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Rôle du Fbx15 dans les cellules ES et son utilisation dans le dosage des cellules iPS (papier Yamanaka et autres) ?

Rôle du Fbx15 dans les cellules ES et son utilisation dans le dosage des cellules iPS (papier Yamanaka et autres) ?


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J'essaie de comprendre le dosage des cellules iPS dans l'article Takahashi & Yamanaka 2006.

Ils ont inséré une cassette bêta-géo, qui contient le gène de résistance à la néomycine, dans le Fbx15 gène. L'idée est que la cassette beta-geo s'exprimera quand Fbx15 seront exprimés, conférant ainsi une résistance au G418 uniquement aux cellules exprimant Fbx15.

Ils disent que "Bien qu'exprimé spécifiquement dans les cellules ES de souris et les embryons précoces, Fbx15 est indispensable pour le maintien de la pluripotence et du développement de la souris." Cela signifie-t-il que Fbx15 seront exprimés dans des cellules souches pluripotentes induites, et ne seront pas exprimés lors de la différenciation ? (Quelle est la particularité de Fbx15 qui distinguera les cellules iPS des cellules somatiques, y compris celles qui pourraient dériver des cellules iPS, comme lorsque la pluripotence n'est pas maintenue ?)


Un autre article du groupe de Yamanaka explique Fbx15.

Ça dit:

L'inactivation d'Oct3/4 dans les cellules ES a conduit à une extinction rapide de l'expression de Fbx15.

Les cellules ES Fbx15-null étaient normales en termes de morphologie, de prolifération et de différenciation. Ces données démontrent que Fbx15 est une nouvelle cible d'Oct3/4 mais qu'elle est indispensable pour l'auto-renouvellement, le développement et la fertilité des cellules ES.

Donc Fbx15 ne sera pas exprimé en Oct4⁻ cellules.

Je n'ai vu aucun article décrivant la fonction de ce gène, mais dans le cas d'insertions de cassettes, le locus s'avérerait utile pour exprimer les inserts spécifiquement dans 3/4 oct.⁺ cellules


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Production d'iPSC

Les cellules iPS sont typiquement dérivées par transfection de certains gènes associés aux cellules souches dans des cellules non pluripotentes, telles que des fibroblastes adultes. La transfection est typiquement réalisée par des vecteurs viraux, tels que des rétrovirus. Les gènes transfectés comprennent les principaux régulateurs transcriptionnels Oct-3/4 (Pouf51) et Sox2, bien qu'il soit suggéré que d'autres gènes améliorent l'efficacité de l'induction. Après 3-4 semaines, un petit nombre de cellules transfectées commencent à devenir morphologiquement et biochimiquement similaires aux cellules souches pluripotentes, et sont généralement par sélection morphologique, temps de doublement ou par sélection d'un gène rapporteur et d'un antibiotique.


Rôle du Fbx15 dans les cellules ES et son utilisation dans le dosage des cellules iPS (papier Yamanaka et autres) ? - La biologie

L'épissage alternatif (AS) est un processus clé qui sous-tend l'expansion de la diversité protéomique et la régulation de l'expression des gènes. Ici, nous identifions un événement AS spécifique aux cellules souches embryonnaires (ESC) conservé au cours de l'évolution qui modifie la préférence de liaison à l'ADN du facteur de transcription de la famille forkhead FOXP1. Nous montrons que l'isoforme spécifique à l'ESC de FOXP1 stimule l'expression de gènes de facteurs de transcription nécessaires à la pluripotence, notamment OCT4, NANOG, NR5A2, et GDF3, tout en réprimant simultanément les gènes nécessaires à la différenciation des ESC. Cette isoforme favorise également le maintien de la pluripotence des CES et contribue à une reprogrammation efficace des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites. Ces résultats révèlent un rôle central pour un événement AS dans la régulation de la pluripotence à travers le contrôle des programmes transcriptionnels critiques spécifiques à l'ESC.

