARN est toujours intact. La bande d'ARN doit être distincte et nette. Une bande d'ARN étalée ou une fragmentation en ARN plus petits est une indication de la digestion par la RNase. Protéine de pool qui ne montre aucun signe d'activité RNase.

24. Ajuster la concentration en protéines à 6 mg/ml avec 2,5 x tampon C RNAP T7.

25. Ajouter du glycérol à une concentration finale de 60 % (concentration finale en protéines : 2,4 mg/ml 1 x tampon C RNAP T7), aliquoter et conserver l'enzyme à –80°C.

4 : PRÉPARATION DE LEVURE PYROPHOSPHATASE INORGANIQUE (YIPP)

Le rendement en ARN d'une transcription dépend fortement de la concentration en ions Mg 2+ dans le mélange réactionnel. La formation de pyrophosphate conduit à une précipitation de pyrophosphate de magnésium diminuant de manière concomitante la concentration en ions Mg 2+ dans la solution. Étant donné que le repliement des ribozymes et l'activité de l'ARNP T7 dépendent des ions Mg 2+, leur concentration doit être maintenue stable pendant la transcription (Karlsson, Baronti, & Petzold, 2020). Pour atteindre cette stabilité, 9,6 µg/ml de YIPP peuvent être utilisés pour décomposer le pyrophosphate en monophosphate, empêchant ainsi l'élimination du magnésium par précipitation (Kunitz, 1952).

Matériaux

  • plasmide pET-21a(+)-IPP1-His (le plasmide était un cadeau de Sebastian Maerkl Addgene, plasmide #118978, voir Lavickova & Maerkl, 2019 )
  • LB moyen (voir recette)
  • 100 mg/ml d'ampicilline
  • BL21(DE3) Compétent E. coli cellules (New England Biolabs)
  • 1 M IPTG
  • Tampon YIPP A (voir recette)
  • Tampon YIPP B (voir recette)
  • Gel d'empilage et de résolution SDS (voir recette)
  • Tampon de fonctionnement SDS (voir recette)
  • Tampon échantillon SDS (voir recette)
  • Solution de coloration de Coomassie (voir recette)
  • Tampon YIPP C (voir recette)
  • Tampon YIPP D (voir recette)
  • Glycérol (Carl Roth, n° cat. 3783.1)
  • Incubateur à secousses
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Homogénéisation haute pression (ex. Microfluidizer ® M-110 P Microfluidics)
  • Système FPLC
  • Colonne d'affinité Ni-NTA de 5 ml (par exemple, colonne GE HisTrap HP de 5 ml)
  • Chambre de coulée SDS et plaques de verre (XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System)
  • Colonne d'exclusion stérique préparative (par exemple, colonne de filtration sur gel GE HiLoad 26/600 Superdex 75 pg)
  • Congélateur (−20°C/−80°C)

Expression et récolte cellulaire

Sur la base des expressions précédentes, 1 L de milieu LB donne entre 35 et 40 mg de protéine purifiée.

1. Préparer 50 ml de culture starter et 1 L de culture principale contenant 2 × milieu LB et 100 µg/ml d'ampicilline.

Ajouter de l'ampicilline directement avant utilisation.

2. Inoculer la culture starter avec un stock de glycérol de BL21 DE3 E. coli cellules contenant le plasmide pET-21a(+)-IPP1-His et incuber à 37°C et 160 tr/min pendant la nuit.

3. Mesurer la DO600 de la culture starter et transférer le volume approprié dans la culture principale pour ajuster la DO initiale600 à ∼0.1.

4. Incuber la culture principale à 37°C et 130 rpm jusqu'à OD600 de 0,6-0,8 est atteint.

OD600 de 0,6 à 0,8 est généralement atteint en 3 à 4 heures.

5. Ajouter une concentration finale de 1 mM d'IPTG pour induire l'expression de la protéine.

6. Cultiver les cellules pendant encore 5 heures à 37°C.

7. Centrifuger le milieu de culture à 4 000 × g pendant 30 min et 4°C pour récolter le culot cellulaire.

Purification

Pour maintenir la thermostabilité de l'enzyme, il est recommandé que toutes les étapes de purification soient effectuées à 4°C.

8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le tampon YIPP A (∼25 ml de lysat pour 1 L de culture cellulaire).

9. Lyser la suspension cellulaire par homogénéisation à haute pression.

10. Décanter le surnageant et filtrer avec une taille de pores de 0,8 µm si des précipités sont visibles.

11. Équilibrer une colonne Ni-NTA de 5 ml avec dix CV de tampon YIPP A.

12. Chargez la solution de protéines sur la colonne.

13. Laver la colonne avec dix CV de tampon YIPP A.

14. Éluer avec un gradient de tampon YIPP B (0 % à 100 % sur 50 min) et recueillir l'éluat en fractions de 5 ml (voir Support Protocol 3, Fig. 8A pour référence).

15. Exécutez une SDS-PAGE à 15 % de toutes les fractions et fractions de pool qui contiennent du YIPP (33,2 kDa, voir Support Protocol 3, Fig. 9A pour référence).

L'étape d'exclusion de taille suivante n'est pas obligatoire mais recommandée.

16. Équilibrer la colonne d'exclusion stérique avec 1,5 CV de tampon YIPP C.

17. Chargez la solution YIPP sur la colonne d'exclusion de taille.

Le volume maximum à charger dépend de la taille et des spécifications de la colonne. Vérifiez les recommandations du fabricant pour assurer une séparation optimale. Si nécessaire, réduisez le volume de la solution enzymatique par concentration centrifuge.

18. Éluer avec un CV de tampon YIPP C et recueillir l'éluat en fractions de 5 ml (voir Support Protocol 3, Fig. 8B pour référence).

19. Exécutez une SDS-PAGE à 15 % de toutes les fractions et fractions de pool qui contiennent YIPP (voir Support Protocol 3, Fig. 9B pour référence).

20. Vérifier les fractions contenant du YIPP pour la contamination par la RNase en incubant une quantité analytique de chaque fraction avec ∼15 pg d'ARN de choix pendant une nuit à température ambiante ou pendant 4 heures à 37°C. Inclure également un échantillon témoin sans protéine. Vérifiez sur une PAGE dénaturante si l'ARN est toujours intact. La bande d'ARN doit être distincte et nette. Une bande d'ARN étalée ou une fragmentation en ARN plus petits est une indication de la digestion par la RNase. Protéine de pool qui ne montre aucun signe d'activité RNase.

21. Dialyse les fractions combinées deux fois (1 h chacune) contre 1 L de 2 × tampon YIPP D.

22. Ajuster la concentration à ∼ 2,4 mg/ml en utilisant la concentration centrifuge.

23. Ajouter 50 % (v/v) de glycérol pour atteindre une concentration de stock finale de 1,2 mg/ml.

24. Aliquoter et conserver l'enzyme à –20°C.

2 : PRÉPARATION D'ARN MARQUÉS SPÉCIFIQUES AU SITE À L'AIDE D'UNE SYNTHÈSE CHIMO-ENZYMATIQUE

La caractérisation spectroscopique RMN d'ARN de plus en plus longs est entravée par un chevauchement de résonance accru. Ce problème peut potentiellement être évité par des méthodes d'étiquetage spécifiques au site. Cependant, la méthode la plus couramment utilisée à ces fins, la synthèse en phase solide, est limitée à ∼50 nt (Jud & Micura, 2017). Ici, nous fournissons un protocole pour la synthèse chimio-enzymatique des ARN qui contiennent un seul nucléotide modifié/marqué à une position souhaitée sans aucune limitation de taille. Par l'incorporation spécifique au site de nucléosides marqués au 13 C, au 15 N ou modifiés non naturels, tels que les groupes 19 F ou 13 C-méthoxy, l'abondance du signal est considérablement réduite et des spectres avec des signaux uniques peuvent être obtenus (Keyhani et al., 2018 ). En utilisant cette méthode, il est même possible d'incorporer des nucléosides modifiés portant des modifications stériquement exigeantes telles que des groupes protecteurs photoamovibles (par exemple, ortho-nitrophényléthyle) ou des photocommutateurs (par exemple, azobenzène).

