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Structure et réactions des cofacteurs des oxydoréductases comme la ferredoxine

Structure et réactions des cofacteurs des oxydoréductases comme la ferredoxine



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J'ai vu le mot flavoprotéine être utilisé à la place de ferredoxine à quelques endroits et vice-versa. Je n'ai trouvé aucune source qui les mentionne tous les deux ensemble et explique la relation entre eux.

Les exemples que j'ai trouvés sont :
FAD-Flavine Adénine Dinucléotide/Ferrodoxine Adénine Dinucléotide FNR-Flavo protéine NADP Réductase/ Ferrédoxine NADP réductase

Y a-t-il un rapport entre les deux ? Sont-ils identiques ou servent-ils le même objectif ?


Sommaire

Les enzymes catalysant les réactions oxydo-réductrices (oxydoréductases) le font à l'aide de molécules non protéiques (groupes prothétiques ou cofacteurs) au niveau de leurs sites actifs. Les trois principaux types de tels groupes prothétiques ou cofacteurs sont les amas fer-soufre, les dérivés de la flavine (FAD et FMN) et les dérivés nucléotidiques du nicotinamide (NAD et NADP). Les groupes de protéines incorporant ce type de cofacteurs sont souvent désignés par les termes généraux ferredoxines (également protéines fer-soufre), flavoprotéines et oxydoréductases liées au NAD(P), respectivement.

introduction

La grande majorité des enzymes sont des protéines, des chaînes polypeptidiques linéaires repliées en des formes sphéroïdales spécifiques mais irrégulières. En plus d'interagir avec les substrats de réaction, les chaînes latérales d'acides aminés des chaînes polypeptidiques participent aux réactions réelles catalysées par de nombreuses enzymes et, dans de nombreux cas, sont suffisantes pour les propriétés catalytiques des enzymes. Cependant, pour la catalyse de certaines réactions sophistiquées, des molécules non protéiques supplémentaires sont nécessaires - des ions métalliques ou des molécules organiques - connues généralement sous le nom de "co-facteurs", "co-enzymes" ou "groupes prothétiques". C'est le cas des différentes enzymes appelées oxydoréductases, qui catalysent des réactions d'oxydation/réduction, impliquant le transfert d'électrons.

Dérivés nucléotidiques du nicotinamide dans les oxydoréductases liées au NAD(P)

Les cofacteurs les plus fréquemment retrouvés dans les oxydoréductases sont le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP). Le cycle pyridine du cofacteur est l'accepteur d'électrons, et les formes oxydées et réduites sont appelées NAD+ et NADH, respectivement.

[propre diagramme]

Les protéines avec NAD ou NADP lié (de manière non covalente) sont le type le plus courant impliqué dans les oxydo-réductions, et ont des noms systématiques composés de cofacteur, substrat et « oxydoréductase ».
par exemple.
Nom systématique : lactate : NAD+ oxydoréductase
Nom commun : lactate déshydrogénase)

Flavine Nucléotides dans les Flavoprotéines

Les autres cofacteurs courants dans les oxydoréductases sont la flavine adénine dinucléotide (FAD) et la flavine mononucléotide (FMN). L'anneau isoalloxazine est l'accepteur d'électrons, et les formes oxydées et réduites sont appelées FAD (FMN) et FADH2 (FMNH2), respectivement.

[Adapté de la section 14.3 de Berg et al.]

Les protéines contenant FAD ou FMN sont appelées flavoprotéines et sont moins abondantes que les oxydoréductases liées au NAD(P), et quelques-unes d'entre elles effectuent en fait des réactions non redox. Exemple de nomenclature :
Nom systémique : acyl-CoA à chaîne courte : flavoprotéine de transfert d'électrons 2,3-oxydoréductase
Nom commun : acyl-CoA déshydrogénase à chaîne courte

Amas fer-soufre dans les ferrédoxines

Alors que les deux oxydoréductases ci-dessus sont courantes dans le métabolisme intermédiaire, celles contenant des amas fer-soufre (dont certains sont connus sous le nom de ferredoxines) ont tendance à être impliquées dans des réactions plus spécialisées et anciennes, telles que la photosynthèse, marquées dans la question. Le diagramme montre un type particulier (2Fe-2S) d'amas fer-soufre et sa fixation covalente à la ferredoxine par l'intermédiaire de résidus de cystéine. On trouve également des stoechiométries 4Fe-4S, ainsi que d'autres.

Le transfert d'électrons implique des changements dans l'état d'oxydation - Fe(II)/Fe(III) - du fer.

[Adapté de la section 19.3.3 de Berg et al.]

La figure fournit également une bonne illustration de la relation entre un cofacteur et la protéine dans laquelle il réside.

Exemple de nomenclature :
Nom systématique : hydrogène : ferredoxine oxydoréductase
Nom commun : ferredoxine hydrogénase

La situation ici est compliquée par le fait que des clusters fer-soufre se trouvent dans d'autres protéines en plus de celles appelées ferredoxine, y compris certaines oxydoréductases spécialisées impliquées dans la chaîne de transport d'électrons et dans les nitrogénases. Le terme ferredoxine est historique plutôt que systématique.