Résumé graphique

Points forts

► Un commutateur d'épissage spécifique à l'ESC dans les transcrits FOXP1 produit l'isoforme FOXP1-ES ► FOXP1-ES possède des propriétés de liaison à l'ADN distinctes par rapport à l'isoforme canonique FOXP1 ► FOXP1-ES stimule les gènes clés de pluripotence et réprime de nombreux gènes de différenciation ► FOXP1-ES est requis pour la pluripotence des ESC et une reprogrammation efficace des iPSC


Remerciements

Nous remercions tous les membres et collaborateurs de notre laboratoire, y compris les équipes de J. M. Campistol, P. Guillen, E. Martinez et P. Ross pour leurs commentaires et leur travail dévoué qui ont grandement contribué aux idées présentées ici. H.N. a été soutenu par le California Institute of Regenerative Medicine (CIRM), l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) et Takeda Pharmaceuticals International, Inc. J.C.I.B. a été soutenu par la Fondation caritative G. Harold et Leila Y. Mathers, la Fondation Moxie, la Fundación Dr. Pedro Guillen et l'UCAM. R.J. a été soutenu par des subventions du NIH (HD 045022, R37-CA084198, 1R01NS088538-01).


Mécanismes pour maintenir l'auto-renouvellement

Afin de maintenir l'auto-renouvellement stable des cellules ES, les mécanismes qui empêchent leur différenciation et favorisent leur prolifération doivent être transmis à leurs cellules filles. Ainsi, les niveaux d'expression des gènes impliqués dans ces mécanismes doivent être maintenus de manière stable.

Un réseau de facteurs de transcription stabilisé par une régulation positive et négative entre ses composants est un bon mécanisme pour maintenir les modèles d'expression génique stables qui déterminent un phénotype cellulaire particulier (von Dassow et al., 2000). De plus, l'application de vues biologiques des systèmes, telles que les modèles de réseau booléen, nous permet d'expliquer comment de petits changements à quelques composants d'un réseau peuvent déclencher la transition dynamique d'un réseau de facteurs de transcription d'un état à un autre (Kauffman, 2004) . Les modèles de réseau booléen aléatoire sont un moyen de modéliser des réseaux composés de plusieurs facteurs qui ont plusieurs entrées dans des systèmes complexes. Ils sont basés sur la logique booléenne, dans laquelle plusieurs opérateurs logiques, tels que ET et OU, sont réunis en expressions sur le facteur avec des valeurs binaires telles que 1 et 0 (Kauffman, 2004).

Sox2 occupe une position importante dans le maintien du réseau de facteurs de transcription pluripotent (Fig. 4B). Comme discuté ci-dessus, Sox2 est connu pour coopérer avec Oct3/4 dans l'activation des gènes cibles Oct3/4 (Yuan et al., 1995). À ce jour, des amplificateurs spécifiques d'ES qui contiennent des sites de liaison pour Oct3/4 et Sox2 ont été identifiés dans plusieurs gènes, y compris Fgf4 (Yuan et al., 1995), l'ostéopontine (Spp1 - Informatique du génome de la souris) (Botquin et al., 1998), UTF1 (Nishimoto et al., 1999), Fbxo15(Tokuzawa et al., 2003), Nanog (Kuroda et al.,2005 Rodda et al.,2005) et Gauche1(Nakatake et al., 2006). Fait intéressant, les deux 3/4 oct. et Sox2 possèdent des activateurs qui sont activés par le complexe Oct3/4-Sox2 d'une manière spécifique aux cellules souches (Chew et al., 2005 Okumura-Nakanishi et al., 2005 Tomioka et al., 2002). Sox2-les embryons nuls meurent immédiatement après l'implantation (Avilion et al., 2003), et le knockdown de Sox2 dans les cellules ES de souris induit la différenciation en plusieurs lignées, y compris le trophectoderme, indiquant son importance fonctionnelle dans le maintien de la pluripotence (Ivanova et al., 2006). La génération de Sox2-les cellules ES nulles aideraient à élucider la fonction précise de Sox2 et l'identification de ses gènes cibles, comme ce serait également le cas pour Oct3/4.