L'incorporation site-spécifique d'un nucléotide modifié dans un ARN implique trois étapes enzymatiques (voie enzymatique sur la figure 10). La première étape est une extension 3' du brin d'ARN accepteur (ARN 1) avec le nucléoside modifié 3',5'-bisphosphate (pour la synthèse, voir le protocole de support 5) en utilisant la T4 RNA Ligase 1 (T4 Rnl1). D'autres extensions sont bloquées par le groupe phosphate en position 3' du nucléotide modifié. Le mélange de ligature peut être purifié par RP-HPLC ou l'ARN non ligaturé peut être oxydé par NaIO4 pour le retirer de la voie enzymatique. Le groupement phosphate en position 3' est éliminé par une phosphatase et l'ARN est (attelle) ligaturé avec le brin d'ARN donneur 5'-phosphorylé (ARN 2) en présence d'une attelle d'ADN par la T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl2 pour l'enzyme préparation voir Protocole d'assistance 6). L'ARN est purifié, par exemple, par RP-HPLC. Les enzymes peuvent être achetées dans le commerce, cependant, nous recommandons de préparer T4 Rnl2 en interne en raison du facteur de coût important et de l'efficacité de ligature plus élevée observée, comme décrit dans le protocole de support 6.

Matériaux

  • Eau bidistillée (ddH2O)
  • Nucléoside 3′,5′-Bisphosphate (voir Protocole de support 5)
  • ARN accepteur (ARN 1) avec un groupe OH à l'extrémité 3' (voir Protocole de base 1)
  • ARN donneur (ARN 2) avec un groupe phosphate à l'extrémité 5' (Eurofins Genomics ou voir Basic Protocol 1)
  • Attelle ADN (Eurofins Genomics)
  • T4 Polynucléotide Kinase (T4 PNK New England Biolabs, n° cat. M0201S)
  • T4 RNA Ligase 1 (New England Biolabs, n° cat. M0204S)
  • Tampon T4 RNA Ligase 1 (fourni avec la T4 RNA Ligase 1)
  • Phosphatase et tampon respectif (par exemple, phosphatase alcaline de crevette, par exemple New England Biolabs, n° cat. M0371S)
  • 10× Tampon de réaction CutSmart ® (New England Biolabs, n° cat. B7204S fourni avec de la phosphatase alcaline de crevette)
  • T4 RNA Ligase 2 (voir Support Protocol 6 New England Biolabs, n° cat. M0239S)
  • Tampon T4 DNA Ligase (New England Biolabs, n° cat. B0202S)
  • DMSO (Carl Roth, n° cat. A994.2)
  • ATP (MilliporeSigma, n° cat. A6419-1G)
  • Solution d'alcool phénol-chloroforme-isoamylique (PCI) (p. ex. ROTI ® , n° cat. A156.1)
  • Chloroforme (Thermo Fisher Scientific, n° de cat. 10293850)
  • Périodate de sodium (NaIO4 Carl Roth, chat. non. 2603.1)
  • 50% (v/v) d'éthylène glycol (Grüssing, n° cat. 103081000U)
  • Acétate de sodium 3 M (NaOAc), pH 5,5 (Carl Roth, n° cat. 6773.2)
  • Éthanol absolu (Merck, n° cat. 32205-2.5L-M)
  • Tampon de chargement d'ARN dénaturant (voir recette)
  • Solution gel PAGE dénaturante (voir recette)
  • Dénaturer le tampon de fonctionnement PAGE (1× TBE voir recette)
  • DNase et tampon approprié (par exemple, Turbo™ DNase, Thermo Fisher Scientific, référence AM2238)
  • Hexafluoro-2-propanol (HFIP Fluorochem, n° cat. 003409)
  • Méthanol (Thermo Fisher Scientific, n° cat. M/4000/17)
  • Matériaux pour la PAGE préparatoire (voir Protocole alternatif 1)
  • Incubateur à secousses
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Concentrateur centrifuge (par exemple, Vivaspin™, Sartorius™)
  • Congélateur (−20°C/−80°C)
  • Lyophilisateur/concentrateur sous vide centrifuge (Alpha 2-4, Christ sous vide concentrateur plus, Eppendorf)
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Chambre de coulée PAGE et plaques de verre (Société Biometra multigel Analytik Jena)
  • Bloc thermique
  • Appareil HPLC (Elite LaChrom VWR-Hitachi)
  • Colonne HPLC (par exemple, XBridge Peptide BEH C18 : 300 Å, 3,5 µm, 4,6 × 250 mm)

1. Préparez un nucléoside modifié 3′,5′-bisphosphate comme décrit dans le protocole de support 5.

2. Préparez le brin d'ARN accepteur (ARN 1) et le brin d'ARN donneur (ARN 2) comme décrit dans le protocole de base 1, étapes 1-27 ou achetez-les dans le commerce.

Le brin d'ARN accepteur nécessite un groupe OH à l'extrémité 3' et le brin d'ARN donneur nécessite un groupe phosphate à l'extrémité 5' pour l'incorporation chimio-enzymatique. Il n'y a pas de limites de longueur pour les ARN accepteurs ou donneurs, bien que dans le cas d'un fragment très court (<10 nt) et d'un fragment très long (>150 nt), la séparation RP-HPLC sera difficile.

3. Préparez l'attelle d'ADN pour la dernière étape enzymatique ou achetez-la dans le commerce.

L'attelle d'ADN doit avoir une longueur d'au moins 40 paires de bases. Les deux côtés ont besoin d'un chevauchement d'au moins 10 nt chacun. Le chevauchement n'a pas besoin d'être égal des deux côtés. La température de fusion doit dépasser 40°C pour assurer un recuit correct de l'attelle.

4. Effectuer une 5'-phosphorylation du brin d'ARN donneur (ARN 2), par exemple, avec la polynucléotide kinase T4 (T4 PNK). Suivez le protocole du fabricant.

Comme alternative, un brin d'ARN 2 court (<30 nt) 5'-phosphorylé peut être acheté dans le commerce.

5. Nous recommandons l'achat de T4 RNA Ligase 1 (T4 Rnl1) et la phosphatase dans le commerce et la préparation de T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl2) en interne comme décrit dans le protocole de support 6.

Extension 3' de l'ARN accepteur (ARN 1)

6. Préparer le mélange de ligature qui comprend tous les composants du tableau 7. Incuber le mélange de ligature à 37°C et 300 tr/min pendant la nuit. De plus, préparer un contrôle négatif sans T4 Rnl1.

Le contrôle négatif est nécessaire pour suivre si l'ARN non ligaturé est retiré de la voie enzymatique au cours de l'oxydation (étape 9). Par conséquent, il sera traité comme tous les autres échantillons dans les étapes suivantes et sera appelé « contrôle négatif de l'étape 1 » au cours de ce protocole. L'efficacité de la ligature dépend du type de modification. L'intensification de la réaction peut entraîner une diminution de l'efficacité de la ligature. Il est recommandé de préparer plusieurs lots en parallèle au lieu d'un seul gros lot.

Réactif Quantité
ARN accepteur (ARN 1) 50 µM
3′,5′-Bisphosphate nucléoside 200 µM
Tampon T4 ARN ligase
DMSO 20%
T4 ARN ligase 1 10 unités par nmol d'ARN
ATP 1 mm
ddH2O Ajouter jusqu'à 50-200 µl

7. Effectuez une extraction PCI pour supprimer T4 Rnl1.

Nous vous recommandons d'utiliser un gel 5 Prime Phase Lock de Quantabio pour une meilleure séparation des phases, en particulier pour les volumes <150 µl. Pour une extraction 5 Prime Phase Lock Gel, suivez le manuel du fabricant.

Comme alternative, le mélange de ligature peut être purifié par RP-HPLC (voir étape 31). Dans ce cas, l'oxydation de l'étape 9 n'est pas requise, passez à l'étape 16. Tenez compte du fait que la longueur des deux ARN diffère dans un nucléotide. Pour un ARN accepteur long (>30 nucléotides) (ARN 1), la purification par RP-HPLC ne sera pas possible.

8. Ajouter un volume de solution PCI à la solution réactionnelle et mélanger vigoureusement. Centrifuger 10 min à 10 000 × g et 4°C.

9. Transférer avec précaution la phase aqueuse (phase supérieure) dans un nouveau tube et répéter l'extraction avec un volume de solution PCI fraîche.

Deux extractions sont généralement suffisantes.

10. Ajouter un volume de chloroforme à la phase aqueuse (pour éliminer les traces de phénol) et bien mélanger. Centrifuger 10 min à 10 000 × g et 4°C. Transférer avec précaution la phase aqueuse (phase supérieure) dans un nouveau tube de réaction.

11. Préparez le concentrateur centrifuge comme décrit dans le manuel de l'appareil.

Choisissez un seuil MW qui correspond à environ un tiers de la taille de votre ARN cible. De cette façon, l'ARN ne traversera pas la membrane.

