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Optimisation de l'électrophorèse sur gel : concentrations en ampères, en volts et en tampon

Optimisation de l'électrophorèse sur gel : concentrations en ampères, en volts et en tampon


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Je suis étudiant à la maîtrise en biochimie et j'ai déjà utilisé plusieurs fois l'électrophorèse sur gel. Ce que je veux savoir, c'est comment ajuster le mA (mAmpère) par rapport à la tension et au tampon que l'on utilise.

Normalement, j'ai utilisé un tampon 1xTAE (à 90 V) ou 1 x tampon de borate de sodium (à 110 V). Je sais que si j'ajuste la tension, le tampon chauffe plus vite, les échantillons voyagent plus vite, mais l'"image" du gel devient plus floue. C'est cependant tout ce que je sais sur l'ajustement du paramètre.

Mes questions peuvent donc se résumer comme suit :

  1. Comment dois-je régler l'ampère, y a-t-il une plage dans laquelle je devrais être par rapport au tampon ou à l'échantillon que j'exécute ?

  2. L'ampère affecte-t-il la vitesse de déplacement s'il est ajusté vers le haut ou vers le bas ?

  3. Puis-je ajuster la concentration du tampon pour analyser l'échantillon à une tension plus élevée, quels effets cela aura-t-il (pour augmenter ou diminuer la concentration) ?

  4. Y a-t-il une relation entre l'ampère et la tension que je peux manipuler, dans ce cas : comment et pourquoi ?


  1. Pour autant que je sache, vous pouvez régler l'ampère ou la tension, car les deux dépendent de la résistance du tampon. Ce qui signifie que je vous suggère de laisser la tension telle quelle.

  2. Comme l'ampère = tension / résistance et tension = résistance * ampère et comme vous pouvez le voir, la tension doit augmenter si l'ampère est augmenté et l'ampère doit augmenter si la tension est augmentée (du moins si je comprends bien ) la vitesse de déplacement doit être augmentée plus l'ampère est réglé.

  3. Je ne diminuerais ni n'augmenterais la concentration du tampon. Peut-être qu'utiliser facilement un autre type de tampon vous aiderait. Mais cela dépend des différents échantillons que vous exécutez. Peut-être que cela pourrait vous aider : Brody, J.R., et Kern, S.E. (2004). Histoire et principes des milieux conducteurs pour l'électrophorèse standard de l'ADN. Biochimie analytique 333, 1-13.

  4. La résistance est plus ou moins donnée. Donc à ma connaissance : Non.


Gels d'agarose et de métaphore

1.Ajouter de l'agarose au tampon 1X TBE (ou TAE). Pour une taille de gel de 20 x 24 cm, utilisez 300-400 ml de tampon et 0,7 à 1,0 % d'agarose.
2. Faire fondre l'agarose dans une fiole de 500 ml au four à micro-ondes en mélangeant plusieurs fois pendant le chauffage. Laisser refroidir à 55 C (jusqu'à ce que le ballon puisse être tenu).
3. Collez les extrémités du plateau de gel et placez-le sur un banc plat.
4. Ajouter du bromure d'éthidium : 2,5 ul de solution mère à 10 mg/ml pour 100 ml. (le gel cam sera également coloré dans un bain de bromure d'éthidium après électrophorèse (voir point 9).

REMARQUE : le bromure d'éthidium est mutagène - portez des gants lors de la manipulation et redoublez de prudence. Changez de gants en cas de contamination et éliminez-les dans des déchets séparés pour le bromure d'éthidium.

5. Versez l'agarose dans le plateau et insérez les peignes. Retirer les bulles avec une pointe de pipette. Laisser se solidifier.
6. Retirez le ruban adhésif et placez le plateau dans des boîtes de gel. Versez suffisamment de tampon 1X TBE (ou TAE) dans la boîte de gel pour couvrir le gel d'au moins 0,5 cm. Retirez les peignes lorsque vous êtes prêt à charger les échantillons.
7. Chargez 1 ug de Lambda digéré avec Hind III (5 ul de 200 ng/ul de stock) comme marqueur de poids moléculaire, puis chargez les échantillons.
8. Faites fonctionner à 15-25 V pendant 12-24 heures.
9. Si aucun bromure d'éthidium n'a été ajouté à l'agarose : colorer le gel dans 1 ug/ml de bromure d'éthidium (100 ul de 10 mg/ml de bromure d'éthidium dans 1000 ml de dd H20) pendant 20 min. 10. Rincer le gel pendant 20 min dans 1000 ml de ddH2O.
11. Faites glisser le gel sur le transilluminateur UV et prenez une photo.
Conseil de photographie :
Placez un petit morceau de papier avec une écriture ou une règle transparente sur le gel pour faciliter la mise au point.

Agarose MetaPhor®
Agarose haute résolution
introduction
L'agarose MetaPhor est un agarose haute résolution qui défie le polyacrylamide. L'agarose MetaPhor est un agarose à température de fusion intermédiaire (75 °C) avec des capacités de résolution deux fois supérieures à celles des produits d'agarose les plus fins. En utilisant l'électrophorèse sous-marine sur gel, vous pouvez résoudre les produits PCR et les petits fragments d'ADN dont la taille diffère de 2 %.

Spécifications analytiques
Température de gélification (3%) = 35°C
Température de fusion (3%) = 75° C
Force du gel (3%) = 300 g/cm²
Applications
• Séparation haute résolution de fragments d'ADN de 20 à 800 pb
• Récupération de fragments inférieurs à 800 pb
• Analyse fine de la PCR ? des produits
• Analyse des répétitions AMPFLP, STR et tri- et tétranucléotidiques

Concentrations suggérées d'agarose

Migration d'ADN double brin en relation avec le bleu de bromophénol (BPB) et le xylène cyanol (XC) dans les gels d'agarose MetaPhor.

Précautions
Portez toujours des lunettes de protection lors de la dissolution de l'agarose et protégez-vous ainsi que les autres contre les solutions brûlantes.

Instructions pour les micro-ondes pour la préparation de l'agarose
1. Choisissez un bécher de 2 à 4 fois le volume de la solution.
2. Ajouter un tampon d'électrophorèse réfrigéré 1X ou 0,5X et une barre d'agitation dans le bécher.
3. Saupoudrer lentement de poudre d'agarose pendant que la solution est rapidement agitée.
4. Retirez le barreau d'agitation s'il n'est pas revêtu de Teflon®.
5. Faire tremper l'agarose dans le tampon pendant 15 minutes avant de chauffer. Cela réduit la tendance de la solution d'agarose à mousser pendant le chauffage.
6. Peser le bécher et la solution avant de chauffer.
7. Couvrir le bécher d'une pellicule plastique.
8. Percez un petit trou dans le film plastique pour la ventilation.

Pour les concentrations d'agarose > 4%, les étapes supplémentaires suivantes aideront davantage à empêcher la solution d'agarose de mousser pendant la fusion/dissolution :
une. Chauffer le bécher au four à micro-ondes à puissance moyenne pendant 1 minute.
b. Retirez la solution du micro-ondes.
c. Laissez la solution reposer sur le banc pendant 15 minutes.

9. Chauffer le bécher au four à micro-ondes à puissance moyenne pendant 2 minutes.
10. Retirez le bécher du four à micro-ondes. Attention : tout micro-ondes
la solution peut devenir surchauffée et mousser lorsqu'elle est agitée.
11. Agiter DOUCEMENT le bécher pour remettre en suspension les morceaux de poudre et de gel déposés.
12. Réchauffez le bécher à puissance ÉLEVÉE jusqu'à ce que la solution arrive à ébullition.
13. Maintenir au point d'ébullition pendant 1 minute ou jusqu'à ce que toutes les particules soient dissoutes.
14. Retirez le bécher du four à micro-ondes.
15. Agiter DOUCEMENT le bécher pour bien mélanger la solution d'agarose.
16. Après dissolution, ajouter suffisamment d'eau distillée chaude pour obtenir le poids initial.
17. Bien mélanger.
18. Refroidir la solution à 50-60°C avant la coulée. Une fois le gel coulé, laissez l'agarose fondu refroidir et gélifier à température ambiante. Le gel doit ensuite être placé à 4°C pendant 20 minutes pour obtenir une résolution optimale et des caractéristiques de manipulation du gel.

Instructions de la plaque chauffante pour la préparation de l'agarose
1 . Choisissez un bécher de 2 à 4 fois le volume de la solution.
2. Ajouter le tampon d'électrophorèse réfrigéré et un barreau d'agitation dans le bécher.
3. Saupoudrer lentement la poudre d'agarose pendant que la solution est rapidement agitée.
4. Peser le bécher et la solution avant de chauffer.
5. Couvrir le bécher d'une pellicule plastique.
6. Percez un petit trou dans le film plastique pour la ventilation.
7. Porter la solution à ébullition tout en remuant.
8. Maintenir une ébullition douce jusqu'à ce que tout l'agarose soit dissous (environ 10 minutes).
9. Ajouter suffisamment d'eau distillée chaude pour obtenir le poids initial.
10. Bien mélanger.
11 . Refroidir la solution à 50-60°C avant la coulée. Une fois le gel coulé, laissez l'agarose fondu refroidir et gélifier à température ambiante. Le gel doit ensuite être placé à 4°C pendant 20 minutes pour obtenir une résolution optimale et des caractéristiques de manipulation du gel.


Comment fonctionne la PFGE ?

L'ECP découle de l'observation que les molécules d'ADN s'allongent lors de l'application d'un champ électrique et reviennent à un état non allongé lors de la suppression du champ électrique, ce taux de relaxation dépend de la taille de l'ADN.

Lorsque l'orientation du champ électrique est modifiée pendant l'électrophorèse, les molécules d'ADN doivent revenir à leur forme allongée avant la réorientation, affectant ainsi la vitesse de migration. Cet effet peut être utilisé pour étendre considérablement la plage de tailles sur laquelle les séparations électrophorétiques d'ADN sont possibles.

Lorsque le champ électrique est appliqué au gel, les molécules d'ADN s'allongent dans la direction du champ électrique. Le premier champ électrique est ensuite commuté sur le deuxième champ selon les spécifications de fonctionnement. L'ADN doit changer de conformation et se réorienter avant de pouvoir migrer en direction de ce champ.

Tant que les champs alternatifs sont égaux en ce qui concerne la tension et la durée d'impulsion, l'ADN migrera en ligne droite le long du gel (voir ci-dessous).

Représentation en accéléré de molécules d'ADN subissant une PFGE.