L'identification de sites cibles communs dans les éléments réglementaires de 3/4 octobre, Sox2 et Nanog par des études récentes utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) avec des techniques de localisation à l'échelle du génome a suggéré que 3/4 octobre, Sox2 et Nanog pourraient former un circuit de rétroaction régulatrice qui maintient la pluripotence dans les cellules ES humaines et murines dans ce circuit, les trois facteurs de transcription s'autorégulent, ainsi que les uns les autres (Boyer et al.,2005 Loh et al.,2006). Bien que ce modèle de rétroaction n'ait pas été confirmé dans les cellules ES, une boucle de rétroaction positive à elle seule serait incapable de permettre au réseau de facteurs de transcription de maintenir la pluripotence car la pluripotence est extrêmement sensible aux niveaux d'expression de 3/4 oct.(Niwa et al., 2000).

Étant donné que même une légère surdose d'Oct3/4 déclenche une différenciation, le réseau nécessite une boucle de rétroaction négative afin de réguler étroitement 3/4 oct. niveaux d'expression. Un modèle expérimental dans des cellules procaryotes a révélé qu'une simple boucle de rétroaction négative peut considérablement stabiliser le niveau d'expression d'un gène (Becskei et Serrano, 2000). Par conséquent, une boucle de rétroaction négative directe ou indirecte pourrait être suffisante pour réguler l'expression quantitative de 3/4 oct. dans la plage requise pour maintenir la pluripotence. À ce jour, deux éléments régulateurs, un amplificateur distal et un amplificateur proximal, ont été identifiés comme amplificateurs spécifiques des cellules souches de 3/4 oct.(Yeom et al., 1996), auquel de nombreux régulateurs positifs et négatifs sont recrutés (Fig. 4A). Parmi eux, les membres de la superfamille des récepteurs nucléaires orphelins, qui peuvent se lier à l'amplificateur proximal, sont connus pour influencer l'expression d'Oct3/4. L'homologue du récepteur hépatique 1 (Lrh1, également connu sous le nom de Nr5a2) est un régulateur positif putatif de 3/4 oct., comme 3/4 oct. l'expression est perdue dans l'épiblaste de Lrh1-nul embryons et est rapidement régulé à la baisse après l'induction de la différenciation dans Lrh1-cellules ES nulles (Gu et al., 2005a). En revanche, le facteur nucléaire des cellules germinales (Gcnf ou Nr6a1) est un potentiel 3/4 oct. régulateur négatif, comme domaine d'expression de 3/4 oct. est agrandie et son expression prolongée dans le neuroépithélium de Gcnf-embryons nuls (Fuhrmann et al., 2001). 3/4 oct. la répression consécutive à l'induction de la différenciation est également retardée Gcnf-cellules ES nulles (Gu et al., 2005b). Facteurs de transcription du promoteur en amont de l'ovalbumine de poulet (Coup-tf) I et II, codés par Nr2f1 et Nr2f2,respectivement, fonctionnent également comme des régulateurs négatifs de 3/4 oct.(Ben-Shushan et al., 1995). L'équilibre entre ces régulateurs positifs et négatifs pourrait déterminer le niveau précis de 3/4 oct. expression en réponse à des stimuli extracellulaires (Fig. 4A).

Un réseau de facteurs de transcription pour contrôler l'auto-renouvellement et la différenciation des cellules ES. (UNE) Régulation transcriptionnelle de la souris 3/4 oct. gène. Il existe quatre régions conservées au cours de l'évolution (CR1-4) qui contiennent plusieurs sites de liaison au facteur de transcription (TF). Les TF qui se lient à ces sites sont indiqués ci-dessus et activent (rouge) ou répriment (bleu) la transcription. DE, amplificateur distal PE, amplificateur proximal PP, promoteur proximal. (B) Réseaux de facteurs de transcription pour les cellules souches pluripotentes (vert), le trophectoderme (jaune) et l'endoderme primitif (extra-embryonnaire) (bleu). Les boucles de rétroaction positive entre Oct3/4, Sox2 et Nanog maintiennent leur expression pour favoriser l'auto-renouvellement continu des cellules ES. Cdx2 est autorégulé et forme une boucle inhibitrice réciproque avec Oct3/4, qui agit pour établir leurs modèles d'expression mutuellement exclusifs. Une boucle de régulation similaire, non encore confirmée, pourrait exister pour Nanog et Gata6. Une combinaison de boucles de rétroaction positive et de boucles inhibitrices réciproques convertit les paramètres d'entrée continus en une distribution de probabilité bimodale, entraînant une ségrégation claire de ces lignées cellulaires (voir le texte pour plus de détails). Coup-tfs et Gcnf agissent comme un système de rétroaction négative pour réprimer complètement Oct3/4.

