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18.3 : Excrétion d'azote et cycle de l'urée - Biologie

18.3 : Excrétion d'azote et cycle de l'urée - Biologie


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Le cycle de l'urée

Maintenant, nous sommes en mesure de voir ce qui arrive à l'excès de NH3/NH4+ qui s'accumule dans les mitochondries du foie. Si votre alimentation est riche en protéines et donc en acides aminés, puisqu'elles ne peuvent pas être stockées sous forme de protéines en soi, elles sont métabolisées en énergie et les produits métaboliques peuvent être convertis en graisses ou en glucides. Les feuilles en excès d'azote qui se terminent principalement sous forme d'urée pour l'excrétion.

Urée est une molécule très soluble dans l'eau et non toxique que les biochimistes utilisent en laboratoire pour dénaturer chimiquement les protéines (à des concentrations de 3 à 6 M). Les concentrations cliniques d'urée sanguine sont exprimées en urée sanguine Azote (BUN) qui vont de 7 à 20 mg/dL N, ce qui équivaut à 2,5 à 7,1 mm urée. Les taux sériques dépendent principalement de l'équilibre entre la synthèse de l'urée dans le foie et son élimination par le rein. Les concentrations normales d'urée cellulaire devraient être similaires.

L'urée est produite par une voie appelée cycle de l'urée, comme le montre la figure ci-dessous.

arginosuccinate lyase

Les noms des enzymes sont :

  • CPS1 : carbamoyl phosphate synthase I
  • OTC : ornithine transcarbamoylase
  • ASS1 : arginosuccinate synthase 1
  • ASL : arginosuccinase lysase (alias arginosuccinase)
  • ARG1 : arginase

Il est codé par couleur pour désigner les sources des atomes C et N. Un N provient de l'ammoniac (ou indirectement de l'amido N de la glutamine), tandis que l'atome C provient du carbonate. L'autre provient de l'amine de l'aspartate. A noter que 3 ATP sont utilisés pour alimenter le cycle. Notez également le groupe guanidino de l'arginine (NH(NH2+)NH2) est le donneur immédiat des 2 atomes N dans l'étape qui produit l'urée. Sachant qu'un acide aminé était le donneur immédiat des atomes d'azote dans l'urée, vous pourriez facilement le prévoir.

Examinons maintenant certaines des étapes, à commencer par celles qui sont alimentées par l'ATP, qui sont également celles où l'azote est incorporé dans les précurseurs de l'urée.

Carbamoyl phosphate synthase I (CPS I)

Cette enzyme catalyse le premier chemin "engagé" de la voie et fait du réactif qui entre dans le cycle, le phosphate de carbamoyle. Elle nécessite un cofacteur spécifique, le N-acétyl-glutamate (NAG), produit par l'acétylation du glutamate par l'acétyl-COA à l'aide d'une enzyme NAG synthase qui est activée par l'arginine. La réaction ne fait pas partie du cycle mais en fournit l'entrée.

Une version cytosolique de cette enzyme, CPS II, est utilisée pour synthétiser des nucléotides d'arginine et de pyrimidine en utilisant la glutamine comme donneur de NH4+qui réagit avec le carboxyphosphate pour produire du phosphate de carbamoyle. Il n'est pas réglementé par NAG.

CPS I fournit un moyen de former un (C=O)NH2 unité pour l'urée en condensant le bicarbonate et l'ammoniac pour former un carbamate, qui contient un "motif" à haute énergie par rapport à son produit d'hydrolyse. (Remarque : cela n'implique pas que la liaison rompue est de haute énergie, un terme impropre trouvé dans de nombreux livres.) Par conséquent, la réaction est alimentée par 2 ATP en tant que source d'énergie. L'urée est donc une molécule qui "porte" à la fois NH3/NH4+ mais aussi carbonaté.

Un mécanisme de réaction pour la carbamoyl phosphate synthase est présenté ci-dessous.

Les deux molécules de motif à haute énergie (encore une fois en ce qui concerne leurs produits d'hydrolyse) sont protégées d'une hydrolyse non spécifique lorsque l'anhydride mixte passe le long d'un tunnel séquestré vers un site de phosphorylation plus distal dans l'enzyme multimère.

La structure ci-dessous montre 2 ADP et un NAG liés à une chaîne du multimère. Le NAG, l'ADP et les ions (magnésium et potassium) "flottant librement" seraient liés à l'autre monomère qui n'est pas représenté.