Différences entre ces cofacteurs d'oxydoréductase

Les rôles spécifiques joués par ces trois cofacteurs dans les oxydoréductases constituent un sujet à part. Cependant, il convient de mentionner qu'une différence importante est leur potentiel de réduction standard, dont le fond biochimique peut être trouvé dans la section 18.2.1 de Berg et al., disponible en ligne.

Ferrédoxine-NADP+ réductase (FNR)

Le transport d'électrons se produit entre les différents cofacteurs dans certaines circonstances, dont la photosynthèse où les électrons sont transférés de la ferredoxine au NADP+. L'enzyme catalysant cela - Ferredoxin-NADP+ réductase - utilise le troisième type de cofacteur - FAD!


La structure d'une oxalate oxydoréductase donne un aperçu du métabolisme microbien des 2-oxoacides

Le pyrophosphate de thiamine (TPP), un dérivé de la vitamine B1, est un cofacteur polyvalent et omniprésent. Lorsqu'il est couplé à des clusters [4Fe-4S] dans des 2-oxoacides:ferredoxine oxydoréductases microbiennes (OFOR), le TPP est impliqué dans la catalyse de réactions redox à faible potentiel qui sont importantes pour la synthèse de métabolites clés et la réduction de N2, H(+) , et CO2. Nous avons déterminé la structure cristalline à haute résolution (2,27 Å) de l'oxalate oxydoréductase (OOR) dépendante du TPP, une enzyme qui permet aux microbes de se développer sur l'oxalate, un acide dicarboxylique largement répandu dans le sol et l'eau douce et responsable de maladie des calculs rénaux chez l'homme. L'OOR catalyse l'oxydation anaérobie de l'oxalate, en récoltant les électrons à faible potentiel pour une utilisation dans la réduction anaérobie et la fixation du CO2. Nous comparons la structure OOR à celle du seul autre membre de la famille OFOR structurellement caractérisé, la pyruvate:ferredoxine oxydoréductase. Cette analyse structurelle côte à côte met en évidence les similitudes et les différences clés qui sont pertinentes pour la chimie de toute cette classe d'enzymes utilisant le TPP.

Les figures

Schéma 1. Réactions redox catalysées par (a)…

Schéma 1. Réactions redox catalysées par (a) PFOR et (b) OOR

Transformation globale réalisée par le…

Transformation globale réalisée par la voie Wood-Ljungdahl en Moorella thermoacétique et connexion à…

Structure et organisation du domaine de…

Structure et organisation du domaine de l'OOR. (a) Dessin au ruban du dimère OOR.…

Voie de transfert d'électrons. (a) Une superposition…

Voie de transfert d'électrons. (a) Une superposition des voies de transfert d'électrons de l'OOR et Da…


Introduction

La décarboxylation oxydative des 2-oxoacides, tels que le pyruvate, le 2-oxobutyrate et le 2-oxoglutarate, est une réaction clé du métabolisme intermédiaire 1 . La plupart des organismes exploitent le pouvoir réducteur de ces substrats pour réduire un porteur d'électrons à faible potentiel et forment simultanément une liaison thioester riche en énergie entre le CoA et le groupe acyle naissant. Dans les mitochondries et de nombreuses bactéries aérobies, les réactions sont catalysées par la 2-oxoacide déshydrogénase dans un complexe multienzymatique composé de trois composants, à savoir E1 (se lie au pyrophosphate de thiamine, TPP), E2 (se lie au lipoamide) et E3 (se lie au pyrophosphate de thiamine, TPP), aux flavines), avec une masse moléculaire de 5 à 6 MDa 2,3 . Chez les archées, les bactéries à ramification précoce et les eucaryotes amitochondriaux, les réactions sont catalysées par une enzyme beaucoup plus simple, la 2-oxoacide:ferredoxine oxydoréductase (OFOR) 4 . La masse moléculaire totale maximale des OFOR est d'environ 270 kDa, mais leurs compositions en sous-unités varient selon les organismes : a2 type (homodimère), (ab)2 type (dimère d'hétérodimères), (abc)2 type (dimère d'hétérotrimères), (abcd)2 type (dimère d'hétérotétramères), ou d'autres types 5,6. Le TPP, l'ion Mg 2+ et le ou les clusters fer-soufre sont des cofacteurs intrinsèques. L'accepteur d'électrons externe est généralement la ferrédoxine (Fd), qui passe d'un état oxydé à un état réduit dans la réaction d'oxydation du 2-oxoacide 7,8,9,10. La formation et la rupture d'un intermédiaire radical libre stable sont la caractéristique unique du mécanisme catalytique de l'OFOR 1,7,11,12,13. L'intermédiaire radical de l'OFOR a été largement caractérisé par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique 14 .

Un homodimérique (un2 type) pyruvate:ferredoxine oxydoréductase de Desulfovbrio africanus (DaPFOR) est le premier OFOR dont les structures cristallines ont été déterminées 15,16. La grande sous-unité a (135 kDa) est composée de sept domaines TPP se lie entre les domaines I et VI, un cluster proximal [4Fe-4S] se lie au domaine VI, et les clusters médians et distaux [4Fe-4S] se lient au domaine V ( Fig. 1a, c). Le domaine V est également appelé domaine Fd intramoléculaire. Les trois clusters [4Fe-4S] sont situés entre le TPP et la surface de la protéine, fournissant une voie électronique du pyruvate à un accepteur d'électrons externe (protéine Fd) (Fig. 1c). Une série de structures instantanées ont été obtenues à l'aide de cette enzyme, et les changements structurels du site actif du complexe de pyruvate n'ayant pas réagi via un intermédiaire tétraédrique partiellement réagi à une forme radicalaire stable à base de TPP ont été visualisés 17,18.