12. Transférer l'ARN dans le concentrateur centrifuge et centrifuger à la vitesse recommandée pour éliminer le tampon de ligature.

L'ATP et le DTT dans le tampon de ligature empêcheront l'oxydation par NaIO4. Des précipitations répétées à l'éthanol (environ trois) pourraient également être suffisantes pour éliminer le tampon de ligature.

13. Effectuer l'oxydation avec NaIO4 pour éliminer l'ARN non ligaturé de la voie enzymatique. Oxydez le « contrôle négatif de l'étape 1 ». Le schéma de pipetage pour l'oxydation est illustré dans le tableau 8. Incuber la réaction 1 h et 300 tr/min à température ambiante (23°C).

NaIO4 est sensible à la lumière. Par conséquent, il est recommandé de protéger le mélange réactionnel de la lumière, par exemple avec une feuille d'aluminium.

14. Arrêter la réaction d'oxydation en ajoutant 0,5 volume d'éthylène glycol à 50 % (v/v). Incuber le mélange 5 min à 300 rpm.

15. Ajouter une solution de NaOAc (pH 5,5) à la phase aqueuse jusqu'à une concentration finale de 0,3 M. Ajouter 2,5 volumes d'éthanol absolu froid et incuber au moins 6 heures à -20°C.

16. Centrifuger à 8 000 × g et 4°C pendant 40 min. Retirer le surnageant et le conserver pour une précipitation supplémentaire.

Parfois, l'ARN ne précipite pas quantitativement.

17. Sécher le culot à l'air (15-30 min) ou/et utiliser un concentrateur sous vide pendant 2 min.

18. Reconstituer le culot d'ARN dans 50-200 µl de ddH2O.

19. Analyser l'ARN par spectroscopie d'absorption UV/vis et PAGE dénaturante analytique.

Tenez compte du fait que l'absorption UV/vis peut être plus élevée en raison des restes d'ATP et de nucléoside 3′,5′-bisphosphate, qui peuvent ne pas avoir été entièrement éliminés à l'étape 3.

Déphosphorylation de l'ARN ligaturé

20. Pour la déphosphorylation avec, par exemple, la phosphatase alcaline intestinale rapide de veau (CIP), la phosphatase antarctique (AnP) ou la phosphatase alcaline de crevette (rSAP), voir le manuel du fabricant de la phosphatase respective. Déphosphoryler également le « contrôle négatif de l'étape 1 ».

Nous recommandons le protocole suivant avec le schéma de pipetage indiqué dans le tableau 9.Incuber à 37°C pendant au moins 6h. La déphosphorylation devrait conduire à un turn-over presque quantitatif. L'intensification de la réaction peut entraîner une diminution de l'efficacité de la ligature. Par conséquent, il est conseillé de préparer plusieurs lots en parallèle au lieu d'un seul gros lot.

Réactif Quantité
ARN ligaturé 20-40 µM
Tampon CutSmart®
rSAP 1 unité pour 500 pmoles d'ARN
ddH2O Ajouter jusqu'à 50-100 µl

21. Effectuez l'extraction PCI pour éliminer la phosphatase comme décrit dans les étapes 3-6.

La désactivation par la chaleur n'est pas recommandée, car la concentration élevée en cations peut entraîner une dégradation de l'ARN.

22. Effectuez une précipitation à l'éthanol comme décrit dans les étapes 11-13.

23. Reconstituer le culot d'ARN dans 50-100 µl de ddH2O.

24. Analyser l'ARN par spectroscopie d'absorption UV/vis et PAGE dénaturante analytique.

Ligature attelle de l'ARN déphosphorylé avec l'ARN donneur (ARN 2)

25. Préparer le mélange pour la ligature par attelle conformément au tableau 10. L'attelle ligature également le « contrôle négatif de l'étape 1 ». De plus, préparez un contrôle négatif sans T4 Rnl2.

L'optimisation du rapport entre l'accepteur, l'ARN donneur et l'attelle d'ADN ainsi que leurs concentrations dans le mélange réactionnel est recommandée. La mise à l'échelle de la réaction peut entraîner une diminution de l'efficacité de la ligature et, par conséquent, toute mise à l'échelle doit également être testée. Nous recommandons de préparer plusieurs lots en parallèle au lieu d'un seul gros lot. Nos tests ont montré que l'efficacité de la ligature est plus élevée avec le tampon T4 DNA Ligase qu'avec le tampon T4 Rnl2.

Réactif Quantité
ARN déphosphorylé 1-8 µM
ARN donneur (ARN 2) 1-8 µM
Attelle d'ADN 1-8 µM
Tampon d'ADN ligase T4
ddH2O Ajouter jusqu'à 50-1 000 µl
Ratio d'optimisation (ARN déphosphorylé/ARN donneur/attelle ADN) 1:1:1, 1:2:1, 2:1:2, 1:1:2

26. Chauffer l'échantillon à 80°C pendant 4 min.

27. Refroidir l'échantillon à 37°C pendant 10 min.

28. Incuber 15 min à 37°C et 300 tr/min.

29. Ajouter 1 % (v/v) de T4 Rnl2 produit en interne (2 mg/ml) et incuber la réaction pendant 2-3 heures supplémentaires à 37°C et 300 tr/min.

30. Effectuez l'extraction PCI comme décrit dans les étapes 3-6.

31. Effectuez la précipitation à l'éthanol comme décrit dans les étapes 11-13.

32. Reconstituer le culot d'ARN dans 20-200 µl de ddH2O.

33. Retirer l'attelle d'ADN avec une DNase, par exemple Turbo™ DNase. Suivez le manuel du fabricant.

Un temps d'incubation très long (par exemple, une nuit) peut entraîner une dégradation de l'ARN.

34. Analyser l'ARN par denat analytique. PAGE. Appliquer un échantillon d'ARN avec l'ARN 1 et l'ARN 2 sur le denat. PAGE comme référence.

Le « contrôle négatif étape 1 » et le contrôle négatif sans T4 Rnl2 ne doivent présenter aucune bande de produit sur le denat. PAGE. S'il y a une bande de produit, cela indique soit une digestion incomplète de la DNase, soit un échec de l'oxydation avec NaIO4.

35. Purifier l'ARN produit par RP-HPLC à 60°C.

Nous utilisons une colonne XBridge Peptide BEH C18 (300 Å, 3,5 µm, 4,6 × 250 mm) de Waters (Figs. 11 et 12). Le gradient RP-HPLC est décrit dans le tableau 11.

Comme alternative à la RP-HPLC, l'ARN produit peut être purifié par PAGE préparative (voir Protocole alternatif 1).

36. Retirer le tampon RP-HPLC via un lyophilisateur ou un concentrateur centrifuge sous vide.

37. Reconstituer le culot dans 20-200 µl de ddH2O.

38. Analyser les fractions par PAGE dénaturante analytique.

39. Combiner les fractions contenant le produit propre.

40. Pliez l'ARN en une seule conformation et préparez l'échantillon RMN comme décrit dans le protocole de base 1, étapes 30-46.

5 : SYNTHÈSE DE NUCLEOSIDE MODIFIÉ 3′,5′-BISPHOSPHATES

Les nucléosides modifiés nécessitent un groupe phosphate aux positions 3',5' pour une incorporation spécifique au site dans l'ARN comme décrit dans le protocole de base 2. Ce protocole de support décrit la synthèse d'un nucléoside modifié 3',5'-bisphosphate (Barrio et al., 1978 Fig. 13).

Matériaux

  • Nucléoside modifié (voir Protocole de base 2)
  • Gaz inerte (par exemple, argon)
  • 0,1 % (v/v) de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC Carl Roth, n° cat. K028.2)
  • Triéthylamine (VWR Chemicals, réf. 28745.296)
  • Tampon bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), 1,0 M, pH 8,0
  • Tampon bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), 0,4 M, pH 8,0
  • Chlorure de diphosphoryle (MilliporeSigma, n° cat. 381829-5ML)
  • Eau bidistillée (ddH2O)
  • 2-Propanol (VWR Chemicals, n° de cat. 20842.330)
  • Solution d'ammoniaque à 25 % (NH3 Produits chimiques VWR, cat. non. 1133.1000)
  • tube de Schlenk
  • Refroidisseur à immersion (FT902 Julabo)
  • Chromatographie sur couche mince (CCM ALUGRAM ® Xtra SIL G/UV Macherey-Nagel)
  • Lampe UV, 245 et 365 nm (UVGL-58 Analytik Jena Company)
  • Lyophilisateur/concentrateur sous vide centrifuge (Alpha 2-4, Christ sous vide concentrateur plus, Eppendorf)
  • Appareil HPLC (Elite LaChrom, VWR-Hitachi)
  • Colonne HPLC (par exemple, MZ Aqua Perfect, 100 Å, 5 µm 4,6 × 250 mm : analytique 10 × 250 mm : préparative)
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Congélateur (−20°C/−80°C)

1. Effectuer la synthèse sous une atmosphère protectrice pour l'exclusion de l'eau (par exemple, l'argon).

Le chlorure de diphosphoryle s'hydrolyse au contact de l'eau.