Un réseau de facteurs de transcription pour contrôler l'auto-renouvellement et la différenciation des cellules ES. (UNE) Régulation transcriptionnelle de la souris 3/4 oct. gène. Il existe quatre régions conservées au cours de l'évolution (CR1-4) qui contiennent plusieurs sites de liaison au facteur de transcription (TF). Les TF qui se lient à ces sites sont indiqués ci-dessus et activent (rouge) ou répriment (bleu) la transcription. DE, amplificateur distal PE, amplificateur proximal PP, promoteur proximal. (B) Réseaux de facteurs de transcription pour les cellules souches pluripotentes (vert), le trophectoderme (jaune) et l'endoderme primitif (extra-embryonnaire) (bleu). Les boucles de rétroaction positive entre Oct3/4, Sox2 et Nanog maintiennent leur expression pour favoriser l'auto-renouvellement continu des cellules ES. Cdx2 est autorégulé et forme une boucle inhibitrice réciproque avec Oct3/4, qui agit pour établir leurs modèles d'expression mutuellement exclusifs. Une boucle de régulation similaire, non encore confirmée, pourrait exister pour Nanog et Gata6. Une combinaison de boucles de rétroaction positive et de boucles inhibitrices réciproques convertit les paramètres d'entrée continus en une distribution de probabilité bimodale, entraînant une ségrégation claire de ces lignées cellulaires (voir le texte pour plus de détails). Coup-tfs et Gcnf agissent comme un système de rétroaction négative pour réprimer complètement Oct3/4.


Résumé

La génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules somatiques adultes par expression ectopique de facteurs de transcription clés est très prometteuse en médecine. Cependant, les techniques actuelles pour induire la pluripotence reposent sur une infection virale et ne sont donc pas, à l'heure actuelle, viables dans un cadre clinique. Ainsi, il est maintenant nécessaire de mieux comprendre la base moléculaire de la pluripotence des cellules souches et la spécification de la lignée afin d'étudier des méthodes alternatives pour induire la pluripotence pour une application clinique. Cependant, la complexité des circuits moléculaires sous-jacents rend cette tâche conceptuellement difficile. Afin de résoudre ces problèmes, nous avons envisagé un modèle informatique de contrôle transcriptionnel de la spécification du destin cellulaire. Le modèle comprend deux sous-circuits interagissant mutuellement : un circuit central de pluripotence constitué d'interactions entre des facteurs de transcription spécifiques aux cellules souches OCT4, SOX2 et NANOG couplé à un circuit de différenciation constitué d'interactions entre des gènes maîtres spécifiant la lignée.

Les commutateurs moléculaires qui résultent des boucles de rétroaction au sein de ces circuits donnent lieu à une séquence bien définie de restrictions génétiques successives correspondant à une cascade de différenciation contrôlée en réponse à des stimuli environnementaux. De plus, nous avons constaté que cette cascade de différenciation est fortement unidirectionnelle : une fois réduits au silence, les facteurs de transcription centraux ne peuvent pas être facilement réactivés. Dans le contexte de la pluripotence induite, cela indique que les cellules différenciées sont solidement résistantes à la reprogrammation vers un état plus primitif. Cependant, notre modèle suggère que dans certaines circonstances, l'amplification des fluctuations de faible niveau de l'état transcriptionnel (le « bruit » transcriptionnel) peut être suffisante pour déclencher la réactivation du commutateur de pluripotence central et la reprogrammation vers un état pluripotent. Cette interprétation offre une explication d'un certain nombre d'observations expérimentales concernant les mécanismes moléculaires de la reprogrammation cellulaire par des facteurs définis et suggère un rôle pour la stochasticité dans la reprogrammation des cellules somatiques à la pluripotence.