Schémas et similitudes des domaines constituant les OFOR (une). Structures protomères pour le StOFOR2 (b), DaPFOR (c) et MtOOR (). Les domaines correspondants dans StOFOR2, DaPFOR et MtOOR sont affichés dans les mêmes couleurs. Le TPP (cyan) et le cluster [4Fe-4S] (orange) sont représentés par des sphères.

Très récemment, la deuxième structure cristalline d'une enzyme de la famille OFOR, l'oxalate oxydoréductase de Moorella thermoacétique (MtOOR), a été rapporté 19,20. MtOOR contient un TPP et trois clusters [4Fe-4S], et sa structure globale ressemble à DaPFOR (Fig. 1d). MtOOR est un (abc)2 membre de la famille de type OFOR, et ses sous-unités a, b et c correspondent respectivement aux domaines I-II, VI et III-V (Fig. 1a). MtOOR oxyde l'oxalate pour former deux molécules de CO2 et deux électrons à faible potentiel, mais le CoA n'est pas requis pour la réaction.

Nous avons étudié la fonction d'un (ab)2 type OFOR de l'archéon hyperthermophile Sulfolobus tokodaii souche 7 (StOFOR1, Fig. 1a), qui est composée d'une sous-unité a de 70 kDa (STK_23000, correspondant aux domaines de fusion III-I-II) et d'une sous-unité b de 34 kDa (STK_22980, correspondant au domaine VI) 5 . StOFOR1 est l'une des versions les plus simples d'OFOR car il lui manque le domaine de type Fd intramoléculaire (domaine V), fournissant un bon système modèle pour étudier le mécanisme moléculaire de cette classe d'enzymes. Une ferredoxine de type dicluster apparentée contenant du 7Fe provenant du même organisme (StFd, STK_01630) 21 s'est avérée être un accepteur d'électrons efficace, avec un effet apparent Km de 2-3 M 22,23 . StOFOR1 montre une large spécificité de substrat envers les 2-oxoacides, tels que le pyruvate, le 2-oxobutyrate et le 2-oxoglutarate, suggérant qu'il a de multiples rôles dans la glycolyse, la gluconéogenèse, le cycle des acides tricarboxyliques et le métabolisme des acides aminés 5 . Des études de mutation et de marquage d'affinité de StOFOR1 ont identifié les résidus critiques pour la reconnaissance du substrat et la catalyse 24,25,26. Récemment, nous avons proposé une voie de réaction complète de StOFOR1 en mutant les résidus Cys, qui ligaturent le seul cluster [4Fe-4S] 27 . StOFOR1 forme un intermédiaire radical stable lors de l'ajout de pyruvate, comme on l'observe couramment pour d'autres OFOR 28,29. Le cluster [4Fe-4S] dans la sous-unité a était requis pour la décarboxylation oxydative du pyruvate pour produire de l'acétyl-CoA, tandis que le cluster et le CoA n'étaient pas requis pour la décarboxylation non oxydante du pyruvate pour produire de l'acétaldéhyde.

Dans cette étude, nous rapportons les structures cristallines de StOFOR1 et de son paralogue StOFOR2 (STK_24350 et STK_24330), fournissant des informations sur la reconnaissance du substrat et le mécanisme de réaction du (ab)2 type OFOR d'archées et de bactéries extrêmophiles.


Structure cristalline de la phycocyanobiline:ferredoxine oxydoréductase en complexe avec la biliverdine IXalpha, une enzyme clé dans la biosynthèse de la phycocyanobiline

Les phytobilines (récolte de la lumière et pigments photorécepteurs chez les plantes supérieures, les algues et les cyanobactéries) sont synthétisées à partir de la biliverdine IXalpha (BV) par des réductases de biline dépendantes de la ferrédoxine (FDBR). Phycocyanobiline:ferredoxine oxydoréductase (PcyA), l'une de ces FDBR, est une nouvelle classe d'enzymes radicalaires qui ne nécessitent ni cofacteurs ni métaux et réduit en série le groupe vinyle des anneaux D et A de BV en utilisant quatre électrons de la ferredoxine pour produire de la phycocyanobiline , l'une des phytobilines. Nous avons déterminé la structure cristalline de PcyA de Synechocystis sp. PCC 6803 en complexe avec BV, révélant la première structure tertiaire d'un membre de la famille FDBR. PcyA est repliée dans une structure sandwich alpha/bêta/alpha à trois couches, dans laquelle BV dans une conformation cyclique est positionnée entre la feuille bêta et les hélices alpha C-terminales. Le patch basique sur la surface PcyA près de la molécule BV peut fournir un site de liaison pour la ferredoxine acide, permettant le transfert direct d'électrons à BV. L'orientation de BV est définitivement fixée dans PcyA par plusieurs interactions hydrophiles et la forme de la poche de liaison BV de PcyA. Nous proposons le mécanisme par lequel la réduction séquentielle des anneaux D et A est contrôlée, où Asp-105, situé entre les deux sites de réduction, jouerait le rôle central en changeant sa conformation au cours de la réaction. La modélisation d'homologie d'autres FDBR basée sur la structure PcyA correspond bien aux données génétiques et biochimiques antérieures, fournissant ainsi une base structurelle pour le mécanisme de réaction des FDBR.