Contenu

Un certain nombre de facteurs peuvent affecter la migration des acides nucléiques : la dimension des pores du gel, la tension utilisée, la force ionique du tampon et la concentration en colorant intercalant tel que le bromure d'éthidium s'il est utilisé pendant l'électrophorèse. [2]

Taille de l'ADN Modifier

Le gel tamise l'ADN selon la taille de la molécule d'ADN, ce qui permet aux molécules plus petites de se déplacer plus rapidement. L'ADN double brin se déplace à une vitesse approximativement inversement proportionnelle au logarithme du nombre de paires de bases. Cette relation se rompt cependant avec de très gros fragments d'ADN et il n'est pas possible de les séparer en utilisant une électrophorèse standard sur gel d'agarose. La limite de résolution dépend de la composition du gel et de l'intensité du champ. [3] et la mobilité de l'ADN circulaire plus grand peut être plus fortement affectée que l'ADN linéaire par la taille des pores du gel. [4] La séparation de très gros fragments d'ADN nécessite une électrophorèse pulsée sur gel (PFGE). Dans l'électrophorèse sur gel à inversion de champ (FIGE, une sorte de PFGE), il est possible d'avoir une "inversion de bande" - où les grosses molécules peuvent se déplacer plus rapidement que les petites molécules.

Conformation de l'ADN Modifier

La conformation de la molécule d'ADN peut affecter de manière significative le mouvement de l'ADN, par exemple, l'ADN superenroulé se déplace généralement plus rapidement que l'ADN détendu car il est étroitement enroulé et donc plus compact. Dans une préparation d'ADN plasmidique normale, plusieurs formes d'ADN peuvent être présentes [5] et le gel de l'électrophorèse des plasmides montrerait normalement une bande principale qui serait la forme négativement superenroulée, tandis que d'autres formes d'ADN peuvent apparaître comme mineures plus faibles. bandes. Ces bandes mineures peuvent être de l'ADN entaillé (forme circulaire ouverte) et la forme circulaire fermée détendue qui fonctionne normalement plus lentement que l'ADN superenroulé, et la forme simple brin (qui peut parfois apparaître en fonction des méthodes de préparation) peut aller de l'avant de l'ADN superenroulé . La vitesse à laquelle les diverses formes se déplacent peut cependant changer en utilisant différentes conditions d'électrophorèse, par exemple l'ADN linéaire peut fonctionner plus rapidement ou plus lentement que l'ADN superenroulé selon les conditions, [6] et la mobilité de l'ADN circulaire plus grand peut être plus fortement affectée que l'ADN linéaire par la taille des pores du gel. [4] À moins que des marqueurs d'ADN superenroulés ne soient utilisés, la taille d'un plasmide de type ADN circulaire peut donc être évaluée plus précisément après avoir été linéarisée par digestion de restriction.

Les dommages à l'ADN dus à une réticulation accrue réduiront également la migration électrophorétique de l'ADN d'une manière dépendante de la dose. [7] [8]

Concentration de bromure d'éthidium Modifier

L'ADN circulaire est plus fortement affecté par la concentration de bromure d'éthidium que l'ADN linéaire si le bromure d'éthidium est présent dans le gel pendant l'électrophorèse. Tous les cercles d'ADN naturels sont sous-enroulés, mais le bromure d'éthidium qui s'intercale dans l'ADN circulaire peut changer la charge, la longueur, ainsi que la superhélicité de la molécule d'ADN, donc sa présence pendant l'électrophorèse peut affecter son mouvement dans le gel. L'augmentation du bromure d'éthidium intercalé dans l'ADN peut le transformer d'une molécule surenroulée négativement en une forme complètement relâchée, puis en une superhélice enroulée positivement à l'intercalation maximale. [9] L'électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée pour résoudre l'ADN circulaire avec une topologie de superenroulement différente.

Concentration de gel Modifier

La concentration du gel détermine la taille des pores du gel qui affectent la migration de l'ADN. La résolution de l'ADN change avec la concentration en pourcentage du gel. L'augmentation de la concentration d'agarose d'un gel réduit la vitesse de migration et améliore la séparation des molécules d'ADN plus petites, tandis que la diminution de la concentration du gel permet de séparer les grandes molécules d'ADN. Pour une électrophorèse sur gel d'agarose standard, 0,7 % donne une bonne séparation ou résolution de gros fragments d'ADN de 5 à 10 kb, tandis qu'un gel à 2 % donne une bonne résolution pour les petits fragments de 0,2 à 1 kb. Jusqu'à 3% peuvent être utilisés pour séparer de très petits fragments, mais un gel de polyacrylamide vertical serait plus approprié pour séparer de petits fragments. Cependant, les gels à haute concentration nécessitent des temps de traitement plus longs (parfois des jours) et les gels à pourcentage élevé sont souvent cassants et peuvent ne pas prendre uniformément. Les gels d'agarose à haut pourcentage doivent être traités avec PFGE ou FIGE. Les gels à faible pourcentage (0,1 à 0,2 %) sont fragiles et peuvent se briser. Les gels à 1 % sont courants pour de nombreuses applications. [dix]

Champ appliqué Modifier

Aux basses tensions, la vitesse de migration de l'ADN est proportionnelle à la tension appliquée, c'est-à-dire que plus la tension est élevée, plus l'ADN se déplace rapidement. Cependant, en augmentant l'intensité du champ électrique, la mobilité des fragments d'ADN de poids moléculaire élevé augmente de manière différentielle, et la plage efficace de séparation diminue et la résolution est donc plus faible à haute tension. Pour une résolution optimale de l'ADN d'une taille supérieure à 2 kb en électrophorèse sur gel standard, 5 à 8 V/cm sont recommandés. [6] La tension est également limitée par le fait qu'elle chauffe le gel et peut faire fondre le gel si un gel est utilisé à haute tension pendant une période prolongée, en particulier pour le gel d'agarose à bas point de fusion.

La mobilité de l'ADN peut cependant changer dans un champ instable. Dans un champ qui est périodiquement inversé, la mobilité de l'ADN d'une taille particulière peut chuter de manière significative à une fréquence de cycle particulière. [11] Ce phénomène peut entraîner une inversion de bande par laquelle des fragments d'ADN plus gros se déplacent plus rapidement que les plus petits en PFGE.

La charge négative de son squelette phosphate déplace l'ADN vers l'anode chargée positivement pendant l'électrophorèse. Cependant, la migration des molécules d'ADN en solution, en l'absence de matrice de gel, est indépendante du poids moléculaire lors de l'électrophorèse, c'est-à-dire qu'il n'y a pas de séparation par taille sans matrice de gel. [12] L'interaction hydrodynamique entre les différentes parties de l'ADN est interrompue par le flux de contre-ions se déplaçant dans la direction opposée, de sorte qu'aucun mécanisme n'existe pour générer une dépendance de la vitesse à la longueur à une échelle supérieure à la longueur de criblage d'environ 10 nm. [11] Cela le rend différent d'autres processus tels que la sédimentation ou la diffusion où l'interaction hydrodynamique à longue distance est importante.

La matrice de gel est donc responsable de la séparation de l'ADN par taille lors de l'électrophorèse, mais le mécanisme précis responsable de la séparation n'est pas tout à fait clair. Il existe un certain nombre de modèles pour le mécanisme de séparation des biomolécules dans la matrice de gel, un modèle largement accepté est le modèle d'Ogston qui traite la matrice polymère comme un tamis constitué d'un réseau distribué de manière aléatoire de pores interconnectés. [13] Une protéine globulaire ou un ADN hélicoïdal aléatoire se déplace à travers les pores connectés suffisamment grands pour permettre son passage, et le mouvement de molécules plus grosses est plus susceptible d'être entravé et ralenti par des collisions avec la matrice de gel, et les molécules de différents les tailles peuvent donc être séparées dans ce processus de tamisage. [11]

Le modèle d'Ogston se décompose cependant pour les grosses molécules, les pores étant significativement plus petits que la taille de la molécule. Pour les molécules d'ADN de taille supérieure à 1 kb, un modèle de reptation (ou ses variantes) est le plus couramment utilisé. Ce modèle suppose que l'ADN peut ramper à la manière d'un "serpent" (d'où une "reptation") à travers les pores sous la forme d'une molécule allongée. À une intensité de champ électrique plus élevée, cela s'est transformé en un modèle de reptation biaisé, dans lequel l'extrémité avant de la molécule devient fortement biaisée vers l'avant, et ce bord avant entraîne le reste de la molécule. Dans le mode totalement biaisé, la mobilité a atteint un point de saturation et l'ADN au-delà d'une certaine taille ne peut pas être séparé. [13] Un alignement parallèle parfait de la chaîne avec le champ n'est cependant pas observé en pratique car cela signifierait la même mobilité pour les molécules longues et courtes. [11] Un raffinement supplémentaire du modèle de reptation biaisé prend en compte les fluctuations internes de la chaîne. [14]

Le modèle de reptation biaisé a également été utilisé pour expliquer la mobilité de l'ADN en PFGE. L'orientation de l'ADN est progressivement construite par reptation après l'apparition d'un champ, et le moment où il a atteint la vitesse d'équilibre dépend de la taille de la molécule. Lorsque le champ est modifié, les molécules plus grosses mettent plus de temps à se réorienter, il est donc possible de discriminer les longues chaînes qui ne peuvent pas atteindre sa vitesse en régime permanent des courtes qui se déplacent la plupart du temps en vitesse stationnaire. [14] D'autres modèles existent cependant également.

La microscopie à fluorescence en temps réel des molécules colorées a montré une dynamique plus subtile pendant l'électrophorèse, l'ADN montrant une élasticité considérable car il s'étire alternativement dans la direction du champ appliqué puis se contracte en boule, ou devient accroché en forme de U lorsqu'il obtient accrochés aux fibres polymères. [15] [16] Cette observation peut être appelée le modèle « chenille ». [17] Un autre modèle propose que l'ADN s'enchevêtre dans la matrice polymère, et plus la molécule est grosse, plus elle est susceptible de s'enchevêtrer et son mouvement entravé. [18]

Le colorant le plus couramment utilisé pour rendre les bandes d'ADN ou d'ARN visibles pour l'électrophorèse sur gel d'agarose est le bromure d'éthidium, généralement abrégé en EtBr. Il émet une fluorescence sous la lumière UV lorsqu'il est intercalé dans le sillon principal de l'ADN (ou de l'ARN). En faisant passer l'ADN à travers un gel traité à l'EtBr et en le visualisant à la lumière UV, toute bande contenant plus de

20 ng d'ADN deviennent distinctement visibles. EtBr est un mutagène connu, [19] et des alternatives plus sûres sont disponibles, telles que GelRed, produit par Biotium, qui se lie au petit sillon. [20]

SYBR Green I est une autre coloration d'ADNdb, produite par Invitrogen. Il est plus cher, mais 25 fois plus sensible et peut-être plus sûr que l'EtBr, bien qu'il n'y ait aucune donnée concernant sa mutagénicité ou sa toxicité chez l'homme. [21]

SYBR Safe est une variante de SYBR Green qui s'est avérée avoir des niveaux de mutagénicité et de toxicité suffisamment bas pour être considéré comme un déchet non dangereux en vertu de la réglementation fédérale américaine. [22] Il a des niveaux de sensibilité similaires à EtBr, [22] mais, comme SYBR Green, est nettement plus cher. Dans les pays où l'élimination sûre des déchets dangereux est obligatoire, les coûts d'élimination de l'EtBr peuvent toutefois facilement dépasser la différence de prix initiale.