2. Préparez 1 M de tampon TEAB. Ajuster le pH à 8,0 avec de la glace sèche.

Incuber l'électrode de pH dans une solution DEPC à 0,1 % (v/v) pendant 30 minutes avant utilisation pour éviter la contamination par la RNase. Laver l'électrode avec ddH2O. Attendez que la neige carbonique se dissolve, puis vérifiez le pH. Travailler sous une hotte aspirante.

3. Préparez 0,4 M de tampon TEAB. Ajuster le pH à 8,0 avec de la glace sèche.

4. Refroidir le nucléoside modifié à -12°C dans un tube de Schlenk.

Vous pouvez commencer avec une dose de 100 mg.

5. Ajouter dix équivalents de chlorure de diphosphoryle et agiter pendant 4 à 6 heures à -12°C.

6. Vérifiez la progression de la réaction par CCM.

Utiliser 6:3:1 2-propanol/NH3/H2O comme éluant. Le réactif migre généralement plus rapidement que le produit. Le produit a un RF valeur de ∼0,1-0,3.

7. Après conversion complète du matériau de départ (3 à 6 heures), ajouter lentement de la glace (deux à trois morceaux) au mélange réactionnel.

Dans cette étape, le chlorure de diphosphoryle restant est hydrolyse. La glace refroidit la réaction exothermique, lorsque 1,0 tampon TEAB (pH 8) est ajouté.

8. Ajuster le pH à 6,5 (utiliser du papier pH) avec du tampon TEAB 1,0 M pré-refroidi (pH 8,0).

Faites attention lors de l'ajout de 1,0 M de tampon TEAB (pH 8,0) car une forte formation de gaz se produit. Dans le cas où le mélange réactionnel n'est pas neutralisé après l'ajout de 20 ml de TEAB 1 M (pH 8) , ajouter de petits volumes (par exemple, 0,5 ml) par étapes d'une solution 1:1 eau/triéthylamine.

9. Réduire le volume de réaction (3-5 ml pour une échelle de 100 mg) avec un concentrateur centrifuge sous vide à 4°C.

En cas de précipitation, ajouter de l'eau pour reconstituer le précipité. Un plus petit volume de réaction facilite la purification RP-HPLC.

10. Purifier avec RP-HPLC à température ambiante.

Nous utilisons une colonne MZ Aqua Perfect (100 Å, 5 µm, 4,6 × 250 mm : analytique, 10 × 250 mm : préparative) (Fig. 14). Le gradient pour la purification est montré dans le tableau 12.

Les sous-produits possibles de la synthèse sont des mono- ou triphosphates, qui ne peuvent pas être séparés par RP-HPLC.

11. Déterminer les fractions contenant le produit par spectrométrie de masse et les regrouper.

12. Retirer le tampon RP-HPLC (triéthylamine) par co-évaporation et reconstituer le culot dans 10 ml ddH2O.

Vous pouvez utiliser un lyophilisateur ou un concentrateur centrifuge.

13. Répétez l'étape 12 sept à dix fois avec une quantité analytique de la substance qui est analysée par spectroscopie RMN. Le rendement de ligature n'est pas affecté par la triéthylamine. Pour éliminer la triéthylamine, trois à cinq cycles de co-évaporation suffisent.

L'élimination de la triéthylamine est nécessaire pour la caractérisation spectroscopique RMN.

14. Déterminer la concentration par spectroscopie d'absorption UV/vis.

15. Caractériser le produit par spectrométrie de masse et spectroscopie RMN ( spectroscopie de corrélation 1 H-1D, 13 C-1D, 31 P-1D, 1 H, 1 H [COSY], 1 H, 13 C-HSQC, 1 H, 31 P-HMBC).

Les sous-produits tels que les nucléosides mono- ou triphosphate ne seront pas acceptés par la T4 ARN ligase 1. Par conséquent, une séparation complète n'est pas requise. Le rendement dépend du type et de la position de la modification. Les 31 signaux P-1D sont généralement à ∼0 ppm.

16. Conserver le produit à -20°C à l'abri de la lumière.

6 : PREPARATION DE LA T4 ARN LIGASE 2

La T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl2 Ho & Shuman, 2002) est utilisée pour le protocole de base 2 et est disponible dans le commerce. Si vous achetez, assurez-vous que la ligase a une activité 2′,3′cycP estérase. Cependant, l'achat de la ligase est très coûteux. Par conséquent, ce protocole simple offre une alternative pour une préparation interne de l'enzyme. Nos tests ont montré que le T4 Rnl2 produit en interne est encore plus efficace que le T4 Rnl2 acheté (Fig. 15).

Matériaux

  • LB moyen (voir recette)
  • 100 mg/ml d'ampicilline
  • BL21(DE3) Compétent E. coli cellules (New England BioLabs)
  • Plasmide pET-RNL2 (le plasmide était un don de S. Shuman, The Sloan-Kettering Institute, New York)
  • Émulsion antimousse Y-30 (par exemple, MilliporeSigma)
  • 1 M IPTG
  • Tampon A T4 RNA Ligase 2 (Rnl2) (voir recette)
  • Tampon B T4 RNA Ligase 2 (Rnl2) (voir recette)
  • Tampon A RNAP T7 (voir recette)
  • Gel d'empilage et de résolution SDS (voir recette)
  • Tampon de fonctionnement SDS (voir recette)
  • Tampon échantillon SDS (voir recette)
  • Solution de coloration de Coomassie (voir recette)
  • Tampon C T4 RNA Ligase 2 (Rnl2) (voir recette)
  • Glycérol (Carl Roth, n° cat. 3783.1)
  • Incubateur à secousses
  • Spectrophotomètre UV/Vis (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifugeuse (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Homogénéisation à haute pression (par exemple, Microfluidizer ® M-110 P Microfluidics)
  • Système FPLC
  • Colonne d'affinité Ni-NTA de 5 ml (par exemple, GE HisTrap HP, colonne de 5 ml)
  • Chambre de coulée SDS et plaques de verre (XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System)
  • Colonne d'exclusion stérique préparative (par exemple, GE HiLoad 26/600 Superdex 200 pg)
  • Congélateur (−20°C/−80°C)

Expression et récolte cellulaire

1. Préparer 200 ml de culture starter et 1 L de culture principale contenant du milieu LB et 100 µg/ml d'ampicilline.

Ajouter de l'ampicilline directement avant utilisation.

2. Inoculer la culture starter avec un stock de glycérol de BL21 DE3 E. coli cellules contenant le plasmide pET-RNL2 et incuber à 37°C et 160 rpm pendant une nuit.

3. Mesurer la DO600 de la culture starter et transférer le volume approprié dans la culture principale pour ajuster la DO initiale600 à ∼0.1.

4. Incuber la culture principale à 37°C et 130 rpm jusqu'à OD600 de 0,8 est atteint.

Si vous prévoyez d'ajouter une émulsion antimousse à la culture principale pour éviter la formation de mousse, considérez que l'antimousse augmentera la densité optique du milieu de culture et doit être ajouté à la culture principale avant toute mesure à blanc.

5. Ajouter IPTG à une concentration finale de 1 mM pour induire l'expression de la protéine.

6. Cultiver les cellules à 37°C jusqu'à OD600 de 2 est atteint. Cela prend généralement 6 heures au total.

7. Centrifuger le milieu de culture à 4 000 × g et 4°C pendant 15 min pour récolter le culot cellulaire.

Purification

Effectuer toutes les étapes de purification à 4°C.

8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le tampon A de T4 RNA Ligase 2 (∼ 25 ml de lysat pour 1 L de culture cellulaire).