Les figures

Voie de biosynthèse des pigments bilines…

Voie de biosynthèse des pigments bilines par les FDBR. Chez les plantes supérieures, les algues et les cyanobactéries,…

Structure globale et potentiel électrostatique…

Structure globale et potentiel électrostatique du complexe PcyA-BV. ( une ) Globalement…

Environnement de la liaison BV…

Environnement du site de liaison BV. Un diagramme schématique des interactions entre PcyA…

Mécanisme de réaction proposé de PcyA.…

Mécanisme de réaction proposé de PcyA. ( une ) Vue rapprochée de BV. Omettre…


Discussion

Les structures présentées dans ce travail fournissent des instantanés de la chimie de l'OFOR dépendant du CoA à différentes étapes du cycle de réaction. Ils facilitent l'identification de motifs consensus pour la liaison de CoA dans cette superfamille et permettent d'examiner la base moléculaire par laquelle la liaison de CoA accélère le renouvellement. Pour MontPFOR, la cinétique de désintégration radicalaire du HE-TPP a été déterminée à la fois en l'absence et en présence de CoA ou d'analogues de CoA (21). La liaison de CoA augmente le taux de transfert d'électrons du radical HE-TPP dans les clusters [4Fe-4S] liés à l'enzyme de 10 5 fois (21). Il y a un certain nombre d'explications possibles pour cette accélération dramatique du taux, y compris les suivantes : que la liaison de CoA libère des molécules d'eau liées, conduisant à un effet entropique favorable que la liaison de CoA modifie les potentiels redox d'un ou plusieurs des clusters [4Fe-4S] , favorisant la réduction des amas et/ou que la liaison de CoA favorise le transfert d'électrons vers les amas [4Fe-4S] par répulsion de charge entre le thiolate de CoA chargé négativement et le radical HE-TPP (21, 31).

L'argument entropique a été largement défavorisé lorsqu'il a été découvert que le desulfo-CoA n'augmente pas le taux de désintégration des radicaux HE-TPP, malgré le fait que les constantes de dissociation pour le desulfo-CoA et le CoA ne sont que 10 fois différentes (21). Ainsi, le desulfo-CoA peut se lier, quoique plus faiblement, mais ne peut pas accélérer le transfert d'électrons. En fait, le taux avec desulfo-CoA est plus lent que le taux de base en l'absence de CoA (21). Étant donné que l'on s'attendrait à une libération similaire de molécules d'eau pour la liaison au CoA et au désulfo-CoA, les facteurs entropiques semblaient moins susceptibles d'être le facteur déterminant. Au lieu de cela, ces observations soulignent l'importance du groupe thiol de CoA.

Nos structures sont cohérentes avec l'observation expérimentale selon laquelle le desulfo-CoA peut se lier à MontLa PFOR, car seul un faible pourcentage des interactions CoA-protéine implique la fraction thiol (Fig. 4). La constante de dissociation légèrement augmentée pour le desulfo-CoA peut être due à la perte d'une interaction électrostatique favorable entre le thiolate de CoA et le résidu de site actif chargé positivement Arg112 (Fig. 4E). D'autre part, nos données structurelles ne favorisent pas l'idée que la liaison de CoA accélère le transfert d'électrons en modifiant le potentiel redox d'un cluster [4Fe-4S]. Le CoA entre en contact avec des résidus adjacents à l'amas proximal [4Fe-4S]. Lys456, par exemple, est l'un des résidus chargés positivement les plus proches de cet agrégat, et le squelette de Lys456 lie l'hydrogène du carbonyle à un carbonyle de CoA (Fig. 4). Cependant, il n'y a aucune raison de croire que le desulfo-CoA interagirait différemment avec Lys456, et certainement pas assez différemment pour expliquer une différence de 10 6 de taux de transfert d'électrons. De plus, l'accessibilité au solvant du cluster proximal ne change pas entre les états sans CoA (65 2 ) et les états liés au CoA (61 2 ). Ainsi, ces données structurelles ne peuvent pas exclure qu'un changement de potentiel redox soit la cause de l'augmentation du taux de transfert d'électrons, mais elles ne fournissent pas non plus de support.