Étant donné que l'ADN coloré à l'EtBr n'est pas visible à la lumière naturelle, les scientifiques mélangent l'ADN avec de l'ADN chargé négativement. chargement des tampons avant d'ajouter le mélange au gel. Les tampons de chargement sont utiles car ils sont visibles à la lumière naturelle (par opposition à la lumière UV pour l'ADN coloré à l'EtBr) et ils se sédimentent avec l'ADN (ce qui signifie qu'ils se déplacent à la même vitesse que l'ADN d'une certaine longueur). Le xylène cyanol et le bleu de bromophénol sont des colorants courants que l'on trouve dans les tampons de chargement. Ils fonctionnent à peu près à la même vitesse que les fragments d'ADN d'une longueur respective de 5 000 pb et 300 pb, mais la position précise varie en fonction du pourcentage du gel. D'autres marqueurs de progression moins fréquemment utilisés sont le rouge de crésol et l'orange G qui tournent à environ 125 pb et 50 pb, respectivement.

La visualisation peut également être réalisée en transférant l'ADN après SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose suivie d'une exposition à une sonde d'hybridation. Ce processus est appelé transfert de Southern.

Pour les colorants fluorescents, après électrophorèse, le gel est illuminé avec une lampe ultraviolette (généralement en le plaçant sur une boîte à lumière, tout en utilisant un équipement de protection pour limiter l'exposition aux rayons ultraviolets). L'appareil d'éclairage contient également la plupart du temps un appareil d'imagerie qui prend une image du gel, après illumination avec un rayonnement UV. Le bromure d'éthidium émet une fluorescence rouge-orange en présence d'ADN, car il s'est intercalé avec l'ADN. La bande d'ADN peut également être découpée dans le gel, puis dissoute pour récupérer l'ADN purifié. Le gel peut ensuite être photographié généralement avec un appareil photo numérique ou polaroïd. Bien que l'acide nucléique coloré émet une fluorescence rouge-orange, les images sont généralement affichées en noir et blanc (voir les figures). Les dommages causés par les UV à l'échantillon d'ADN peuvent réduire l'efficacité de la manipulation ultérieure de l'échantillon, telle que la ligature et le clonage. Les rayonnements UV de longueur d'onde plus courte (302 ou 312 nm) causent des dommages plus importants, par exemple une exposition aussi courte que 45 secondes peut réduire considérablement l'efficacité de la transformation. Par conséquent, si l'ADN doit être utilisé pour des procédures en aval, l'exposition à des rayonnements UV de longueur d'onde plus courte doit être limitée, au lieu de cela, un rayonnement UV de longueur d'onde plus élevée (365 nm) qui cause moins de dommages doit être utilisé. Des rayonnements de longueur d'onde plus élevée produisent cependant une fluorescence plus faible, donc s'il est nécessaire de capturer l'image du gel, une lumière UV de longueur d'onde plus courte peut être utilisée pendant une courte période. L'ajout de cytidine ou de guanosine au tampon d'électrophorèse à une concentration de 1 mM peut protéger l'ADN des dommages. [23] Alternativement, une source d'excitation de lumière bleue avec une coloration bleu-excitable telle que SYBR Green ou GelGreen peut être utilisée.

La recherche par électrophorèse sur gel tire souvent parti d'outils d'analyse d'images basés sur des logiciels, tels que ImageJ.


Principes fondamentaux de l'électrophorèse

L'électrophorèse fait référence à la migration de molécules chargées à travers un milieu liquide ou gel sous l'influence d'un champ électrique. L'électrophorèse de zone, ou migration de macromolécules à travers un support poreux, ou gel, est aujourd'hui presque universellement utilisée dans les laboratoires de biologie moléculaire. L'électrophorèse (toute la discussion dans ce chapitre impliquera l'électrophorèse de zone mais sera appelée électrophorèse par souci de concision) est un outil de séparation puissant, capable de détecter la migration différentielle de macromolécules avec seulement des structures subtilement différentes. Les deux formats utilisés sont l'électrophorèse sur gel en plaque, dans laquelle l'électrophorèse a lieu en milieu support, agarose ou polyacrylamide, et l'électrophorèse capillaire (EC), une technique instrumentale dans laquelle l'électrophorèse a lieu dans un tube capillaire.

La vitesse de migration d'une macromolécule à travers une matrice de gel dépend de plusieurs facteurs, notamment (1) la charge nette de la molécule au pH auquel le dosage est effectué, (2) la taille et la forme de la molécule, (3 ) l'intensité du champ électrique ou la chute de tension, (4) la taille des pores du gel et (5) la température. Les forces agissant sur l'analyte pour le conduire à travers le gel sont la charge sur la molécule et l'intensité du champ électrique. Équation

(1) décrit la force motrice électrophorétique (tableau 1).

Les forces agissant pour retarder le mouvement de la molécule sont les forces de friction, déterminées par la vitesse de l'analyte, la taille des pores du gel et la taille et la forme de la molécule. L'opposition de l'accélération de l'analyte par les forces de frottement est décrite par la loi de Stokes comme le montre l'équation.

(2) (Tableau 1). Lorsque la force d'entraînement électrophorétique est égale à la force de friction (F = F), le résultat est une vitesse constante de la molécule d'analyte à travers la matrice de gel [Eq. (2), tableau 1]. Le terme viX décrit la vitesse de l'analyte à travers la matrice de gel (cmis) par unité d'intensité de champ (Vicm) dans des conditions constantes (c'est-à-dire les mêmes conditions de tampon et la même viscosité de gel). Ce terme (donné par le symbole ||) est défini comme la mobilité électrophorétique de l'analyte (exprimée en cm2iV-s). A partir des unités de la mobilité électrophorétique, on peut voir que si le gel est exécuté dans des conditions de tension constante (constante de Vicm) pendant une période de temps donnée (s), alors (cm2iV-s) (V-sicm) est la distance de migration (en cm). Ainsi, si les gels sont exécutés de telle sorte que le produit de la tension et du temps soit constant, le même analyte migrera sur la même distance dans le gel. Pour plus de commodité, cela est généralement exprimé en volts-heures. Par exemple, si un gel est exécuté à 50 V pendant 10 h (500 Vh) et qu'un gel identique (longueur, viscosité et concentration de tampon constantes) est exécuté à 100 V pendant 5 h (500 Vh), le même analyte apparaîtra à la même position sur les deux gels. Cette capacité à reproduire les profils de gel est l'une des principales raisons pour lesquelles les conditions de fonctionnement à tension constante sont préférées pour l'analyse de l'ADN. Une exception à ceci est les conditions préférées pour le séquençage de l'ADN. Comme on le verra plus tard, les gels de séquençage sont exécutés à température élevée pour assurer la dénaturation adéquate des molécules d'ADN simple brin dans ce cas, l'exécution du gel à des watts constants est utile pour maintenir un chauffage uniforme du gel.

Dans l'analyse des protéines, le pH du tampon d'électrophorèse peut être un outil puissant pour optimiser des séparations spécifiques. En effet, le type (acide ou basique) et le nombre de groupes ionisables trouvés sur les protéines sont variables. Cependant, pour l'analyse de l'ADN, c'est la charge du squelette phosphate qui est dominante. Par conséquent, l'électrophorèse de l'ADN est généralement effectuée à un pH légèrement alcalin pour assurer une ionisation complète des résidus de phosphate.

3.1. LA MATRICE DE GEL : L'AGAROSE Il existe deux types de matrice de gel couramment utilisés dans les laboratoires d'ADN : l'agarose et le polyacrylamide. L'agarose est un polysaccharide dérivé commercialement des algues. Le polymère d'agarose se compose de plusieurs molécules d'agarbiose liées entre elles en chaînes linéaires, avec un poids moléculaire moyen de 120 000 daltons. La sous-unité agarbiose est un disaccharide constitué de P-d-galactose et de 3,6-anhydro-a-l-galactose (Fig. 1) (6). Le matériau partiellement purifié, la gélose, se compose de chaînes polymères non chargées, d'agarose et de chaînes chargées négativement. Les charges négatives sont typiquement le résultat de résidus de sulfate (-SO4). En général, plus l'agarose est hautement purifié, plus la concentration en sulfate est faible, plus la qualité de la séparation est élevée et plus le prix est élevé. L'agarose est fourni sous forme de poudre blanche non hydroscopique. Un gel est préparé en mélangeant de la poudre d'agarose avec un tampon, en faisant bouillir le mélange, en versant le gel fondu dans un plateau de coulée et en refroidissant. Au cours de ce processus, les chaînes d'agarose passent de l'existant en solution sous forme de bobines aléatoires à une structure dans laquelle les chaînes sont regroupées en doubles hélices. La taille moyenne des pores pour les gels d'agarose est généralement comprise entre 100 et 300 nm3. Les gels d'agarose sont utilisés à des concentrations proches de 1% (wiv) pour séparer les fragments d'ADN dans la plage de taille de 1 à 20 kb. Des exemples d'applications courantes dans le laboratoire de diagnostic de l'ADN comprennent l'analyse par digestion par restriction de grands plasmides et l'analyse par transfert Southern de l'ADN génomique.

Fig. 2. Schéma illustrant la polymérisation des monomères acrylamide et bis-acrylamide.


Électrophorèse sur gel d'agarose de l'ADN

Verser un gel, la poudre d'agarose est mélangée avec du tampon d'électrophorèse à la concentration souhaitée, puis chauffée dans un four à micro-ondes jusqu'à ce qu'elle soit complètement fondue. Le plus souvent, du bromure d'éthidium est ajouté au gel (concentration finale 0,5 ug/ml) à ce stade pour faciliter la visualisation de l'ADN après électrophorèse. Après refroidissement de la solution à environ 60°C, elle est versée dans un bac de coulée contenant un peigne échantillon et laissée se solidifier à température ambiante ou, si vous êtes très pressé, au réfrigérateur.