​Modèle iCn3D : remplacer

La protéine existe dans un mélange d'équilibre monomère-dimère. Chaque monomère a 1 NAG et 2 ADP, qui représentent les deux sites de liaison différents pour les deux étapes de phosphorylation différentes, comme indiqué dans la réaction ci-dessus. Les deux sites de phosphorylation sont reliés par un tunnel permettant le passage de l'anhydride mixte vers le site de phosphorylation du carbamate. Le NAG est clairement un modificateur allostérique car il n'est pas lié à proximité des sites de phosphorylation. En se liant à la forme apo de l'enzyme, il provoque un grand changement de conformation permettant à une conformation enzymatique compétente avec un tunnel complet de prédominer.

Des images du tunnel pour un monomère de l'enzyme humaine CPS I sont présentées ci-dessous.

En haut : les ADP sont affichés ci-dessous dans un espace avec la couleur CPK. Le tunnel entre les deux sites ADP est surligné en magenta. La molécule jaune est NAG, qui exerce à nouveau son effet d'activation en se liant à un site allostérique, ce qui ouvre effectivement le tunnel.

L'image suivante montre le monomère enzymatique dans une orientation différente avec un tunnel réalisé en utilisant ChExVis : un outil pour l'extraction et la visualisation de canaux moléculaires. La grande sphère rouge et verte montrait les ouvertures de surface.

Le panneau supérieur de la figure ci-dessous montre le rayon en Angstroms du tunnel allant de la sphère rouge à la sphère verte dans l'image ci-dessus. Le panneau inférieur montre une mesure de l'hydrophobie (rouge)/hydrophilie (bleu) des acides aminés entourant le tunnel.

ASS1 : ArginoSuccinate Synthase 1

Un autre ATP est clivé pour entraîner la conversion de la citrulline en arginosuccinate, qui pourrait facilement être clivé à l'étape suivante pour former l'acide aminé arginine.

ASL : arginosuccinase lysase (alias arginosuccinase)

Cette enzyme catalyse une réaction de bêta-élimination, qui peut se dérouler par un mécanisme E2 ou E1. Un mécanisme général mais très abrégé montrant une élimination en deux étapes (E1) passant par un intermédiaire carbanion est illustré ci-dessous.

Le modèle ci-dessous arginosuccinate (AS11) lié dans le site actif de l'un des quatre monomères de l'ASL de Mycobacterium tuberculosis (6IEN). Les résidus catalytiques clés semblent être Ser 262 et His 161 qui agissent comme des acides/bases généraux pour faciliter l'abstraction de protons et leur redonation. Lys 288 semble avoir un pKa atypique (6,0) qui pourrait faciliter la déprotonation de Ser 262, lui permettant d'agir comme une base générale. https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/iub.2000

https://structure.ncbi.nlm.nih.gov/i...qKVpmzdwBzFJL8O

Ornithine Transcarbamyolase

Le mécanisme de réaction ici est assez simple. Le carbamoyl phosphate est un électrophile activé dans lequel le carbonyle C est attaqué par un amino déprotoné de l'ornithine pour produire de la citrulline. Le gène se trouve sur le chromosome X chez l'homme, de sorte que les mutations chez l'homme entraînent un « coma hyperammoniémique » et la mort. Les femelles hétérozygotes peuvent être asymptomatiques ou s'avérer généralement mortelles. Les femelles hétérozygotes sont soit asymptomatiques, soit ont des problèmes dus à des défauts de la biosynthèse de la pyrmidine qui peuvent être atténués par un régime pauvre en protéines avec addition d'arginine.

Arginase

Il existe deux variantes générales de cette enzyme, l'Arginase I est une enzyme cytosolique exprimée dans le foie et est impliquée dans la synthèse de l'urée. L'arginase II est une enzyme mitochondriale et est impliquée plus généralement dans le métabolisme de l'arginine.

"Le substrat L-arginine se lie au site actif, mais ne se coordonne pas directement aux centres d'ions métalliques. L'hydroxyde pontant le métal initie alors une attaque nucléophile sur le groupe guanidinium du substrat, ce qui conduit à la formation d'un intermédiaire tétraédrique. Suite un transfert de proton au groupe aminé partant médié par Asp-128, l'effondrement de l'intermédiaire tétraédrique donne des produits l-ornithine et urée. Dans l'étape finale, pour régénérer le site actif et libérer les produits, une molécule d'eau entre pour ponter le amas de manganèse binucléaire, provoquant le déplacement du produit urée vers un site de coordination terminal sur le manganèse 1. La dissociation du produit facilite l'ionisation de la molécule d'eau pontant le métal pour produire l'ion hydroxyde catalytiquement actif. -solvant est médié par la chaîne latérale de His-141."