La troisième possibilité - que la vitesse d'accélération de l'oxydation radicalaire HE-TPP soit due à un thiolate de CoA chargé négativement venant à proximité de l'adduit TPP - est prise en charge par la structure. Nous constatons que la liaison de CoA place en effet la fraction thiol directement adjacente à TPP la distance entre le S de CoA et C2 de TPP est très proche de 3,4 Å. Une distance aussi courte devrait conduire à une répulsion charge-charge importante. De plus, l'accessibilité au solvant du radical HE-TPP devrait diminuer lors de la liaison de CoA. Sans CoA, le site actif est ouvert et accessible aux solvants, et avec CoA lié, le site actif est fermé. Dans ce site actif fermé, le thiolate de CoA chargé négativement est séquestré, une condition qui devrait renforcer l'effet de répulsion charge-charge, favorisant l'oxydation d'un intermédiaire TPP. Pour ces raisons, nous privilégions un mécanisme dans lequel une forme thiolate de CoA entraîne l'oxydation des radicaux HE-TPP par répulsion charge-charge, qui serait suivie ou simultanée par une attaque nucléophile sur l'adduit TPP, formant de l'acétyl-CoA. La spectroscopie EPR et les études informatiques soutiennent en outre un thiolate au lieu d'un radical thiol comme forme de CoA qui réagit avec HE-TPP (21, 31). En outre, l'élimination facile du groupe acétyle de TPP par CoA devrait déplacer l'équilibre vers la formation de produit (14). La cinétique d'autres OFOR doit être établie pour déterminer si cette accélération de la vitesse due à la liaison du CoA est une caractéristique commune. Les alignements de séquences suggèrent que les interactions de liaison au CoA seront conservées. Compte tenu des similitudes des sites actifs, il semble probable que les OFOR dépendant de la CoA emploieront des mécanismes moléculaires comparables à celui de MontPFOR même si le taux d'accélération lors de la liaison CoA n'est pas aussi dramatique dans tous les cas.

Il est également intéressant de comparer ce mécanisme dépendant de la CoA avec le mécanisme putatif de la seule enzyme indépendante de la CoA connue, l'OOR. Nous avons récemment proposé que MontOOR fonctionne via un mécanisme d'appât et de commutation dans lequel les résidus chargés positivement dans le site actif (l'«appât») attirent et activent l'oxalate de substrat d'acide dicarboxylique pour une attaque nucléophile par le TPP (13). La formation d'un adduit oxalate-TPP serait suivie du « commutateur », dans lequel une boucle dans le site actif (« boucle de commutation ») basculerait à 180 ° pour placer un résidu Asp chargé négativement (Asp116α) directement vers l'adduit du substrat TPP pour conduire décarboxylation et transfert d'électrons (Annexe SI, fig. S11). De cette manière, Asp116α et la boucle de commutation agissent d'une manière similaire au rôle que nous proposons ci-dessus pour le CoA, entraînant le transfert d'électrons par répulsion de charge.

Les similitudes entre MontPFOR et MontOOR ne s'arrête pas là. Comme MontPFOR, MontOOR a un domaine III qui subit un changement de conformation (Fig. 6) (13). Dans PFOR, le domaine III se réorganise pour lier CoA et bascule en position le thiolate de CoA directement adjacent à l'état intermédiaire radical HE-TPP. Vraisemblablement, le domaine III reviendra à une position « dehors » lorsque l'acétyl-CoA est libéré. En OOR, le domaine III bascule pour faciliter la décarboxylation de l'oxalate et la libération de CO2 du site actif, et une boucle appelée "boucle de bouchon" devient désordonnée, ouvrant le site actif. Dans une structure cristalline de MontOOR, le mouvement du domaine III est bloqué par des contacts de réseau et une forme de TPP liée à l'oxalate est piégée. Ainsi, le mouvement du domaine III semble clé pour les deux réactions, mais la direction du domaine et la synchronisation du mouvement ne sont pas les mêmes.

Comparaison du domaine III pour MontPFOR et MontOOR. (UNE) Domaine III de MontPFOR avec CoA lié (sarcelle) et sans CoA lié (gris). Dans la PFOR, le domaine III ancre le pyrophosphate et l'adénine de CoA et bascule vers le site actif, initiant la deuxième étape de transfert d'électrons dans la réaction de PFOR. (B) Domaine III de MontOOR basculé vers le site actif [code d'identification PDB jaune 5C4I (12)] et basculé vers l'extérieur du site actif [code d'identification PDB gris 5EXE (13)]. En OOR, le domaine III contient une boucle de prise logeant Glu154γ. Le mouvement plug-loop facilite la décarboxylation de l'oxalate. 19γ ARGVVM 24γ en OOR correspond spatialement à l'emplacement de la P-loop en PFOR, mais le motif adapte une géométrie différente qui n'a pas suffisamment d'espace pour lier un phosphate.

La structure globale de chaque domaine III est très similaire (Fig. 6), mais le domaine III de MontOOR n'a aucun des motifs de liaison CoA de MontPFOR, et MontPFOR n'a pas assez de résidus pour former une boucle similaire à la boucle de bouchon d'OOR. Ainsi, chaque domaine III affiche les modifications requises pour leurs fonctions spécialisées. On s'attend à ce que MontL'OOR a évolué à partir d'un OFOR dépendant du CoA. La PFOR est probablement une enzyme ancienne, responsable de l'acheminement dans le métabolisme cellulaire de l'acétyl-CoA produit par la voie Wood-Ljungdahl à partir du CO2, une source de carbone que l'on pense abondante dans l'atmosphère primitive. L'OOR a probablement évolué plus tard pour permettre aux microbes d'utiliser l'oxalate comme source de carbone. Le motif de liaison au CoA aurait été perdu au fil du temps, mais la fonction de mouvement de domaine a été conservée et réutilisée. L'OOR semble être une valeur aberrante de la famille, le seul OFOR indépendant de CoA, mais les similitudes dans les mécanismes sont frappantes.