Une fois le gel solidifié, le peigne est retiré en prenant soin de ne pas déchirer le fond des puits. Le gel, toujours dans son bac en plastique, est inséré horizontalement dans la chambre d'électrophorèse et juste recouvert de tampon. Les échantillons contenant de l'ADN mélangé avec du tampon de chargement sont ensuite pipetés dans les puits d'échantillon, le couvercle et les câbles d'alimentation sont placés sur l'appareil et un courant est appliqué. Vous pouvez confirmer que le courant circule en observant des bulles sortant des électrodes. L'ADN va migrer vers l'électrode positive, qui est généralement de couleur rouge.

La distance à laquelle l'ADN a migré dans le gel peut être évaluée en surveillant visuellement la migration des colorants de suivi. Les colorants bleu de bromophénol et xylène cyanol migrent à travers les gels d'agarose à peu près à la même vitesse que les fragments d'ADN double brin de 300 et 4000 pb, respectivement.

Lorsque la migration adéquate a eu lieu, Les fragments d'ADN sont visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Ce colorant fluorescent s'intercale entre les bases de l'ADN et de l'ARN. Il est souvent incorporé dans le gel de sorte que la coloration se produit pendant l'électrophorèse, mais le gel peut également être coloré après l'électrophorèse par trempage dans une solution diluée de bromure d'éthidium. Pour visualiser l'ADN ou l'ARN, le gel est placé sur un transilluminateur ultraviolet. Sachez que l'ADN diffusera dans le gel au fil du temps, et l'examen ou la photographie doit avoir lieu peu de temps après l'arrêt de l'électrophorèse.

Migration de fragments d'ADN dans l'agarose

Autres considérations

Les gels d'agarose, comme discuté ci-dessus, fournissent les moyens les plus couramment utilisés pour isoler et purifier des fragments d'ADN, ce qui est une condition préalable à la construction de tout type de molécule d'ADN recombinant.

En faisant varier la composition du tampon et les conditions de fonctionnement, l'utilité des gels d'agarose peut être étendue. Les exemples comprennent:

  • Électrophorèse en champ pulsé est une technique dans laquelle la direction du courant dans la chambre d'électrophorèse est périodiquement modifiée. Cela permet le fractionnement de morceaux d'ADN allant de 50 000 à 5 millions de pb, ce qui est beaucoup plus grand que ce qui peut être résolu sur des gels standard.
  • Gels alcalins d'agarose sont préparés et soumis à une électrophorèse dans des tampons contenant de l'hydroxyde de sodium. De telles conditions alcalines sont utiles pour analyser l'ADN simple brin.

Enfin, si vous n'avez pas eu l'occasion d'utiliser des gels d'agarose, essayez le laboratoire virtuel d'électrophorèse d'agarose.


Optimisation de l'électrophorèse sur gel : concentrations en ampères, volts et tampons - Biologie

Le nom, &lsquowestern&rsquo blot, a été inventé pour la première fois par le Dr Burnette en 1981 après le Southern blot éponyme pour l'ADN et la frappe conséquente du Northern blot en 1977 pour l'ARN.[1][2] Le western blot (WB) est un immunodosage efficace et largement utilisé qui permet une analyse sélective de l'expression des protéines. WB sélectionne une protéine individuelle parmi un milieu potentiellement important en tirant parti de la spécificité de la liaison antigène (Ag)-anticorps (Ab). D'un intérêt notable est son application en pathologie clinique, où un western blot détecte la présence d'une protéine pathologiquement pertinente à partir d'un échantillon de patient. Cet examen discutera des principes biochimiques, de la signification clinique et des aspects de dépannage de cette technique.

Exigences relatives aux spécimens et procédure

Principes du Western Blot

Le Western blot repose sur les principes du chargement égal des protéines, de la séparation des protéines par poids moléculaire, du transfert électrophorétique sur une membrane appropriée et du sondage des anticorps.

Charge égale de protéines

Une bonne préparation de l'échantillon pour l'électrophorèse ultérieure est cruciale pour l'analyse en aval. Les échantillons de transfert Western sont d'abord préparés par extraction de protéines avec des tampons de lyse cellulaire spécialisés et des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (IPP). Il existe de nombreuses méthodes d'extraction, et la sélection appropriée dépend du type d'échantillon. Par exemple, la plupart des préparations de tissus se font par homogénéisation ou sonication, cependant, le choc osmotique ou la lyse par détergent convient mieux aux cellules facilement lysées telles que les érythrocytes ou les cellules en culture. De plus, le tampon de lyse cellulaire utilisé dans l'extraction doit s'aligner sur la localisation cellulaire de la protéine cible.[3] Par exemple, le tampon de dosage de radioimmunoprécipitation (RIPA) est plus adapté aux protéines nucléaires et mitochondriales. Bien que rares, certains anticorps ne pourront pas détecter les échantillons dénaturés. En tant que tels, des tampons doux sans détergents sont nécessaires. Les IPP sont utilisés pour maintenir la structure et l'état de phosphorylation de la protéine cible à partir de l'activité des phosphatases endogènes lors de la lyse cellulaire et des phosphatases exogènes dans le microenvironnement de lyse. Collectivement, ces informations soulignent la nécessité d'adapter l'extraction des protéines au type d'échantillon et à la protéine cible.

Il doit y avoir une concentration égale de protéines par échantillon western blot. Intuitivement, cela est impératif pour une expérience valide car des protéines inégales par voie peuvent fausser l'analyse. En effectuant un dosage Bradford, un dosage colorimétrique des protéines qui exploite une interaction entre le colorant et les protéines, la concentration en protéines est quantifiable.[4] En bref, le colorant Coomassie Brilliant Blue G-250 se complexe avec des protéines pour changer de couleur, et ce changement d'absorbance est enregistré par un spectrophotomètre. Ainsi, en exécutant ce test avec des normes de protéines connues, une courbe standard de régression linéaire est générée pour calculer les concentrations d'extraits de protéines inconnues.

Tous les échantillons de transfert Western ont trois éléments : un extrait de protéine, un tampon de lyse cellulaire et un tampon Laemmli (échantillon). L'extrait de protéine est normalisé avec un tampon de lyse cellulaire à la concentration de protéine souhaitée, et il y a un ajout d'un volume égal de tampon Laemmli (échantillon). Par conséquent, il existe toujours un rapport en volume de 1 à 1 de protéine normalisée et de tampon Laemmli dans un échantillon de transfert western. Le tampon Laemmli (60 mM & 160 Tris-HCl pH 6,8 20 % glycérol 2 % SDS 4 % bêta-mercaptoéthanol 0,01 % bleu de bromophénol)&# 160 est unique à la préparation d'échantillons western blot car chaque réactif est utile pour la SDS-PAGE.[5][6 ] Le glycérol ajoute de la densité aux échantillons, de sorte qu'ils dérivent dans les puits de chargement. Le bleu de bromophénol (BPB) est un réactif non réactif qui sert de front colorant pour l'électrophorèse. Le SDS est un puissant détergent anionique qui enrobe les protéines dénaturées avec un rapport anion/masse égal, ce qui masque les caractéristiques de charge, de forme et de taille des protéines et les rend uniquement fonction du poids moléculaire. Le bêta-mercaptoéthanol (BME) est un agent réducteur qui agit sur les liaisons disulfure en l'absence de BME, les protéines avec des liaisons disulfure conservent une certaine forme et n'électrophorisent pas considérablement le poids moléculaire. Tris-HCl pH 6,80 fonctionne en conjonction avec le système tampon discontinu, expliqué plus en détail ci-dessous. Les échantillons préparés sont chauffés avant le chargement pour dénaturer davantage les protéines en leur structure primaire respective. Ainsi, les protéines subissent une électrophorèse en fonction de leur poids monomère.

Séparation des protéines par poids moléculaire

La séparation des protéines en poids est possible grâce à l'électrophorèse sur gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) - en particulier son utilisation combinatoire d'un détergent et d'un système tampon discontinu.

Typiquement, PAGE est une méthode de biochimie analytique utilisée pour séparer les contenus tels que les acides nucléiques et les protéines par mobilité électrophorétique dans un gel chimiquement inerte. Cependant, en ajoutant du SDS, un puissant détergent anionique, toutes les protéines dénaturées seront recouvertes d'un rapport charge/masse égal. . Par conséquent, la vitesse de migration des protéines est proportionnelle au poids. En effet, les protéines plus grosses voyagent plus lentement que les protéines plus petites en raison des propriétés retardatrices du gel poreux. Une matrice de gel est formée à partir de la polymérisation de l'acrylamide et de la réticulation de N, N'-méthylènebisacrylamide. Cette matrice crée un tamis moléculaire qui imprègne les propriétés retardatrices. La taille des pores de ce tamis est modifiable en ajustant le pourcentage de polyacrylamide/ N, N'-méthylènebisacrylamide car ils sont inversement proportionnels.[7] Deux tamis de tailles différentes sont utilisés dans PAGE : un gel d'empilement et un gel de résolution. Comme son nom l'indique, le gel d'empilement empile les protéines dans une bande étroite pour permettre aux protéines d'entrer en même temps dans le gel de résolution, ce qui est rendu possible grâce à sa plus grande taille de pores et son acidité. Avec sa taille de pores et sa basicité beaucoup plus petites, le gel de résolution est l'endroit où se produit la séparation des protéines.

Le système tampon discontinu Laemmi est le plus couramment utilisé en SDS-PAGE. Ce système utilise un tampon de fonctionnement (25 mM Tris 192 mM glycine 0,1% SDS pH

8.30) comme tampon d'électrode et Tris-HCl pour tamponner un gel d'empilement acide (pH

6,80) et un gel de résolution basique (pH

8.80). L'utilisation délibérée de pH variés exploite les propriétés de charge de la glycine. En milieu acide, la glycine est un zwitterion, mais en milieu basique, c'est un anion glycinate. Ainsi, lorsque l'électrophorèse démarre, le courant attire rapidement le glycinate dans le gel d'empilement. Le gel acide protone la glycine en sa forme zwitterionique, ce qui entrave gravement sa mobilité.

En revanche, le chlorure du tampon Tris-HCl dans le gel se dissocie de son contre-ion et migre rapidement vers l'anode. Les protéines se situent entre un front de fuite de glycine et un front de chlorure, ce qui fait que toutes les protéines arrivent simultanément sur le gel de résolution, un composant vital pour la séparation ultérieure. La basicité des réformes de gel de résolution conjugue les anions glycinate à l'interface de gel de résolution d'empilement. A partir de cette interface, les anions glycinate migrent rapidement au-delà du front protéique. Les protéines frappent maintenant le gel de résolution en bandes étroites sans zone de haute tension précédemment formée à partir des ions de tête et de queue dans le gel d'empilement. Ainsi, cela permet aux protéines de migrer plus lentement vers le gel de résolution, ce qui induit la séparation des protéines en raison de la concentration plus élevée de polyacrylamide (Figure 1a).