9. Lyser la suspension cellulaire par homogénéisation à haute pression.

Réglez la pression du système à 15 000 psi. Après avoir lavé l'homogénéisateur avec 300 à 400 ml d'eau suivis de 200 ml de tampon A RNAP T7, le lysat est recyclé cinq à six fois dans le système tout en maintenant constamment la glace du bécher à serpentin refroidie. Sachez que ces volumes s'appliquent au Microfluidizer ® et peuvent changer avec les différents modèles ou méthodes d'homogénéisation. Pour plus de détails, reportez-vous aux protocoles du fabricant.

10. Centrifuger le lysat à 35 000 × g et 4°C pendant 30 min.

11. Décanter et filtrer le surnageant.

12. Équilibrer une colonne Ni-NTA de 5 ml avec dix CV de tampon A de T4 RNA Ligase 2.

Pour les débits et les limites de pression, utilisez les réglages conformément aux spécifications de la colonne.

13. Chargez la solution de protéines sur la colonne.

14. Laver la colonne avec dix CV de tampon T4 Rnl2 A.

15. Laver la colonne avec dix CV de tampon B T4 Rnl2 à 4 %.

16. Éluer avec un gradient de tampon B T4 Rnl2 (0 % à 100 % en 50 min) et recueillir l'éluat par fractions de 2,5 ml.

17. Exécutez une SDS-PAGE à 12% de toutes les fractions et fractions de pool qui contiennent T4 Rnl2 (42 kDa).

18. Équilibrer une colonne d'exclusion de taille avec 1,1 CV de tampon T4 Rnl2 C.

19. Chargez la solution T4 Rnl2 sur la colonne d'exclusion stérique.

Le volume maximum à charger dépend de la taille et des spécifications de la colonne. Vérifiez les recommandations du fabricant pour assurer une séparation optimale. Si nécessaire, réduisez le volume de la solution enzymatique par concentration centrifuge.

20. Éluer avec 1,1 CV de tampon C T4 Rnl2 et recueillir l'éluat par fractions de 5 ml.

21. Exécutez une SDS-PAGE à 12% de toutes les fractions et sélectionnez les fractions qui contiennent T4 Rnl2.

22. Vérifier les fractions sélectionnées pour la contamination par la RNase en incubant une quantité analytique de chaque fraction avec ∼15 pg d'ARN de choix pendant une nuit à température ambiante ou pendant 4 heures à 37°C. Inclure également un échantillon témoin sans protéine. Vérifiez sur une PAGE dénaturante si l'ARN est toujours intact. La bande d'ARN doit être distincte et nette. Une bande d'ARN étalée ou une fragmentation en ARN plus petits est une indication de la digestion par la RNase. Protéine de pool qui ne montre aucun signe d'activité RNase. Ajuster la concentration à 4 mg/ml à l'aide d'un concentrateur centrifuge.

23. Ajouter 50 % de glycérol pour une concentration finale du stock de 2,0 mg/ml.

24. Aliquoter et conserver l'enzyme T4 Rnl2 à -20°C.

Expériences de RMN à détection hétéronucléaire pour l'ARN

Les protocoles suivants décrivent la mise en œuvre de plusieurs expériences de RMN détectées au 13 C et au 15 N pour l'ARN. Celles-ci incluent des expériences pour l'attribution de déplacement chimique des atomes 1 H et 13 C du cycle ribose, l'expérience HSQC du filtre CN-spin pour l'imino et le C(N)H-HDQC ainsi que le "amino"-NOESY pour les groupes amino. La sélection est complétée par un protocole d'exécution de l'expérience BEST-TROSY détectée 15 N. Pour toutes les expériences, des ensembles de paramètres Topspin sont fournis, qui ont été générés à 600 MHz et doivent être adaptés à l'aide de la commande « paracon » sur le spectromètre respectif. Notez également que les séquences d'impulsions fournies ne sont pas nécessairement compatibles avec la commande « getprosol ».

7 : CONFIGURATION DU SPECTROMÈTRE RMN POUR LES EXPÉRIENCES RMN HÉTERONUCLÉAIRES DÉTECTÉES

Ce protocole de support décrit la procédure générale, qui doit être menée à l'avance chaque fois que l'acquisition d'expériences de RMN détectées par hétéronucléaires est prévue. Par conséquent, il doit être appliqué avant que les expériences décrites dans les protocoles de base 3 à 7 soient menées.

Matériaux

  • Échantillon d'ARN ≥0,5 mM (300 l) d'intérêt (voir Protocoles de base 1 et 2 Protocoles alternatifs 1 et 2)
  • Spectromètre RMN (équipé de préférence d'un z-axe gradient 13 C, sonde cryogénique 15 N [ 1 H]-TXO alternativement, une z-axe gradient 1 H, [ 13 C, 15 N]-sonde cryogénique TCI)

1. Réglez le spectromètre RMN à la température souhaitée, équipez le tube RMN d'une centrifugeuse, placez l'échantillon RMN dans le spectromètre et laissez-le s'équilibrer pendant ∼10 min.

Nous menons généralement des expériences de RMN avec détection hétéronucléaire à 298 K.

2. Effectuez les étapes suivantes afin de configurer le spectromètre RMN.

  1. Verrouillage : Verrouillez la fréquence du spectromètre sur 95 % H2O et 5% D2O ou 100 % D2O en fonction du solvant de votre échantillon RMN.
  2. Réglage et correspondance : tous les canaux doivent être réglés et adaptés du rapport gyromagnétique élevé au faible pour les sondes recommandées dans ce protocole (1 H, 13 C, 2 H, 15 N). Revérifiez tous les canaux si les ajustements nécessaires étaient importants. Pour une sensibilité optimale, la syntonisation et l'adaptation doivent être sur le point pour le canal, où la détection directe a lieu (généralement 13 C).
  3. Calage : importez un fichier de calage récent, qui correspond aux conditions de votre échantillon, y compris le type de tube RMN, la concentration en sel et la température. Effectuez un calage automatique jusqu'à ce que la qualité de la cale soit considérée comme bonne (largeur de ligne de, par exemple, DSS ∼1 Hz).

Nous déterminons généralement l'impulsion 1 H automatiquement ou dans une simple expérience 1D à une impulsion en effectuant une impulsion à 360 ° et en faisant varier la longueur d'impulsion jusqu'à ce que le signal restant soit au passage par zéro. Réglez la fréquence porteuse 1 H sur la résonance de l'eau (4,7 ppm).

Déterminez les impulsions de 13 C et 15 N 90° et réglez la fréquence porteuse en résonance.

La détermination de la longueur d'impulsion correcte à 90° pour 13 C et 15 N est basée sur SOFAST HMQC (Schanda & Brutscher, 2005). Lire le jeu de paramètres pulse_calib13C avec la séquence d'impulsions decp90_sfhmqc.ric ( 13 C) ou le jeu de paramètres pulse_calib15N avec la séquence d'impulsions decp90f3_sfhmqc.ric ( 15 N). Les deux séquences sont modifiées à partir de la bibliothèque d'impulsions Bruker. Entrez l'impulsion 1 H 90° précédemment déterminée et une impulsion par défaut pour 13 C/15 N. Réglez la constante 11 (cnst11) sur 1 et enregistrez l'expérience avec un nombre approprié de transitoires (par exemple, 8). Le traitement devrait vous donner un spectre 1D avec signal. Réglez l'ordre de correction de phase 0 manuellement ou avec la commande apk0. Cette valeur ne doit pas être modifiée au cours de la procédure d'étalonnage ultérieure. Réglez cnst11 sur 2 et répétez l'expérience. Ici, tous les signaux doivent être au point de passage à zéro. Modifiez la durée de l'impulsion 13 C/15 N 90° jusqu'à ce que le signal restant soit minimal. Avec un matériel plus récent (Bruker AVIII et supérieur), ces impulsions de noyaux X de découpleur, déterminées par la méthode décrite ci-dessus, peuvent être transférées vers le canal d'observation. Pour le matériel plus ancien, l'impulsion à 90 ° doit être vérifiée dans des expériences 13 C/15 N 1D. L'impulsion de forme peut également être calculée à partir de ces valeurs, soit directement dans la séquence d'impulsions, soit via la table PROSOL (voir manuel Bruker).

3. Vérifiez la qualité de votre échantillon RMN et de la cale en enregistrant des expériences de référence comme les expériences 1 H-1D et 13 C/15 N-HSQC.