En résumé, ce travail a fourni une vue de la liaison du CoA dans la famille OFOR, une famille d'enzymes microbiennes anciennes qui sont essentielles à la fois à la chimie redox et à la chimie à un carbone. Ces données sur l'OFOR prototypique montrent que la CoA se lie au domaine III et que la liaison de la CoA et le mouvement du domaine III entraînent le transfert d'électrons du TPP, qui est coordonné par les domaines I et IV, vers les clusters du domaine V [4Fe-4S]. En fin de compte, les ferredoxines externes acceptent ces électrons à faible potentiel, qui peuvent être utilisés pour des processus cellulaires tels que la fixation de l'azote (6) et la réduction du soufre (34). Bien que nous ayons décrit ici la chimie du PFOR en termes d'oxydation du pyruvate, il est important de se rappeler que la réaction est réversible, fournissant un moyen de construire des molécules de carbone à chaîne plus longue grâce à l'ajout réducteur de CO2. Les OFOR sont en effet présents dans trois des six voies autotrophes connues du CO2 fixation et ainsi contribuer de manière substantielle au métabolisme global à un carbone. Nous ne savons toujours pas si tous les OFOR sont totalement réversibles. La réversibilité de l'OOR n'a pas été démontrée, par exemple, et nous ne comprenons pas pleinement les conditions qui affectent directionnellement les autres OFOR. Cependant, ces instantanés cristallographiques améliorent considérablement la compréhension moléculaire des OFOR, ce qui facilitera la caractérisation et les efforts d'ingénierie du CO.2 voies de fixation.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Produits chimiques et solvants.

Le chlorure de fer (III), le sulfure de sodium, le 2-mercaptoéthanol et l'acide trifluoroacétique ont été obtenus auprès d'Aldrich. L'éthanedithiol a été acheté auprès de Fluka. Les esters de pentafluorophényle d'acides aminés protégés par un fluorénylméthoxycarbonyle ont été achetés auprès de PerSeptive Diagnostics (Cambridge, MA) à l'exception de l'ester de fluorénylméthoxycarbonyl-l-Arg(2,2,5,7,8-pentaméthyl chromian-6-sulfonyl)-pentafluorophényle, qui a été obtenu à partir de Bachem. Tous les autres produits chimiques et solvants étaient de qualité réactif.

Synthèse peptidique.

Les peptides ont été synthétisés sur un synthétiseur en phase solide MilliGen modèle 9050 à flux continu en utilisant une stratégie de protection standard fluorénylméthoxycarbonyle/But. Les groupes protecteurs de chaîne latérale utilisés étaient les suivants : histidine (tert-butoxycarbonyl) lysine (tert-butoxycarbonyl) acide glutamique (OBu t ) cystéine (trityl) arginine (Pmc). L'extrémité N de la HLH-FdM a été acétylée [1:1 (vol/vol) anhydride acétique/pyridine pendant 30 min]. Les peptides ont été clivés des résines et simultanément déprotégés en utilisant 90:8:2 acide trifluoroacétique/éthanedithiol/eau pendant 2 h. Les peptides bruts ont été précipités et triturés avec de l'éther froid, dissous dans de l'eau (0,1 % d'acide trifluoroacétique), lyophilisés et purifiés jusqu'à homogénéité par phase C inversée.18 HPLC utilisant des gradients aqueux-acétonitrile contenant 0,1 % (vol/vol) d'acide trifluoroacétique. Les peptides étaient homogènes et de composition correcte telle que dosée par HPLC analytique et spectrométrie de masse par désorption laser.

Détermination de la masse moléculaire en solution.

La chromatographie par perméation de gel a été réalisée en anaérobie dans une boîte à gants Plas-Labs (Lansing, MI) en utilisant un Beckman System Gold HPLC avec un détecteur à barrette de diodes équipé d'une colonne Superdex 30 (Pharmacia) éluée à 2 ml/min. Le tampon d'élution (10 mM KPje/100 mM de KCl, pH 8,0) a été désoxygéné à l'aide de cycles successifs de gel-pompe-dégel. La colonne a été standardisée en utilisant de l'aprotinine (6,5 kDa), du glutathion (0,4 kDa), de l'apo-FdM-1,2,3A (1,4 kDa) et l'homodimère de FdM-1,2,3A (2,8 kDa).

[4Fe–4S] 2+/1+ Incorporation.

Le cluster [4Fe-4S] a été incorporé dans l'apopeptide en utilisant des méthodologies de littérature modifiées (31-32). Dans des conditions strictement anaérobies, une solution de 2% (vol/vol) de 2-mercaptoéthanol dans 50 mM de tampon Hepes (pH 8) contenant 20 M de peptide a été équilibrée pendant 2 h pour réduire les disulfures adventices. Une solution à 50 mM de FeCl3 a été lentement ajouté à une concentration finale de 120 M avant l'ajout d'une solution à 50 mM de Na2S à une concentration totale de 120 M. L'ordre d'addition du chlorure ferrique et du sulfure de sodium était sans conséquence sur le rendement de la réaction.