Les échantillons passent dans leurs couloirs respectifs à côté d'un marqueur de poids moléculaire, souvent appelé échelle protéique. Par exemple, une configuration typique aurait l'échelle dans la première voie et les échantillons dans les voies restantes.L'échelle établit des bandes de poids moléculaire standard qui sont ensuite utilisées pour lire le poids relatif des protéines. 

Transfert électrophorétique (Blotting)

Le transfert est le transfert électrophorétique du contenu du gel sur une membrane appropriée dans un transfert western, le contenu est constitué de protéines. Il existe plusieurs méthodes de transfert en plus de plusieurs types de membranes. Bien que divers systèmes de transfert existent (humide, semi-sec, rapide), le principe de base du transfert électrophorétique reste le même. Comme l'électrophorèse, les échantillons chargés négativement migrent vers une anode cependant, en buvardage, un sandwich de transfert est utilisé avec un tampon d'électrode légèrement modifié. Le tampon Towbin (25 mM Tris 192 mM glycine 20 % méthanol pH 8,3) est le tampon de transfert standard, bien que de petits ajustements soient possibles pour la protéine cible.[8] Le méthanol est important dans le transfert car il augmente l'hydrophobie des protéines et facilite la libération de SDS, qui augmentent tous deux l'adsorption des protéines sur la membrane. De la cathode à l'anode, le sandwich s'organise en papier filtre, gel de polyacrylamide, membrane et papier filtre. Dans un système de transfert humide, des tampons en fibres ou des éponges sont placés superficiellement de chaque côté. Le sandwich est soumis à un courant perpendiculaire qui entraîne le contenu du gel sur la membrane. (Figure 1b). L'équilibrage du contenu du sandwich dans le tampon de transfert est crucial pour augmenter l'efficacité du transfert, il empêche le séchage du gel et de la membrane, lave les contaminants électrophorétiques du gel et reforme la taille du gel d'origine. Au fur et à mesure que l'électrophorèse se déroule, la tension augmente les températures, ce qui augmente la taille du gel. Ainsi, le tampon de transfert à froid se rétrécit à la taille appropriée. Fait intéressant, le méthanol dans le tampon de transfert sert également à refroidir le gel pendant l'équilibrage.   

Chaque système de transfert a ses avantages, et en choisir un dépend en grande partie de la protéine cible et du flux de travail du laboratoire. Parmi les appareils de transfert variés, les deux plus couramment utilisés sont humides et semi-secs. Il est essentiel de considérer qu'entre les systèmes humides et semi-secs, les principales différences sont le volume de tampon de transfert utilisé et le temps de transfert. Le transfert humide utilise un système de transfert en réservoir qui nécessite un grand volume de tampon de transfert, tandis que les systèmes de transfert semi-sec ne nécessitent généralement que l'humidification du sandwich. Les systèmes semi-secs sont également rapides car le buvard se termine généralement en une heure, mais une basse tension est appliquée pendant la nuit dans un transfert humide. Bien que le transfert semi-sec semble être la meilleure option car il y a une réduction significative à la fois du volume de tampon de transfert et de la durée du transfert, il a ses limites. Les grosses protéines telles que les récepteurs membranaires ne s'imprègnent pas bien et l'efficacité globale du transfert est plus faible. Le transfert humide brille par sa capacité à produire une efficacité élevée sur une large gamme de tailles de protéines, offrant ainsi la plus grande flexibilité. 

Lorsque les Drs. Burnette et Towbin ont publié leurs études séminales. Le transfert électrophorétique a été réalisé sur des membranes de nitrocellulose. Ils sont restés l'étalon-or jusqu'à l'avènement des membranes en difluorure de polyvinylidène (PVDF). Concrètement, les membranes en PVDF surpassent les membranes en nitrocellulose par leur capacité de liaison aux protéines, leur résistance chimique et leur efficacité de transfert améliorée en présence de SDS. L'adsorption plus élevée des protéines du PVDF et sa résistance chimique permettent le décapage et le reprofilage des membranes. De plus, en insérant un petit pourcentage de SDS dans le tampon de transfert, l'efficacité du transfert s'améliore nettement. Cependant, la sensibilité aux protéines notée du PVDF pourrait également augmenter le signal de fond pour l'analyse. Le méthanol dans le tampon de transfert peut rétrécir les membranes de nitrocellulose et précipiter les grosses protéines. Les deux types de membranes ont des tailles de pores différentes, et la taille des pores de la membrane est directement liée au poids des protéines. Les protéines plus petites nécessitent des tailles de pores plus petites, bien qu'une taille de pores de 0,45 micron convienne à la plupart des protéines. Ces dernières années ont vu le développement de membranes uniques telles que celles utilisées pour les systèmes de détection dans le proche infrarouge. En tant que tel, le type de membrane choisi doit refléter la protéine cible et les systèmes de détection en aval.

Sondage d'anticorps

Une fois le transfert électrophorétique terminé, les protéines sont maintenant sur la membrane et deux anticorps servir pour le sondage et l'analyse. L'anticorps primaire qui se lie à une région spécifique de la protéine cible est utilisé pour détecter sa présence sur la membrane. L'anticorps secondaire se conjugue avec un composant utilisé pour l'analyse. Cet anticorps se lie indirectement à la protéine cible en se liant aux régions constantes de l'anticorps primaire (figure 1c). 

Étant donné que les membranes ont une affinité élevée pour les protéines, avant le sondage, les membranes sont incubées dans un tampon pour recouvrir la surface restante. Ce tampon "bloquant" comprend une protéine ayant une affinité de liaison minimale avec la protéine cible et, par conséquent, l'anticorps. Typiquement, les protéines tampons bloquantes comprennent soit la caséine de lait en poudre, soit l'albumine de sérum bovin (BSA). Bien que la caséine soit moins chère et adaptée à la plupart des protéines, la BSA est considérée comme un meilleur choix lorsque la protéine cible est phosphorylée. Il existe une réactivité croisée entre la caséine et les anticorps primaires spécifiques de la phosphorylation. Après blocage, la membrane est lavée avec du TBS-T, un mélange de solution saline tamponnée au Tris, et du Tween 20. Le Tween 20 est un détergent non ionique qui aide à éliminer les protéines liées à la périphérie sur la membrane.

Le sondage des anticorps primaires et secondaires est effectué en incubant la membrane dans un tampon de sondage de l'anticorps primaire ou secondaire dans du TBS-T. La membrane est d'abord incubée dans le tampon de sondage primaire généralement pendant une nuit dans une chambre froide, et lavée à nouveau avec du TBS-T. La membrane est ensuite incubée avec le tampon de sondage secondaire pendant environ une heure, puis lavée également. Ces étapes de lavage sont cruciales pour réduire le bruit de fond dans l'analyse. Après sondage et lavage, la membrane est prête à être lue.

Comme mentionné précédemment, l'anticorps secondaire se conjugue avec un composant spécifique au type d'analyse. L'autoradiographie était un moyen courant de visualiser les bandes, mais sa popularité a diminué en raison des risques associés à cette méthode. Il utilise un isotope radiomarqué conjugué à l'anticorps secondaire. Plus communément, une méthode de chimiluminescence est utilisée. Cette méthode utilise des substrats qui réagissent avec un anticorps secondaire conjugué à une enzyme. Ces enzymes sont soit la peroxydase de raifort (HRP) soit la phosphatase alcaline (AP). La réaction à médiation enzymatique produit de la lumière qui est ensuite enregistrée avec un système d'imagerie. Plus récemment, des anticorps secondaires ont été conjugués à des fluorophores capables d'être détectés sans avoir besoin de substrats. Cette détection basée sur la fluorescence gagne en popularité en raison de sa capacité à sonder deux protéines cibles via des anticorps secondaires avec des fluorophores de longueurs d'onde différentes.

La visualisation des bandes peut servir à différentes fins analytiques. Simplement, la présence de bandes peut vérifier l'expression d'une protéine, tandis que la densité de bandes peut montrer une expression relative de la protéine comparative. Une protéine d'entretien est également sondée pour évaluer l'expression relative de la protéine. Une protéine domestique est une protéine ubiquitaire qui s'exprime de manière constitutive dans toutes les cellules. En normalisant les densités de bande de la protéine cible avec celles de la protéine d'entretien, une différence statistiquement significative entre les types d'échantillons peut être mesurée.[9][10]

Signification clinique

Comme souligné précédemment, un western blot comporte un nombre considérable d'étapes. Ce long processus augmente le temps et les coûts nécessaires pour obtenir des résultats précis. Cependant, contrairement à un test ELISA, le western blot est moins susceptible de donner des résultats faussement positifs, ce qui est particulièrement vrai dans le diagnostic du VIH.[11]

Le Western blot est utilisé pour détecter les anticorps anti-VIH dans les échantillons de sérum et d'urine humains. Les échantillons de protéines provenant d'un individu connu infecté par le VIH sont séparés par électrophorèse puis transférés sur la membrane de nitrocellulose. Ensuite, un anticorps spécifique est apposé pour détecter la protéine. Le western blot est généralement effectué après le test ELISA pour confirmer le diagnostic de VIH.[12] Il est bien plus sensible que le test ELISA. Plus récemment, dans les kits de transfert western du VIH commerciaux, des protéines virales sont fixées à la membrane. Les anticorps provenant d'échantillons d'urine ou de sérum humains se lient à ces protéines, et les anticorps anti-VIH sont utilisés pour détecter les bandes parallèlement aux contrôles de qualité.

Le western blot est également utile pour détecter la maladie de Lyme et l'encéphalopathie spongiforme bovine atypique et typique.[13][14]

Contrôle qualité et sécurité du laboratoire

Contrôles de qualité

Comme toute expérience, des contrôles de qualité doivent être utilisés pour valider les résultats. Dans un transfert western, un contrôle positif, un contrôle négatif, un contrôle de charge et un contrôle A-B sans premier degré sont tous efficaces pour réaliser et maintenir des expériences robustes.

Les contrôles sont des voies dédiées dans lesquelles l'échantillon est modifié spécifiquement pour le type de contrôle. Un contrôle positif est un échantillon connu pour contenir la protéine cible, alors qu'un contrôle négatif est connu pour ne pas contenir la protéine cible. Cela peut être aussi général que différents types d'organes ou aussi spécifique que différentes localisations cellulaires. Par exemple, si l'on vise une analyse de l'expression d'une protéine nucléaire et qu'un fractionnement subcellulaire est effectué pour isoler cette région, un contrôle négatif évalue la qualité du fractionnement, la liaison non spécifique des anticorps et un faux positif. Les contrôles positifs sont puissants pour vérifier que le flux de travail est bien optimisé même en l'absence de bandes dans les voies d'échantillonnage. De plus, un contrôle positif peut vérifier un résultat négatif.