8 : IPAP ET DIPAP POUR DÉCOUPLAGE HOMONUCLÉAIRE

Comme d'habitude, les ARN marqués au 13 C de manière uniforme sont utilisés pour les expériences de RMN détectées directement sur le carbone, les méthodes de découplage homonucléaire 1 JCC des couplages scalaires sont nécessaires. Ceci peut être réalisé en utilisant des schémas anti-phase en phase (IPAP Hammarstroem & Otting, 1994 Ottiger, Delaglio, & Bax, 1998 ) ou S3E (Meissner, Duus, & Sørensen, 1997 ) ainsi que des séquences de découplage sélectif pendant l'acquisition ou le maximum. reconstruction d'entropie (Hoch, Stern, & Mobli, 2011 Serber et al., 2000). Comme nous travaillons habituellement avec des séquences IPAP et double IPAP (DIPAP), nous décrirons la procédure générale sur la façon de les configurer dans le protocole suivant. Ce protocole de support est donc pertinent pour les protocoles de base 3-6.

Matériaux

  • Échantillon d'ARN ≥0,5 mM (300 l) d'intérêt (voir Protocoles de base 1 et 2 Protocoles alternatifs 1 et 2)
  • Spectromètre RMN équipé de préférence d'un z-axe gradient 13 C, sonde cryogénique 15 N [ 1 H]-TXO alternativement, une z-axe gradient 1 H, [ 13 C, 15 N]-sonde cryogénique TCI
  1. Une/deux séquences (IPAP/DIPAP) pour le découplage homonucléaire sont-elles nécessaires ? Cela dépend du nombre d'atomes de carbone qui doivent être découplés et si leurs déplacements chimiques et leurs constantes de couplage sont différents les uns des autres. Pour un aperçu, voir Fiala & Sklenár, 2007 .
  2. Quelle est la taille du 1 JCC constantes de couplage (Fiala & Sklenár, 2007 ) ?

Quel est le déplacement chimique du noyau de carbone qui est détecté ( 13 Cau) et quel(s) est/sont le(s) déplacement(s) chimique(s) de(s) qui est/sont découplé(s) ( 13 Cdésactivé/ 13Cdésactivé Fiala & Sklenár, 2007 ) ?

Sur la base de ces informations, les paramètres IPAP seront déterminés à l'étape 4.

2. Si ce n'est pas déjà le cas, inclure la séquence IPAP/DIPAP dans la séquence d'impulsions d'intérêt soit pendant la dernière étape de rehaussement des noyaux insensibles par transfert de polarisation (INEPT) (IPAP, Fig. 16A DIPAP, Fig. 16C) ou en tant qu'élément séparé .

3. Configurez le spectromètre RMN conformément au protocole d'assistance 7.

4. Choisissez les formes d'impulsion, les fréquences porteuses et la durée d'impulsion pour les impulsions de carbone en et hors résonance. Ces paramètres sont résumés dans le tableau 13 (IPAP) et le tableau 14 (DIPAP) pour tous les atomes de carbone possibles dans l'ARN.

Notez que les longueurs d'impulsion et les décalages doivent être ajustés en fonction de l'intensité du champ magnétique, lors de la mesure à une intensité de champ différente de 800 MHz.

Les longueurs d'impulsion, les formes, les décalages et le temps IPAP T ont été tirés des références bibliographiques répertoriées ci-dessous. Tous les paramètres sont calculés pour un spectromètre RMN 800 MHz.


Évaluation de 15 expériences de corrélation H-N détectées par N sur des ARN de plus en plus gros

Récemment, 15 expériences de RMN multidimensionnelles détectées par N ont été introduites pour l'étude des protéines. L'utilisation de la relaxation transversale lente des noyaux d'azote dans une expérience 15 N-TROSY a permis d'enregistrer des spectres de haute qualité pour des protéines de poids moléculaire élevé, même en l'absence de deutération. Ici, nous démontrons l'applicabilité de trois expériences de corrélation H-N détectées 15 N (TROSY, BEST-TROSY et HSQC) à l'ARN. Avec la nouvelle expérience BEST-TROSY 15 N détectée, qui s'avère être l'expérience de corrélation H-N détectée 15 N la plus sensible, des spectres pour cinq molécules d'ARN allant de 5 à 100 kDa ont été enregistrés. Ces spectres ont donné une haute résolution dans la dimension 15 N même pour des ARN plus grands puisque l'augmentation de la largeur de ligne avec le poids moléculaire est plus prononcée dans la dimension 1 H que dans la dimension 15 N. De plus, nous avons pu valider expérimentalement la différence de comportement de relaxation des groupes imino dans les paires de bases AU et GC. De plus, nous avons montré que 15 expériences détectées par N devraient théoriquement bénéficier d'avantages de sensibilité et de résolution à des champs statiques plus élevés, mais que ce dernier est obscurci par la dynamique d'échange au sein des ARN.

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Matériaux et méthodes

Résoudre les différentes sources d'ambiguïté

Pour résoudre la première source d'ambiguïté, nous proposons une nouvelle méthode inspirée de [18] qui fonctionne sur l'annotation de lecture. En bref, notre méthode scanne tous les hits d'une lecture donnée. Si tous les hits appartiennent à la même classe d'annotation et/ou certains d'entre eux sont orphelins d'annotation, la lecture est annotée en conséquence. Sinon, la lecture est déclarée ambiguë et toutes les annotations associées sont fournies. Cette méthode a plusieurs avantages:

  • c'est moins biaisé,
  • il utilise toutes les lectures,
  • étant donné que des annotations ambiguës sont signalées, les loci connexes peuvent être inspectés,
  • il utilise tous les coups.

La deuxième source d'ambiguïté survient généralement lorsque différentes classes d'annotations se chevauchent. Dans ce cas, notre stratégie consiste à ordonner les types d'annotation. Par exemple, les utilisateurs peuvent décider que les miARN ont un rang plus élevé que les introns, et ainsi cette ambiguïté est résolue. En revanche, si les miARN et une autre classe comme les snoARN ont le même rang et qu'une lecture chevauche les deux, la lecture sera déclarée ambiguë.

Pour résoudre la dernière source d'ambiguïté, lorsqu'une lecture chevauche plusieurs annotations, l'utilisateur peut fournir un seuil de chevauchement, exprimé en nombre de nucléotides ou en pourcentage de la taille de la lecture. Si la taille du chevauchement est inférieure au seuil, l'annotation n'est pas prise en compte. Si plusieurs annotations peuvent encore être affectées à la lecture, la lecture est déclarée ambiguë, comme précédemment.

Stratégie d'annotation

mmannot nécessite trois fichiers d'entrée, et procède en trois étapes principales (voir Fig 9) :

  • Tout d'abord, mmannot analyse un fichier de configuration.
  • Deuxièmement, mmannot analyse le fichier d'annotation (fourni par l'utilisateur) et stocke l'annotation en mémoire.
  • Troisièmement, mmannot lit le fichier lu et annote chaque lecture.

Notez que certaines annotations sont manquantes dans un fichier d'annotation standard : les introns et les régions proximales ne sont généralement pas mentionnés, car ils peuvent être déduits des annotations fournies. À cette fin, mmannot extrait automatiquement les introns des entités sélectionnées par les utilisateurs et les ajoute dans l'ensemble de données d'annotation en mémoire (en laissant le fichier d'entrée inchangé). De même, les séquences codantes (CDS), les régions non traduites 5' et 3' (UTR), les régions en aval et en amont des annotations (la taille des régions en aval et en amont est définie par l'utilisateur) peuvent être extraites. L'utilisateur peut également spécifier une orientation de brin de la lecture par rapport à l'annotation (collinéaire ou antisens). De cette façon, les régions introniques, sens, antisens, en aval et en amont peuvent également être quantifiées. La figure 9A présente un fichier GTF simple, qui contient un gène codant et cinq miARN. Le champ source (le deuxième champ) n'est pas fourni et le champ d'entité donne le type d'annotation.

(UNE) Fichier GTF simple, qui contient un gène codant et cinq miARN. (B) Extrait d'un fichier de configuration mmannot. (C) Localisation génomique de l'annotation et des lectures (pour des raisons d'espace, la figure n'est pas à l'échelle). (RÉ) Lire les annotations. (E) Quantification. (F) Quantification des caractéristiques.