Spectroscopie UV-Visible (UV-Vis).

Les spectres UV-vis ont été enregistrés sur un spectrophotomètre Perkin-Elmer Lambda 2 à l'aide de cellules en quartz de longueurs de trajet de 0,2 et 1,0 cm. Les concentrations de peptides étaient comprises entre 3 et 5 M déterminées par spectrophotométrie en utilisant ɛ280 = 5600 M -1 ·cm -1 pour Trp.

CD Spectropolarimétrie.

Les spectres CD ont été enregistrés sur un spectropolarimètre modèle 62DS d'Aviv Associates (Lakewood, NJ) en utilisant des cellules de quartz rectangulaires de longueurs de trajet de 0,2 et 1,0 cm. Le contrôle thermique a été maintenu par un module thermoélectrique avec un bain d'eau à recirculation réfrigéré Neslab Instruments (Portsmouth, NH) CFT-33 comme dissipateur thermique. Les concentrations de peptides pour les expériences UV-CD étaient comprises entre 5 et 10 M déterminées par spectrophotométrie en utilisant ɛ280 = 5600 M -1 ·cm -1 pour Trp. L'hexadécapeptide était une bobine aléatoire, et le FdM était hélicoïdal (60 %) tel que déterminé en utilisant la spectrométrie CD.

Spectroscopie EPR.

La spectroscopie EPR a été réalisée en utilisant un spectromètre Bruker (Billerica, MA) modèle ESP300E. Le contrôle de la température a été maintenu par un cryostat à flux continu Oxford ESR modèle 900 interfacé avec un contrôleur de température Oxford modèle ITC4. La fréquence a été mesurée par un fréquencemètre Hewlett-Packard modèle 5350B. Paramètres EPR typiques inclus : température de l'échantillon, fréquence micro-ondes 10K, puissance micro-ondes 9,449 GHz, fréquence de modulation 1 mW, amplitude de modulation 100 kHz, 20,0 G et constante de temps, 164 ms. Sauf indication contraire, les concentrations de protéines étaient de 20 uM.

Potentiométrie Redox.

Des titrages redox chimiques ont été effectués dans une cuvette à l'intérieur d'une boîte à gants à atmosphère inerte avec des électrodes de référence en platine et au calomel (33). Les potentiels redox ambiants (mesurés par rapport à l'électrode à hydrogène standard) ont été ajustés par addition d'aliquotes (<1 ul) de dithionite de sodium ou de ferricyanure de potassium. Les titrages ont été effectués dans 50 mM de Hepes (pH 8,0) et 100 mM de KCl. La médiation électrode-solution a été facilitée par les médiateurs suivants à une concentration de 10 μM : rouge neutre, 2-hydroxy-1,4-naphtoquinone, safranine T et phénosafranine. Après équilibrage à chaque potentiel, un échantillon de 300 µl a été prélevé et congelé dans de l'azote liquide, et le spectre EPR a été enregistré. Chaque spectre est présenté comme la différence entre un spectre de référence oxydé (-200 mV) et le spectre réduit. La zone spectrale doublement intégrée a été tracée en fonction du potentiel, et les données ont été ajustées à l'équation de Nernst avec m = 1,0 (fixe), comme indiqué dans le Encart à la figure 5C pour HLH–FdM.

Caractérisation EPR de la maquette de ferredoxine. (UNE) Dépendance à la température du signal EPR hexadécapeptide [4Fe–4S]. Dans les conditions utilisées, c'est-à-dire 1 mW de puissance, la valeur absolue des intensités du signal aux extrema du signal (g = 2,05, 1,95 et 1,89) sont comme indiqué dans le Encart. (B) Dépendance en température du signal EPR [4Fe–4S] de la maquette de ferredoxine–hème. Les intensités de signal sont comme indiqué dans l'encart. Le comportement observé du [4Fe-4S] dans le HLH-FdM est identique à celui de l'hexadécapeptide montré dans UNE. (C) Potentiométrie redox du HLH-FdM. Le titrage redox EPR du couple [4Fe–4S] 2+/1+ est montré. Le potentiel de réduction déterminé de -350 mV par rapport à une électrode à hydrogène normale (Encart) est typique des ferredoxines natives [4Fe-4S].


Oxydoréductases dépendantes du FAD/NADH : de différentes séquences d'acides aminés à des formes de protéines similaires pour jouer une fonction ancienne