Le contrôle de la charge est une protéine d'entretien telle que l'alpha-tubuline ou la bêta-actine. Sonder avec des anticorps spécifiques pour une protéine d'entretien vérifie une quantité égale de protéines par échantillon.

Un anticorps secondaire non spécifique peut donner des faux positifs. La spécificité d'un anticorps secondaire est évaluée en n'incubant pas une bande de membrane avec l'anticorps primaire.

Dépannage

Malheureusement, il existe de nombreux bras d'erreur dans cette méthode en raison de nombreuses étapes et d'un long flux de travail. Discuter de chaque erreur, de sa cause et de la solution sort du cadre de cet examen. Les problèmes les plus courants et leur dépannage seront abordés ci-dessous.

Sourire de bandes

Lorsque les bandes ne migrent pas également vers le bas du gel, ce motif peut exagérer en un motif souriant. Cela indique que le gel a des bulles d'air, que la tension est trop élevée ou que le volume de l'échantillon de chargement est trop grand. Les bulles d'air à l'intérieur du gel peuvent fausser la migration des bandes. Une tension constante pendant l'électrophorèse est directement proportionnelle à la résistance, et puisque la résistance et la température sont directement liées, une haute tension augmente la température dans le réservoir d'électrophorèse. Les poches de chaleur et une augmentation globale de la température du tampon en cours d'exécution peuvent également altérer la migration. Avant que le tampon ne puisse se réchauffer, une tension élevée au début de l'électrophorèse précipitera les bandes et provoquera une migration non linéaire. Un grand volume d'échantillons de chargement peut provoquer un débordement sur d'autres voies, et ces larges bandes peuvent fausser une autre voie.

Absence de bandes

Si le système de détection ne montre aucun signal sur toutes les voies sauf l'échelle, il y a une multitude de causes possibles. Il est préférable de localiser d'abord dans quel flux de travail l'erreur s'est produite. En règle générale, les coupables les plus courants sont une mauvaise efficacité de transfert ou un mauvais sondage.

En colorant la membrane avec Ponceau S, un colorant rouge sans danger pour la membrane, les bandes peuvent être visualisées. Si les bandes sont bien illustrées sur la membrane, en particulier dans la zone où la protéine cible devrait se trouver, cela indique que l'efficacité du transfert n'est probablement pas la cause. S'il n'y a pas de bandes, les paramètres de transfert doivent être modifiés. Un lessivage des protéines peut se produire dans lequel les protéines de la membrane migrent vers le papier filtre. Cela est dû au fait que le temps de transfert est trop élevé, ce qui réduit la tension et/ou le temps de transfert peut empêcher le lessivage. Un mauvais transfert peut également se produire si peu ou pas de protéines ont été adsorbées sur la membrane. Pour comprendre la directionnalité du transfert, le gel peut être coloré pour révéler des bandes. Une visualisation significative des bandes peut suggérer que le transfert réel était médiocre plutôt qu'une tension ou une durée élevée. Revérifier la qualité du tampon de transfert, augmenter les paramètres de transfert et assurer un bon contact du gel et de la membrane peuvent résoudre ce problème. Si la protéine cible est petite, un système semi-sec peut être préférable.

Si une piste de contrôle positif est utilisée et qu'il n'y a pas de bandes, cela peut être dû à un kit de détection médiocre, à de mauvais anticorps ou même à une concentration d'anticorps incorrecte. La concentration en anticorps est optimisée en exécutant des expériences de titrage.

Plusieurs bandes

Une seule rangée de bandes doit être visualisée en détection. La présence de bandes multiples suggère la liaison non spécifique des anticorps. Les anticorps polyclonaux produisent généralement ce résultat, ainsi qu'une concentration élevée d'anticorps. Comme mentionné précédemment, des expériences de titrage doivent être effectuées pour optimiser la détection.

Arrière-plan élevé avec ou sans taches

Un mauvais blocage de la membrane, une concentration excessive d'anticorps et une membrane sèche peuvent entraîner des signaux de fond élevés. Augmenter la période de blocage ou changer le type de protéine utilisée dans le tampon de blocage peut résoudre ce problème. Des expériences de titrage doivent être effectuées pour l'optimisation des anticorps. Un lavage insuffisant peut entraîner un signal de fond élevé et est une cause majeure de taches sur la membrane. Les membranes doivent être maintenues humides tout au long de l'expérience, et une membrane sèche peut donner des signaux de fond élevés. 

Les règles de sécurité standard du laboratoire s'appliquent. Si la coulée de gels, l'acrylamide est une neurotoxine puissante, cependant, elle est chimiquement inerte une fois polymérisée. Une manipulation soigneuse de ce réactif est indispensable et des mesures de précaution appropriées doivent être prises avant de le manipuler.

Améliorer les résultats de l'équipe de soins de santé

Les membres de l'équipe de soins de santé interprofessionnelle impliqués dans le traitement et la gestion des affections auxquelles s'applique le test Western Blot doivent comprendre les résultats de l'examen. Les techniciens de laboratoire et le personnel infirmier qui prélèvent et préparent les échantillons doivent être bien formés pour garantir que les échantillons sont de qualité appropriée pour des tests précis. La formation, la coordination et la communication interprofessionnelles amélioreront la validité clinique des résultats du Western Blot et se traduiront par une amélioration des soins et des résultats pour les patients. [Niveau 5]


Western Blot Doctor™ — Problèmes d'apparence des bandes de protéines

28/02/23 09:32 AM AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,EST,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN et LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0

Le Western Blot Doctor est un guide d'auto-assistance qui vous permet de résoudre vos problèmes de Western Blot. Dans cette section, vous pouvez trouver des solutions aux problèmes liés à l'apparence des bandes de protéines.

Autres sections du Western Blot Doctor :

Problèmes et solutions

Cliquez sur la vignette la plus représentative de votre propre tache pour découvrir les causes probables et trouver des solutions spécifiques au problème.

Problème : Niveaux de protéines de contrôle incohérents parmi les échantillons

  • Vérifiez que les niveaux de protéines totales sont cohérents :
    • Quantification initiale de l'échantillon (D.E., poids, nombre de cellules, etc.)
    • Vérifier la concentration des échantillons de protéines (par exemple, en utilisant des tests de protéines Bradford ou Lowry)
    • Pour déterminer si les changements dans les niveaux de contrôle de charge sont dus à des différences dans la quantité d'échantillon chargé, ou si les différences sont causées par des variations dans l'expression des protéines de contrôle de charge, utilisez des colorants de protéines totales (par exemple, Ponceau S, Coomassie, or colloïdal , ou SYPRO Ruby) pour visualiser les protéines sur des gels et des transferts avant et après le transfert afin de déterminer la charge protéique relative. Si vous prévoyez d'utiliser le transfert dans les étapes en aval, assurez-vous que votre tache peut être enlevée ou est compatible avec la détection d'anticorps. Par exemple, le Coomassie et l'or colloïdal ne sont pas compatibles avec les étapes en aval (voir Bio-Rad Protein Stains et le Protein Stain Selection Guide)
      • Pour déterminer s'il reste des protéines résiduelles non transférées sur le gel, utilisez un colorant de protéine totale sur le gel après le transfert
      • Pour vérifier le transfert de protéines, colorer la membrane avec Ponceau S après buvardage
      • Visualisez les protéines totales sur les gels et les taches à l'aide des gels sans taches Bio-Rad&rsquos dotés de notre technologie exclusive sans taches. En plus de fournir une vérification visuelle du transfert à chaque étape, l'imagerie sans tache permet une normalisation totale des protéines dans chaque voie, éliminant le besoin de protéines d'entretien comme contrôles de chargement
      • Vérifiez que l'expression de contrôle de chargement est cohérente dans toutes les conditions à l'aide d'un contrôle de chargement secondaire. Si l'expression du contrôle de chargement varie en fonction des conditions expérimentales, essayez d'utiliser un autre contrôle de chargement
      • Essayez la normalisation totale des protéines en utilisant la technologie sans taches au lieu de normaliser avec une seule protéine d'entretien. Pour plus d'informations, voir ce qui suit :
        • Applications et technologies d'amplification : technologie d'imagerie sans taches
        • Tendances dans la séparation et l'analyse des protéines &mdash the Advance of Stain-Free Technology Bioradiations, septembre 2014
        • Une méthode pour une plus grande fiabilité dans les contrôles de chargement Western Blot : Bulletin de quantification des protéines totales sans tache 6360

        Problème : bandes de protéines fantômes

        • Diminuer la protéine totale chargée pour les échantillons
        • Vérifier la concentration des échantillons de protéines (par exemple, en utilisant des tests de protéines Bradford ou Lowry) avant de charger le gel
        • Optimiser le chargement de l'échantillon voir Détermination de la charge d'échantillon appropriée pour le protocole Western Blots
        • Diminution de la concentration d'anticorps primaires et/ou secondaires
        • Optimisez vos concentrations d'anticorps primaires et/ou secondaires à l'aide d'un protocole de dépistage en damier
        • Utiliser un temps d'exposition plus court
        • Utiliser la fonction multi-acquisition sur le logiciel d'acquisition de données
        • Utiliser un substrat de détection moins sensible
        • Réduisez le temps d'incubation avec le substrat de détection
        • Lors de la construction du sandwich buvard, ne réajustez pas le buvard une fois que le gel est entré en contact avec la membrane, car cela peut entraîner des images fantômes sur la membrane buvard.