Un fichier de configuration (Fig 9B) est également nécessaire pour sélectionner les annotations à quantifier. La première section, Introns , fournit la liste des caractéristiques où les introns seront extraits. Ici, un gène est automatiquement reconstruit à partir du fichier GTF, où la caractéristique est exon . La section suivante, Vicinity , fournit la liste des entités où les régions en amont et en aval seront extraites. Les UTR 5' et 3' du gène sont également automatiquement déduits. La dernière section, Order , fournit les fonctionnalités qui seront quantifiées. Les deux points (:) sont le séparateur entre le champ source (c'est à dire. les deuxièmes colonnes du fichier GTF) et le champ de fonctionnalité (la troisième colonne du fichier GTF). .:CDS signifie donc source. et fonctionnalité CDS. Par conséquent, si la ligne .:CDS est fournie dans la section Order, mmannot comptera le nombre de lectures qui co-localisent avec toutes les annotations avec la fonctionnalité CDS présentes dans le fichier d'annotation. Si une entité est suivie du signe plus ( + ), comme .:CDS + , mmannot ne comptera que les lectures colinéaires avec l'annotation. Dans ce contexte, une lecture dans le brin plus chevauchant un CDS dans le brin moins ne serait pas utilisée pour la quantification. Si une caractéristique est suivie du signe moins ( - ), mmannot ne comptera que les lectures qui sont antisens par rapport à l'annotation. Les annotations sont ordonnées par priorité, de sorte que CDS + soit avant l'intron dans l'exemple donné sur la figure 9B. Cependant, comme CDS+ et 5'UTR sont sur la même ligne, ils ont la même priorité.

L'annotation de lecture se déroule en deux étapes. La première étape vise à trouver les annotations correspondantes d'un hit donné (Fig 9C). Si un hit correspond à plusieurs annotations différentes, l'annotation avec la priorité la plus élevée est conservée (par exemple, lire C dans l'exemple). Si plusieurs annotations ont la même priorité, alors toutes sont conservées et le hit est déjà ambigu (lire E dans l'exemple). Dans l'exemple, les annotations liées au gène sont fournies en nuances de vert et de noir. Les miARN sont en rouge et les lectures, en jaune, sont étiquetées A à G. Notez que les lectures D, F et G apparaissent deux fois, car elles peuvent être mappées à deux emplacements différents. Les lectures sont censées être bloquées et la flèche indique le brin.

La deuxième étape résout les ambiguïtés et annote chaque lecture. La méthode générale est :

  • Si une lecture mappe de manière unique, sans ambiguïté, le compte de l'annotation correspondante est incrémenté.
  • Si une lecture correspond à des emplacements différents, mais que tous les résultats correspondent à la même annotation, la lecture est déclarée sauvé, et le nombre d'annotations correspondant est également incrémenté (lire D). De même, si une lecture ne mappe qu'une annotation et des régions intergéniques, alors la lecture appartient à cette annotation, et la lecture est sauvée.
  • Si la lecture ou un hit chevauche plusieurs annotations, les annotations avec la priorité la plus élevée sont conservées. Cependant, s'il n'y a qu'une seule annotation avec la priorité la plus élevée, la lecture ou le hit n'est pas ambigu.
  • Sinon, il y a une ambiguïté. Un nouveau type d'annotation, appelé annotation fusionnée, est créé. C'est la concaténation des annotations correspondantes (comme suggéré dans [18]), et son compte est incrémenté.

La table d'annotation (Fig 9D) peut être fournie par mmannot.

Dans l'exemple, la lecture A ne mappe qu'une région, qui ne chevauche que la région amont du gène. Elle peut donc être attribuée sans ambiguïté à cette caractéristique. La lecture B chevauche de manière unique le CDS du gène. Cependant, la lecture est dans le brin - et le gène est sur le brin +. Le fichier de configuration spécifie que seules les lectures colinéaires doivent être attribuées au CDS et que ce cas ne peut donc pas s'appliquer. Cependant, la ligne gene - du fichier de configuration se qualifie et la lecture est attribuée à cette fonctionnalité. Le C lu est mappé de manière unique sur un miARN et un intron. Étant donné que le miARN a une priorité plus élevée, la lecture est attribuée à cette fonctionnalité. Les cartes de lecture D à deux emplacements différents, mais ces deux emplacements chevauchent un miARN. La lecture peut toujours être attribuée à un miARN, et mmannot mentionne que cette lecture a été sauvé. Read E chevauche un CDS et un miARN, et ces annotations ont la même priorité. L'ambiguïté ne peut pas être résolue, et nous attribuons E au CDS (+)-miARN . Lisez les cartes F à deux endroits différents. Le premier emplacement chevauche le 3'UTR, tandis que le deuxième emplacement chevauche un miARN. Encore une fois, l'ambiguïté ne peut pas être résolue, et nous attribuons F à 3'UTR (+)-miRNA . Enfin, G chevauche la 5'UTR et une région intergénique. Dans ce cas, nous affectons G à 5'UTR et nous déclarons la lecture sauvée.

Après avoir scanné toutes les lectures, la table de quantification est produite (Fig 9E).

La table de quantification des caractéristiques (Fig 9F) peut également être fournie par mmannot. Il compte le nombre de lectures par fonctionnalité (éventuellement fusionnée). Ici, l'utilisateur peut mettre en évidence qu'il peut y avoir une certaine interaction entre le miARN E et le 3'UTR, et une éventuelle incohérence entre les annotations du CDS et du miARN B.

Détails de la mise en œuvre

L'algorithme utilisé par mmannot est le suivant. mmannot analyse le fichier d'annotation, extrait les intervalles d'annotation, les trie et les stocke dans des bacs qui ne se chevauchent pas. mmannot lit ensuite le fichier de lecture mappé, extrait les casiers qui se chevauchent éventuellement et compare les annotations associées avec la lecture. Les annotations correspondantes d'une lecture donnée sont conservées en mémoire. Lorsque le dernier hit est analysé, le nombre d'annotations (éventuellement fusionnées) est augmenté et les informations lues sont supprimées de la mémoire. En pratique, la recherche est approximativement linéaire par rapport au nombre de lectures. mmannot peut s'exécuter sur un ordinateur standard et chaque fichier SAM/BAM peut être analysé par un thread dédié.

mmannot suppose soit que la balise NH du fichier de lecture mappé SAM/BAM d'entrée fournit le nombre de hits par lecture, soit que les hits alternatifs sont donnés dans la balise XA. Malheureusement, certains outils de cartographie largement utilisés tels que le nœud papillon [6] utilisent une ligne par coup et ne définissent pas la balise NH. Nous fournissons un outil compagnon qui lit le fichier de sortie SAM du nœud papillon et ajoute la balise NH correcte. mmannot peut produire trois fichiers de sortie différents.

Le premier fichier est la table de comptage, qui inclut les annotations fusionnées. Le deuxième fichier (facultatif) fournit la quantification de toutes les annotations (Fig 9F). Ce fichier fournit des informations détaillées sur les entités fusionnées et permet d'étudier les interactions possibles entre les entités ou de corriger l'annotation. Le troisième fichier (facultatif) donne les annotations correspondantes de chaque lecture (Fig 9D). Ce fichier permet d'inspecter manuellement toutes les lectures qui prennent en charge une fonctionnalité fusionnée.

Données utilisées

Nous avons utilisé des ensembles de données publiés, couvrant plusieurs organismes eucaryotes, où les articles connexes ont fourni une quantification de l'expression des classes d'ARNs. Le tableau 2 résume les données utilisées.


Afficher les commentaires des réviseurs pour le manuscrit

Valériane Dolja (Reviewer 1)