Les flavoprotéines oxydoréductases sont membres d'une grande famille de protéines de déshydrogénases spécialisées, qui comprennent la NADH déshydrogénase de type II, les pyridine nucléotide-disulfure oxydoréductases, les ferredoxine-NAD+ réductases, les NADH oxydases et les NADH peroxydases, jouant un rôle crucial dans le métabolisme de plusieurs procaryotes. . Bien que plusieurs études aient été réalisées sur des membres uniques ou des sous-groupes de protéines des flavoprotéines oxydoréductases, une analyse complète des relations structure-fonction entre les différents membres et sous-groupes de cette grande famille de déshydrogénases fait toujours défaut. Ici, nous présentons une analyse comparative structurelle montrant que les flavoprotéines oxydoréductases étudiées ont une structure globale très similaire, bien que les déshydrogénases étudiées soient assez différentes dans les annotations fonctionnelles et la composition globale en acides aminés. L'annotation fonctionnelle différente est attribuée à leur participation à des voies métaboliques spécifiques à l'espèce basées sur la même réaction biochimique, c'est-à-dire l'oxydation de cofacteurs spécifiques, comme le NADH et le FADH.2. Notably, the performed comparative analysis sheds light on conserved sequence features that reflect very similar oxidation mechanisms, conserved among flavoprotein oxidoreductases belonging to phylogenetically distant species, as the bacterial type II NADH dehydrogenases and the mammalian apoptosis-inducing factor protein, until now retained as unique protein entities in Bacteria/Fungi ou Animaux, respectivement. Furthermore, the presented computational analyses will allow consideration of FAD/NADH oxidoreductases as a possible target of new small molecules to be used as modulators of mitochondrial respiration for patients affected by rare diseases or cancer showing mitochondrial dysfunction, or antibiotics for treating bacterial/fungal/protista infections.

Mots clés: antibiotics apoptosis-inducing factor (AIF) dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD) flavoprotein oxidoreductases mitochondrial respiration molecular modeling protein shape thioredoxin reductase (TrxR1) type II NADH dehydrogenase (NDH-2) ubiquinone.

Déclaration de conflit d'intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt. The funders had no role in the design of the study in the collection, analyses, or interpretation of data in the writing of the manuscript, or in the decision to publish the results.


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A structural phylogeny for understanding 2-oxoacid oxidoreductase function

Recent crystal structures shed light on an essential microbial enzyme family.

Conserved structural elements of 2-oxoacid:ferredoxin oxidoreductases revealed.

Molecular basis for oxalate metabolism by ancient enzyme family described.

Phylogeny of enzyme superfamily reveals complex history and unidentified members.

2-Oxoacid:ferredoxin oxidoreductases (OFORs) are essential enzymes in microbial one-carbon metabolism. They use thiamine pyrophosphate to reversibly cleave carbon–carbon bonds, generating low potential (∼−500 mV) electrons. Crystallographic analysis of a recently discovered OFOR, an oxalate oxidoreductase (OOR), has provided a second view of OFOR architecture and active site composition. Using these recent structural data along with the previously determined structures of pyruvate:ferredoxin oxidoreductase, structure–function relationships in this superfamily have been expanded and re-evaluated. Additionally, structural motifs have been defined that better serve to distinguish one OFOR subfamily from another and potentially uncover novel OFORs.


Structure and reactions of the cofactors of oxidoreductases such as ferredoxin - Biology

Experimental Data Snapshot

  • Method: X-RAY DIFFRACTION
  • Resolution: 2.55 Å
  • R-Value Free: 0.251 
  • R-Value Work: 0.183 
  • R-Value Observed: 0.186 

wwPDB Validation   3D Report Full Report

Two functionally distinct NADP(+)-dependent ferredoxin oxidoreductases maintain the primary redox balance of Pyrococcus furiosus.

(2017) J Biol Chem 292: 14603-14616

  • PubMed: 28705933  Search on PubMedSearch on PubMed Central
  • DOI: 10.1074/jbc.M117.794172
  • Primary Citation of Related Structures:  
    5VJ7
  • PubMed Abstract: 

Electron bifurcation has recently gained acceptance as the third mechanism of energy conservation in which energy is conserved through the coupling of exergonic and endergonic reactions. A structure-based mechanism of bifurcation has been elucidated recently for the flavin-based enzyme NADH-dependent ferredoxin NADP + oxidoreductase I (NfnI) from the hyperthermophillic archaeon Pyrococcus furiosus .

Electron bifurcation has recently gained acceptance as the third mechanism of energy conservation in which energy is conserved through the coupling of exergonic and endergonic reactions. A structure-based mechanism of bifurcation has been elucidated recently for the flavin-based enzyme NADH-dependent ferredoxin NADP + oxidoreductase I (NfnI) from the hyperthermophillic archaeon Pyrococcus furiosus. NfnI is thought to be involved in maintaining the cellular redox balance, producing NADPH for biosynthesis by recycling the two other primary redox carriers, NADH and ferredoxin. Les P. furiosus genome encodes an NfnI paralog termed NfnII, and the two are differentially expressed, depending on the growth conditions. In this study, we show that deletion of the genes encoding either NfnI or NfnII affects the cellular concentrations of NAD(P)H and particularly NADPH. This results in a moderate to severe growth phenotype in deletion mutants, demonstrating a key role for each enzyme in maintaining redox homeostasis. Despite their similarity in primary sequence and cofactor content, crystallographic, kinetic, and mass spectrometry analyses reveal that there are fundamental structural differences between the two enzymes, and NfnII does not catalyze the NfnI bifurcating reaction. Instead, it exhibits non-bifurcating ferredoxin NADP oxidoreductase-type activity. NfnII is therefore proposed to be a bifunctional enzyme and also to catalyze a bifurcating reaction, although its third substrate, in addition to ferredoxin and NADP(H), is as yet unknown.


Voir la vidéo: Retrouver léquation à partir des couples oxydantréducteur. Physique-Chimie (Août 2022).