        Problème : les tourbillons ou les bandes manquantes apparaissent diffuses sur le blot

        Tampons en mousse pour les systèmes de buvardage de réservoir humide Bio-Rad :

        • Buvard Criterion&trade (1704086)
        • Système Trans-Blot ® Plus (1703995)
        • Système Trans-Blot (1703914)
        • Mini système Trans-Blot (1703933)

        Problème : bandes floues

        • Répéter l'électrophorèse sur gel à basse tension
        • Fonctionne à une tension inférieure pendant toute la course
        • Exécuter à une tension inférieure jusqu'à ce que les protéines commencent à entrer dans le gel de résolution, puis augmenter la tension pour le reste de l'analyse
        • Éliminez soigneusement les bulles d'air entre le gel et la membrane avant le transfert des protéines
        • Préparez un nouveau tampon de fonctionnement ou utilisez des tampons commerciaux prémélangés (voir notre sélection de tampons et réactifs)

        Problème : Les bandes sont incurvées (souriantes) et non droites

        • Vérifier et optimiser les conditions d'électrophorèse sur gel. Consultez votre manuel d'instructions ou le Guide d'électrophorèse
        • Réduire la tension pendant l'électrophorèse
        • Exécuter le gel à 4°C. Placer la cellule d'électrophorèse dans une glacière à 4°C pendant l'analyse. Utilisez des tampons réfrigérés, un serpentin de refroidissement ou un insert de refroidissement &ldquoblue ice&rdquo

        Problème : bandes larges ou déformées

        • Des artefacts d'électrophorèse peuvent survenir en raison d'une mauvaise polymérisation du gel, de conditions de fonctionnement inappropriées, de tampons contaminés, d'une surcharge d'échantillon, etc. Consultez votre manuel d'instructions pour plus de détails et consultez le Guide d'électrophorèse pour obtenir des conseils sur tous les aspects de l'électrophorèse des protéines.
        • Vérifiez les concentrations en sel des échantillons, en particulier lors de l'analyse d'échantillons précipités par le sel. Dans la mesure du possible, maintenez des teneurs en sel similaires dans tous les puits. Les puits avec des niveaux de sel plus élevés ont tendance à se dilater lorsqu'ils sont à côté de puits avec moins de sel en raison de l'osmose. Des différentiels de sel élevés (en particulier entre l'échantillon et les tampons) peuvent également provoquer une distorsion de bande plus importante. Soyez prudent lorsque vous analysez des échantillons précipités par le sel
        • Les échantillons riches en sel peuvent souvent être dessalés à l'aide des colonnes Bio-Gel ® P6

        Problème : bandes blanches (négatives) sur film en utilisant la méthode ECL

        • Charger moins d'échantillon
        • Répéter avec la série de dilutions de l'échantillon
        • Optimiser le chargement de l'échantillon voir Détermination de la charge d'échantillon appropriée pour le protocole Western Blots
        • Réduire/optimiser les concentrations d'anticorps à l'aide de protocoles de dépistage en damier

        Problème : pas de bandes

        • Confirmez le transfert de protéine en colorant la membrane avec Ponceau S et/ou le gel avec Coomassie Blue Dye, ou utilisez les gels sans tache Bio-Rad&rsquos pour vérifier le transfert à l'aide de notre technologie d'imagerie sans tache unique
        • Notez à quel point les marqueurs de poids moléculaire précolorés ont été transférés sur le transfert
        • Optimiser et vérifier les conditions de transfert et la configuration (en particulier l'orientation vers les électrodes)
        • Répétez l'utilisation de deux membranes au cas où la protéine aurait été transférée à travers la première membrane (le sur-transfert est particulièrement probable avec les protéines à faible PM)
        • Essayez une concentration plus faible d'agent bloquant
        • Essayez d'autres agents de blocage
        • Utiliser des tampons sans azoture
        • Utiliser des réactifs de détection frais
        • Ajouter du peroxyde frais au tampon de substrat
        • Retracez les étapes pour vérifier la compatibilité entre les anticorps primaires et secondaires
        • Sonder avec un transfert secondaire ou une bandelette correct et sonder si nécessaire
        • Répétez l'expérience avec la bonne combinaison d'anticorps
        • Augmenter la concentration d'anticorps 2&ndash4 fois plus élevée que l'essai initial
        • Utiliser un protocole de dépistage en damier
        • Augmenter la durée d'incubation
        • Réduire la rigueur des étapes de lavage
        • Abaisser la température, réduire la concentration de détergent, réduire la force ionique
        • Tester et optimiser les anticorps sur les dot blots
        • Essayez un autre anticorps. Bio-Rad propose désormais des anticorps de haute qualité pour toutes les applications
        • Consultez la fiche technique pour les conditions recommandées
        • Tester et optimiser les anticorps sur les dot blots
        • Valider les combinaisons cible et anticorps à l'aide de protocoles de dépistage en damier
        • Essayez un autre anticorps
        • Test sur dot blot à plusieurs concentrations
        • Congeler des aliquotes d'anticorps et ne les décongeler qu'une à la fois selon les besoins pour les transferts. Conserver les aliquotes décongelées à 4°C
        • Utilisez des aliquotes fraîches d'anticorps qui ont été stockées à &ndash20ºC ou en dessous
        • Si vous stockez un anticorps pendant une très longue période, stockez-le à &ndash80ºC
        • Évitez les cycles de gel-dégel répétés
        • Pour plus d'informations, consultez Conseils pour prendre soin de votre anticorps
        • Utiliser une autre source de protéine cible
        • Inclure un contrôle positif dans l'expérience (tous les anticorps PrecisionAb incluent un lysat de contrôle positif)
        • Vérifier la concentration des échantillons de protéines (par exemple, en utilisant des tests de protéines Bradford ou Lowry)
        • Optimiser le chargement de l'échantillon voir Détermination de la charge d'échantillon appropriée pour le protocole Western Blots
        • Augmenter la quantité de matériel source
        • Fractionnez ou concentrez l'échantillon en utilisant une ou plusieurs de ces techniques :

        28/02/23 09:32 AM AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,EST,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN et LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0


        SACK #10 : Réaction post-séquençage

        Comment nettoyer mes modèles séquencés ?

        10 à 20 pb de données de séquence, mais rendent également difficile pour le logiciel d'appel de base l'interprétation des pics post-'blob'.

        une) Précipitation d'éthanol: peu coûteux, simple et génère des données de bonne qualité (Protocol_A [plates].docx) (Protocol_B [tubes].docx cliquez sur Foil cap.jpg et 96-place racks.jpg pour afficher deux des outils utilisés dans ces protocoles. Pour plus d'informations informations, cliquez sur EDTA vs acétate de sodium pour la précipitation de l'ADN ? & 'Dump-&-Blot', pipette ou 'spin-out' ethanol?

        b) Kit de nettoyage de séquençage d'ADN ZR (disponible directement auprès de Zymo Research ou de son distributeur, Genesee Scientific) : pour ceux qui préfèrent les technologies de colonne aux nettoyages à l'éthanol, ce produit Zymo peut être une alternative acceptable et le fabricant affirme que les colonnes peuvent être régénérées jusqu'à 10X avec 0,1 % de HCl . Cependant, entre nos mains, les nettoyages parallèles des réactions fractionnées ont entraîné des intensités de signal beaucoup plus faibles de la colonne Zymo (par rapport à notre protocole Ethanol-EDTA), ce qui pourrait causer des problèmes avec l'appel de base des réactions de séquençage plus faibles. De plus, bien que le protocole affirme que les échantillons peuvent être élués dans du formamide à 20 % et exécutés directement sur le séquenceur, nous déconseillons fortement cette pratique, car l'eau dans le formamide entraîne la formation d'ions qui entrent en compétition pour l'injection sur les capillaires. Au lieu de cela, après élution, les échantillons doivent être séchés et remis en suspension dans du formamide HiDi pur. Alternativement, dans certaines circonstances, les échantillons peuvent être laissés dans l'eau voir Quand remettre en suspension dans l'eau vs formamide ? pour plus d'informations.

        c) Colonnes commerciales 'gel-filtration': plus cher. Certaines personnes tentent (comme nous l'avons fait à un moment donné) de réduire les coûts en réutilisant ces colonnes après les avoir « rincées » et en les stockant avec un nouveau « tampon ». Cependant, bien que ce processus puisse être effectué sans transfert de séquence d'une utilisation à l'autre, la réutilisation des colonnes conduit à des pics de terminateur de colorant non incorporés.

        70 pb dans la séquence d'ADN. De plus, après la première utilisation, de petites quantités de « gel » peuvent contourner la membrane sur une plaque et se retrouver dans le puits d'échantillon. sont autorisés à remettre en suspension pendant plusieurs heures à 4 o C. En tant que tels, nous avons complètement cessé d'utiliser les plaques commerciales, préférant utiliser l'option EtOH-EDTA peu coûteuse et très efficace à la place.

        ré) CleanSEQ par Agencourt: frais

        SACK #12 : Analyse des données

        Combien de temps faut-il pour obtenir mes données de séquence ?

        2 h pour une seule analyse (16 échantillons)

        6 h pour une demi-plaque (48 échantillons) et,

        12 h pour une plaque pleine (96 échantillons).

        b) Modules d'exécution modifiés: aussi peu que

        6 heures pour une assiette pleine (par exemple, lorsque vous sélectionnez "M.L.=400" - ce qui génère généralement

        500 pb de données). Pour plus d'informations, voir « Durées d'exécution » sous Pourquoi l'emplacement de mes échantillons dans une plaque à 96 puits est-il important ?

        c) Délai d'exécution: En règle générale, les résultats sont disponibles dans les 1 à 3 jours ouvrables suivant la soumission.

        Comment obtenir mes données de séquence ?

        une) Site Web du Centre de génomique: Lorsque vos séquences sont prêtes, vous recevrez un e-mail automatisé vous invitant à vous 'connecter', cliquez sur 'Résultats du test', puis cliquez sur le lien vers votre fichier 'Données'.

        b) 'Fichiers de données: « zippé », réduisant

        30 Mo de données d'une plaque pleine (96 échantillons) à

        10 Mo après 60 jours, tous les fichiers sont archivés.

        Comment analyser mes données ?

        une) Format: Les résultats sont disponibles sous forme de fichiers texte et d'électrophérogrammes.

        i) Fichiers texte, accessibles via DNAStar, BioEdit ou Notepad.

        ii) Électrophérogrammes, accessibles avec un logiciel gratuit (Liens logiciels) :

        (1) Sequence Scanner v1.0 – excellent outil de contrôle qualité
        (2) BioEdit – excellent outil d'alignement et,
        (3) Chromas LITE.

        b) Réanalyse: Le logiciel d'analyse de séquençage du 3130XL peut parfois améliorer vos résultats cependant, de telles analyses ne sont effectuées qu'après une demande spécifique. Utilisez Sequence Scanner pour déterminer quelles séquences valent la peine d'être réanalysées.

        Pourquoi analyser des données avec Sequence Scanner ?

        Dans le but de répondre à vos questions de recherche, vous pouvez analyser vos électrophérogrammes avec n'importe quel logiciel de votre choix. En fait, de nombreux autres programmes sont supérieurs à Sequence Scanner en termes de manipulation des données de séquence. Cependant, peu de &ndash, voire aucun &ndash, peuvent correspondre à Sequence Scanner (logiciel gratuit) pour étudier la qualité de vos données de séquence et pour aider à résoudre les problèmes de séquençage. Allez sur « Liens » pour télécharger Sequence Scanner ou un autre logiciel d'analyse d'ADN.

        Quand faire réanalyser mes données avec l'analyse de séquençage v5.2 ?

        0,70/échantillon, mais donne un ADN extrêmement propre et des lectures de séquence exceptionnelles. Veuillez nous consulter avant d'utiliser cette méthode. Il existe maintenant d'autres produits similaires qui seraient tout aussi efficaces, mais beaucoup moins chers.

        e) Kit de purification BigDye® XTerminator™ (Pièces ThermoFisher n° 4376484-4376486) : En juin 2021, le prix catalogue varie de 2,35 $/rxn (kit 1000 rxn) à 1,53/rxn (kit 2500 rxn). Le fournisseur affirme que l'élimination complète des taches de colorant et de meilleurs résultats de séquençage, la méthode globale nécessite l'ajout de seulement deux réactifs (séquentiellement ou prémélangés), suivi d'un vortex pendant 30 minutes.