Terme de recommandation de l'examinateur : approuver la publication

Ce manuscrit est utile pour attirer l'attention sur le problème mal étudié de l'origine des viroïdes, mais fournit un soutien insuffisant au concept de descendance directe des viroïdes du monde ARN primordial. Je soutiens pleinement les efforts du Dr Diener pour revitaliser la discussion sur les origines des viroïdes, les plus petits réplicons connus qui ne codent aucune protéine et possèdent une activité de ribozyme, récapitulant ainsi deux caractéristiques des réplicons primordiaux postulés du monde de l'ARN. Il convient de souligner, cependant, que les viroïdes existants, ainsi que l'agent delta de l'hépatite, manquent d'une caractéristique encore plus critique, c'est-à-dire la capacité à s'auto-répliquer, s'appuyant plutôt sur des protéines polymérases fournies par l'hôte. Mes autres réserves majeures concernant l'hypothèse de la descendance directe du viroïde du monde de l'ARN sont les suivantes. Premièrement, à notre connaissance, les agents parasites de type viroïde ne se trouvent que dans deux types d'organismes, les plantes supérieures (angiospermes) et les vertébrés, mais dans aucun de leurs ancêtres présumés, les algues et les animaux plus primitifs, respectivement. De plus, il n'y a pas de données sur de tels agents dans une grande variété d'eucaryotes unicellulaires dont l'histoire évolutive précède celle des plantes ou des animaux de centaines de millions d'années. Pire encore, aucun agent de type viroïde n'a été signalé chez aucun des procaryotes, qu'il s'agisse d'archées ou de bactéries qui existaient bien avant l'émergence des eucaryotes. Ainsi, selon l'hypothèse de l'auteur, les ancêtres viroïdes primordiaux auraient dû suivre un chemin évolutif très étroit menant directement aux plantes terrestres, mais étant éliminés d'autres organismes, même ceux que l'on croyait être des ancêtres directs des plantes, comme les algues characéennes. À mon avis, une hypothèse permettant l'origine de novo des viroïdes dans les plantes supérieures, peut-être, via la recombinaison entre un ARN cellulaire préexistant possédant un ribozyme avec un ARN qui dotait le produit d'un signal de reconnaissance d'ARN polymérase ADN-dépendant, semble être un scénario plus simple et donc plus plausible. Cela ne veut pas dire que l'idée originale du Dr Diener selon laquelle les viroïdes, en tant que plus petits réplicons autonomes connus, rappellent le plus les réplicons du monde de l'ARN n'est pas valable, et c'est tout à fait vrai. Je n'aime pas tellement l'hypothèse 2 pour une raison simple : les données, à l'appui de l'hypothèse 2, ne sont pas encore évaluées par des pairs, publiées ou confirmées de manière indépendante. Il semble prématuré d'utiliser ces données jusqu'à ce que cela se produise. En conclusion, je suis favorable à la publication de ce manuscrit car le problème de l'origine des viroïdes est extrêmement important et largement sous-étudié. Les hypothèses de l'auteur élargissent la discussion et, espérons-le, pourraient stimuler la recherche expérimentale pertinente.

Réponse à l'examen de mon manuscrit par le Dr Dolja

Je tiens à remercier le Dr Dolja pour son examen critique réfléchi et constructif, ainsi que pour ses excellentes suggestions pour améliorer le manuscrit. Son idée de créer une hypothèse alternative à l'origine de l'ARN primordial du viroïde-hypothèse, en permettant l'origine de novo des viroïdes dans les plantes supérieures via la recombinaison d'un ARN préexistant, cellulaire, possédant des ribozymes, avec un qui dotait le produit d'ADN- signaux de reconnaissance dépendants de l'ARN polymérase - promet d'être une solution sur mesure au grave dilemme de la descente des viroïdes. Il en resterait pourtant. une explication plausible, pourquoi les viroïdes créés de novo ressemblent «de manière frappante» à leurs caractéristiques de type ARN primordial, qui seraient désormais dépourvues de signification fonctionnelle.

Le Dr Dolja a tout à fait raison : les données préliminaires, ainsi que l'hypothèse 2 dans son ensemble ne sont pas adaptées à la publication. J'ai supprimé les deux, y compris la mention des données non publiées.


Conclusion

À l'aide d'une technologie de séquençage de nouvelle génération, nous avons effectué le transcriptome de miARN et le profilage du transcriptome de deux maniocs cultivés et de leur progéniteur sauvage. Un total de 107 miARN conservés (29 familles) et 39 nouveaux miARN (33 familles) ont été identifiés, et la plupart des miARN étaient fortement exprimés dans les cultivars. Sur les 360 unigènes qui devraient être les cibles de 53 familles de miARN de manioc, 14 unigènes ont été confirmés. De plus, une analyse de co-expression entre les miARN et leurs cibles a été réalisée sur la base du transcriptome des miARN et du profilage du transcriptome des feuilles et des racines de stockage. Les niveaux d'expression de 28 cibles étaient négativement corrélés avec ceux de leurs miARN correspondants. En conclusion, l'expression différentielle des miARN entre les cultivars et leur géniteur sauvage, ainsi que notre analyse de l'annotation GO et la confirmation des paires miARN:cible, pourraient donner un aperçu de la façon dont le géniteur sauvage a été domestiqué au manioc cultivé.


Références clés

Kobori, S. Nomura, Y. Miu, A. Yokobayashi, Y. Dosage à haut débit et ingénierie des ribozymes auto-clivants par séquençage. Acides nucléiques Res. 2015 , 43, e85. (1) Un séquençage à haut débit a été utilisé pour doser en parallèle >1000 des mutants de ribozymes auto-clivants pour analyser un contact tertiaire dans un ribozyme twister et pour identifier des ribozymes allostériques.

Kobori, S. Yokobayashi, Y. Analyse mutationnelle à haut débit d'un ribozyme twister. Angew. Chem., Int. Éd. 2016 , 55, 10354-10357. (2) Une analyse mutationnelle complète de tous les mutants simples et doubles dans une région de 42 nt d'un ribozyme twister a été réalisée, élucider les interactions base-base pertinentes sur le plan fonctionnel.

Dhamodharan, V. Kobori, S. Yokobayashi, Y. Analyse mutationnelle et cinétique à grande échelle d'un désoxyribozyme auto-hydrolysant. ACS Chem. Biol. 2017 , 12, 2940-2945.(3) Un essai cinétique parallèle de mutants de désoxyribozyme auto-clivants a donné un aperçu quantitatif des effets non linéaires de multiples mutations.

Nomura, Y. Yokobayashi, Y. Minimisation systématique du ribozyme d'ARN ligase à travers des cycles de conception-synthèse-séquence à grande échelle. Acides nucléiques Res. 2019 , 47, 8950-8960.(4) Le séquençage à haut débit et la synthèse de pool d'oligomères ont été utilisés pour explorer le noyau catalytique minimal d'un ribozyme d'ARN ligase.


Renseignements à l'appui

S1 Fig. Couverture de séquençage clairsemée sur CCDC168.

Tracé IGV des lectures aligné sur le CCDC168 locus pour l'échantillon TCGA-D7-6518 dans STAD. Après filtrage, seulement 12 lectures s'alignent sur le gène, et c'est le nombre médian pour les échantillons dans STAD. Pour référence, les loci d'instabilité des microsatellites (MSI) précédemment identifiés dans TCGA [6] sont également présentés dans la deuxième piste. Les quelques lectures alignées sur CCDC168 dans cet échantillon ne se chevauchent pas bien avec les loci MSI.

S2 Fig. Des cohortes entières avec une couverture insuffisante.

La cohorte STAD (A) n'avait pas d'échantillons avec une couverture suffisante de la CCDC168 lieu. D'autres gènes partagent ce même comportement, à savoir SETD1B, et SOX11 dans la cohorte PRAD (B), et MALAT1 et XIST dans la cohorte LIHC (C).

S3 Fig. Gènes sous-couverts probablement en raison de la conception du protocole de capture de l'exome.

Le kit de capture d'exome VCRome ne contient pas de sondes pour les loci contenant MALAT1 (A) et XIST (B), correspondant à la faible profondeur des échantillons utilisant le kit. Au contraire, le kit VCRome contient des sondes pour CCDC168 (C) qui a des lectures dans les échantillons utilisant ce kit.

S4 Fig.

ACVR2A (A), un loci MSI d'adénocarcinome de l'estomac précédemment identifié, semble avoir une couverture raisonnable de la région MSI (troisième piste) dans deux échantillons TCGA-STAD. SMAP1 (B) et SPINK5 (C) sont des loci MSI associés à l'adénocarcinome colorectal mais pas à l'adénocarcinome de l'estomac. Les échantillons TCGA-STAD semblent avoir une faible couverture des loci SMAP1 MSI tandis que le SPINK5 semble avoir une couverture beaucoup plus élevée des loci MSI.

S5 Fig. Les approches d'alignement standard TCGA gèrent correctement les loci d'instabilité des microsatellites pour l'appel SNV/indel.

L'étape de co-nettoyage du pipeline Genomic Data Commons qui intègre un réalignement local autour des indels résout ce problème. Par exemple, nous avons effectué l'alignement BWA des lectures sur les loci d'instabilité des microsatellites dans CCDC168 pour l'échantillon TCGA-COAD TCGA-AD-6889 sans l'étape de co-nettoyage (piste de lecture supérieure). Les lectures sont regroupées en 3 ensembles en fonction de leur nucléotide à un indel connu (barre violette verticale). Le cercle rouge indique un locus avec un support de lecture multiple pour un SNV avant le co-nettoyage. Après le co-nettoyage (piste de lecture inférieure), ces lectures ne prennent plus en charge le statut SNV.


Voir la vidéo: Le séquençage du génome (Août 2022).