Citation: MacArthur BD, Please CP, Oreffo ROC (2008) Stochasticité et mécanismes moléculaires de la pluripotence induite. PLoS ONE 3(8) : e3086. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003086

Éditeur: Nick Monk, Université de Nottingham, Royaume-Uni

A reçu: 13 mai 2008 Accepté: 7 août 2008 Publié : 28 août 2008

Droits d'auteur: © 2008 MacArthur et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué selon les termes de la licence d'attribution Creative Commons, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'auteur et la source d'origine soient crédités.

Le financement: Ce travail a été financé par le numéro de subvention EPSRC EP/C003497/1.

Intérêts concurrents : Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.


Conclusion

Le domaine des cellules souches est un défi multicouche et multidisciplinaire, la combinaison de méthodes d'élimination des tissus avec des techniques d'imagerie 3D a étendu les travaux antérieurs basés sur des techniques d'imagerie 2D conventionnelles et a ouvert la voie à une étude systémique des systèmes de cellules souches et des pathologies qui sous-tendent ce. Les méthodes modernes de nettoyage des tissus ont un potentiel pour de nombreuses études et sont la bonne direction pour se développer dans les méthodes de nettoyage. De plus, ces méthodes combinées à de nouvelles méthodes de microscopie telles que LSFM et OpenSPIM avec un logiciel d'analyse d'images peuvent être appliquées à de nombreuses études, en particulier sur les études de cellules souches, telles que le suivi des cellules souches pour la médecine régénérative. La tendance future vers une combinaison de méthodes d'élimination des tissus et d'imagerie 3D peut exploiter l'application réalisable des systèmes de cellules souches à la fois sur la physiologie et la maladie. Nous espérons que la compréhension des interactions cellulaires et la caractérisation systématique des systèmes de cellules souches pourront guider le développement de nouvelles stratégies de traitement pour les thérapies modificatrices de la maladie et la régénération des défauts tissulaires.


Chapitre 10 - Cellules souches pluripotentes induites versus cellules souches embryonnaires : un aperçu complet des différences et des similitudes

Compte tenu de leur potentiel de différenciation, les cellules souches pluripotentes humaines (y compris les cellules souches embryonnaires, les CSE et les cellules souches pluripotentes induites, iPSC) représentent un outil puissant pour un large éventail d'applications biomédicales et cliniques telles que le modèle de maladie, le dépistage de médicaments, la thérapie cellulaire et médecine régénérative.

D'un point de vue morphologique et fonctionnel, les CSE et les iPSC sont très similaires, mais leur réelle équivalence ne peut être établie par des tests fonctionnels classiques tels que la complémentation tétraploïde en raison de limites éthiques. Par conséquent, depuis leur découverte des iPSCs en 2006, plusieurs groupes ont étudié les profils transcriptomique, épigénomique, protéomique et métabolomique des CSE et des iPSC pour disséquer leurs similitudes et leurs différences et identifier, le cas échéant, une signature moléculaire spécifique de chaque tige pluripotente. ligne cellulaire. Ici, nous rapportons et résumons certaines des études les plus pertinentes basées sur la comparaison moléculaire des CSE et des iPSC. Collectivement, ces études comparatives montrent que bien que les iPSCs soient très similaires aux ESCs, elles sont toujours caractérisées par certaines signatures moléculaires spécifiques qui doivent être étudiées plus avant pour améliorer l'utilisation des iPSCs dans la recherche fondamentale et les milieux cliniques.


Voir la vidéo: Induction of Pluripotency by Defined Factors (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Adalbert

    Entre nous, ils m'ont demandé de l'aide avec les moteurs de recherche.

  2. Winward

    le message Incomparable, m'intéresse :)

  3. Gardazahn

    Que dites-vous si je dis que tous vos messages sont de la fiction?

  4. Samutilar

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