        Lors de nos tests, XTerminator a bien fonctionné et était extrêmement simple à utiliser (les échantillons ne sont jamais séchés ni remis en suspension). Cependant, notre nettoyage par précipitation EtOH a donné la même qualité de séquence et 70-100 pb supplémentaires de séquence (> 900 pb vs.

        830 pb pour BDx). Néanmoins, étant donné qu'il n'y a absolument aucune perte de produit séquencé ou d'intensité de signal, cette méthode peut être un excellent choix si vos réactions ont généralement une intensité de signal faible.

        Attention : L'utilisation de BDx nécessite un module d'exécution spécial sur le 3130xl pour éviter d'endommager la baie également, certaines précautions doivent être observées lors du nettoyage lui-même. Veuillez nous consulter avant d'utiliser cette méthode.

        EDTA vs acétate de sodium pour la précipitation de l'ADN ?

        Bien que nous recommandions d'utiliser l'EDTA, vous pouvez utiliser de l'acétate de sodium pour précipiter votre ADN séquencé. Cependant, d'après notre expérience, les laboratoires qui utilisent de l'acétate de sodium ont plus de difficultés à éliminer les terminateurs de colorant non incorporés que les laboratoires qui utilisent l'EDTA.

        En conséquence, les échantillons de laboratoire utilisant de l'acétate de sodium ont tendance à avoir un pic massif dans les 50-80 premiers pb de chaque électrophérogramme, effaçant

        10-20 pb de données. De plus, comme le logiciel d'appel de base met à l'échelle tous les pics jusqu'au pic observé le plus élevé, ce pic de terminateur de colorant provoque également l'écrasement des pics réels, ce qui rend difficile pour le logiciel de déchiffrer les données de trace.

        La notice de produit d'ABI (pdf) pour BigDye Terminator Mix v3.1 (cms_041329.pdf) répertorie deux méthodes de précipitation de l'éthanol : EtOH&ndashEDTA et, EtOH&ndashEDTA&ndashacétate de sodium. Les deux méthodes ont des avantages et des inconvénients, et aucune n'utilise d'acétate de sodium sans EDTA.

        Éthanol « Dump-&-Blot », pipette ou « spin-out » ?

        10-20 pb de données. Avec des niveaux UDT exceptionnellement élevés, des pics secondaires apparaissent environ 40 pb plus tard et parfois même des pics tertiaires se forment. Deuxièmement, le logiciel met à l'échelle tous les pics jusqu'au pic observé le plus élevé. Ainsi, vos vrais pics seront « écrasés », ce qui rendra difficile pour le logiciel de déchiffrer les données de trace, en particulier vers la fin de votre séquence. Les méthodes ci-dessous sont classées par ordre de leur capacité à supprimer complètement les UDT.

        Comment remettre en suspension des modèles nettoyés et séquencés ?

        une) Sécher: Assurez-vous que les échantillons sont complètement secs (c'est-à-dire que toute l'eau et l'éthanol ont été retirés). Si vous utilisez un thermocycleur pour sécher les échantillons et terminez le cycle de séchage avec un « maintien », assurez-vous que la température de « maintien » est de &ge25 o C (c'est-à-dire qu'elle doit être de plusieurs degrés AU-DESSUS de la température ambiante). l'humidité de la pièce se condense dans les échantillons, ce qui peut dégrader le BigDye. en particulier les G-nts.

        b) Remettre en suspension: Aux puits avec des échantillons, ajouter 15 l de formamide Hi-Di. Pour plus d'informations, voir Quel type de formamide dois-je utiliser ? et Pourquoi garder le formamide « sec » ?.

        i) Ne créez PAS de « jeux de 16 » en mettant du formamide dans des puits vierges, nous en aurons peut-être besoin !
        ii) Sceller les échantillons légèrement au vortex (facultatif, ne le faire que si l'intégrité du sceau est définitivement assurée) et centrifuger brièvement (conserver à 4 o C ou congeler).

        c) Options: Voir Quand remettre en suspension dans l'eau vs formamide ? pour plus d'informations.

        Quand remettre en suspension dans l'eau vs formamide ?

        Avec une bonne technique, les intensités du signal doivent être bien au-dessus du seuil minimum lorsque les échantillons sont remis en suspension dans du formamide. Cependant, si la force du signal est un problème même après un dépannage complet de votre situation, envisagez de remettre vos échantillons en suspension dans l'eau car cela peut augmenter la force du signal de &ge10X. Néanmoins, veuillez noter les « avertissements » énumérés ci-dessous :

        Attention 1: Les échantillons doivent être recouverts d'huile minérale pour empêcher l'oxydation et l'évaporation des échantillons. Sans la couche d'huile, vos échantillons peuvent se dégrader considérablement s'ils ne sont pas analysés peu de temps après avoir été remis en suspension avec la couche, l'ADN séquencé est presque aussi stable dans l'eau que dans le formamide. De plus, congeler vos échantillons remis en suspension jusqu'à ce qu'ils soient analysés sur l'instrument 3130XL peut aider à limiter la dégradation.

        Attention 2: En cas d'omission de la couche d'huile, remettre en suspension dans &ge20-µl d'eau pour minimiser la probabilité que l'évaporation réduise les volumes d'échantillon en dessous du minimum requis pour que les broches du réseau capillaire établissent un bon contact avec les échantillons. Un mauvais contact conduira à un signal réduit, aucun contact ne conduira, bien sûr, à des échecs d'injection. ABI spécifie un minimum de 7-µl, mais note que même une légère inclinaison de l'échantillonneur automatique peut signifier que >7-µl sera requis dans certains puits, le vrai minimum est donc plutôt 10-µl. Ne présumez PAS que le fait de recouvrir les échantillons avec le septa mat résoudra ce problème. L'eau s'évapore facilement à travers le septa mat, même à l'intérieur du séquenceur 3130xl. Les taux d'évaporation varient selon les séquenceurs (peut-être en raison de leur emplacement par rapport aux conduits d'air ambiant) cependant, dans notre installation, pour un Célibataire pleine plaque de 96 puits, un volume de départ de 20-µl a été suffisant. Comme il faut

        12 heures pour exécuter une plaque à 96 puits complète (en utilisant le module d'analyse standard pour POP7 et une matrice de 50 cm), les échantillons remis en suspension dans l'eau (sans la couche d'huile) doivent être analysés en premier si la plaque >1 est chargée sur l'instrument.

        Attention 3: Si vous envisagez cette option (c'est-à-dire la remise en suspension de l'eau), veuillez noter qu'un signal trop fort réduit la longueur de lecture.

        Attention 4: L'un des objectifs de la remise en suspension d'échantillons dans du formamide est de maintenir l'ADN dans un état dénaturé. Jusqu'à présent, nous n'avons remarqué aucun problème avec l'utilisation d'eau au lieu de formamide. Cependant, la remise en suspension dans l'eau peut être inappropriée si vos modèles sont capables de former une structure secondaire substantielle.

        Quel type de formamide dois-je utiliser ?

        Lorsqu'il est utilisé pour remettre en suspension des produits de séquence d'ADN, le formamide de haute qualité est essentiel pour des données reproductibles. Par conséquent, nous recommandons fortement d'utiliser le formamide Hi-Di d'ABI. Le formamide acheté auprès d'autres fournisseurs commerciaux est souvent contaminé par de l'eau et des ions organiques et inorganiques indésirables. De plus, le formamide est souvent fourni dans des bouteilles en verre, qui (lorsqu'elles sont ouvertes) exposent le formamide à l'air et permettent au formamide d'absorber l'eau. Les minéraux peuvent également s'infiltrer du verre dans le formamide.

        Pour vous donner une idée du degré de pureté nécessaire, voici une brève description du processus de préparation du formamide brut à utiliser dans le séquençage de l'ADN. Tout d'abord, le formamide brut (avant la désionisation) doit être de pureté &ge99,5%, avoir une faible teneur en eau, être emballé sous un gaz inerte et avoir une conductivité de

        100 µSiemens/cm. Les impuretés (telles que les ions ammonium et formiate) sont éliminées en faisant passer le formamide brut à travers une résine à lit mélangé contenant des groupes fonctionnels spécifiques d'échange d'ions forts (cationiques et anioniques). Enfin, de l'EDTA alcalin (200 mM, pour minimiser l'ajout d'eau) est ajouté au formamide désionisé pour le stabiliser et pour faciliter l'injection électrocinétique d'ADN. Pour plus de détails, voir Pourquoi garder le formamide « sec » ? et consultez la publication ABI 4315832C.

        Pourquoi garder le formamide « sec » ?

        Conservez le formamide au congélateur pour éviter l'absorption d'eau lorsque vous prévoyez d'utiliser du formamide à plusieurs reprises pendant la journée, vous pouvez en conserver une petite quantité au réfrigérateur. L'eau réagit lentement avec le formamide pour produire de l'acide formique (acide méthanoïque) et de l'ammoniac. Comme le montre Formamide_water.jpg, les produits ioniques de cette réaction posent deux problèmes :

        Pourquoi restreindre les cycles de gel-dégel pour le formamide ?

        Conservez le formamide au congélateur pour éviter l'absorption d'eau lorsque vous prévoyez d'utiliser du formamide à plusieurs reprises pendant la journée, vous pouvez en conserver une petite quantité au réfrigérateur. L'eau réagit lentement avec le formamide pour produire de l'acide formique (acide méthanoïque) et de l'ammoniac.

        Extrait de la page 82 du DNA Fragment Analysis by CE Chemistry Guide.pdf (PN 4474504, Révision B) :


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        Voir la vidéo: Généralités électrophorèse (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Kasar

    C'est une convention, pas plus, pas moins

  2. Vora

    Je crois que tu avais tort. Je suis en mesure de le prouver. Écrivez-moi en MP, parlez.

  3. Vilmaran

    Désolé, je ne peux pas vous aider. Je pense que vous trouverez la bonne solution.

  4. Gershom

    Étrange, j'en ai moi-même venu, seulement plus tard, à en juger par la date du poste. Mais merci quand même.

  5. Yekuno Amlak

    J'espère que tu trouveras la bonne solution. Ne désespérez pas.

  6. Aescwyn

    Merveilleusement, pièce très utile

  7. JoJoshicage

    Sûrement. Je rejoins tout ce qui précède. On peut parler de ce sujet. Ici, ou dans l'après-midi.



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