Le modèle ci-dessous montre le site actif de l'arginase I humaine (3KV2) en complexe avec l'inhibiteur N(oméga)-hydroxy-nor-L-arginine, dans lequel l'un des guanidino N est remplacé par un OH. Les deux sphères grises sont des ions Mn.

Voici un autre modèle montrant un site actif de l'eau (480) à proximité des ions MN. Les molécules d'eau peuvent agir comme des ligands et lier des ions métalliques à l'état de transition par une liaison covalente coordonnée. Le pKa de l'eau liée passe à une valeur inférieure, ce qui la rend plus susceptible de se déprotoner pour former OH-, qui est à la fois une meilleure base et un meilleur nucléophile. L'eau 480 dans le site actif semble former une liaison covalente coordonnée avec l'ion Mn formant un hydroxyde de site actif qui attaque le groupe guanidino de l'arginine, conduisant à la formation d'urée et d'ornithine.

Une image statique :

​Règlement

Si un excès d'acides aminés/protéines est consommé, un changement dans l'expression des gènes peut augmenter les niveaux des enzymes dans le cycle de l'urée. A court terme, l'activité est régulée par l'enzyme qui donne accès au cycle, la carbamoyl phosphate synthase, dont l'activité est régulée par l'acide N-acétylglutamique et qui catalyse l'étape limitante. Comme indiqué ci-dessus, sans le régulateur allostérique, NAG, l'enzyme est fonctionnellement inactive. Les taux de NAG sont déterminés par l'enzyme NAG synthase, elle-même régulée par l'arginine libre, précurseur immédiat de l'urée dans le cycle. Un supplément d'arginine est administré aux patients atteints d'un trouble de l'urée et son effet se produit probablement par la régulation de la NAG synthase.

Le lien entre le cycle de l'urée et le cycle du TCA

Deux des voies principales que vous avez explorées, les cycles du TCA et de l'urée, ne sont pas des voies linéaires mais cycliques. Quels avantages le « circulaire » offre-t-il par rapport aux linéaires ? Peut-être qu'une comparaison avec les voies économiques offre un indice. Dans une économie linéaire, les matières premières sont utilisées pour produire un produit qui est finalement mis au rebut. Malheureusement, les chemins linéaires dominent notre monde au détriment de notre environnement. Pour réduire les inefficacités d'une économie linéaire et la rendre plus viable et pour réduire les dommages environnementaux et le changement climatique associé, le monde devrait passer à une économie circulaire. Une économie circulaire se caractérise par ce que l'on a appelé les 3R : réduire, réutiliser et recycler. Cela permet d'économiser des ressources et de l'énergie. Ces caractéristiques s'appliquent également aux voies biochimiques circulaires, car des niveaux réduits de métabolites sont réutilisés et recyclés.

Compte tenu de cela, il ne faut pas s'étonner que le cycle de l'urée et du TCA soient liés, d'autant plus que l'acide fumarique est un produit du cycle de l'urée et un métabolite cyclique du cycle du TCA. De plus, l'acide aspartique est à une étape de transaminatine pour l'oxaloacétate.

L'un des azotes de l'urée provient de l'amine de l'aspartate, qui peut être formée par la transamination de l'oxalacétate du cycle du TCA pour former l'aspartate. Le cycle TCA étant un cycle, l'équivalent d'un oxaloacétate doit revenir dans le cycle. Il le fait indirectement à partir du fumarate, un intermédiaire du TCA produit en tant que sous-produit du cycle de l'urée, mais le fumarate est produit dans le cytoplasme. Là, il est converti en malate, qui peut être transporté dans les mitochondries par une protéine de transport, le transporteur mitochondrial 2-oxoglutarate/malate, qui fait partie d'un autre cycle illustré dans la figure ci-dessus, le shunt d'arginosuccinate asparate. L'introduction de fumarate dans la navette se fait par le shunt d'arginosuccinate asparate montré dans la figure ci-dessus. Une fois que le malate pénètre dans la matrice mitochondriale, il peut être directement converti en oxaloacétate.

Notez que ces cycles liés nécessitent la présence à la fois des formes mitochondriales et cytoplasmiques de plusieurs enzymes () et des équilibres entre deux acides aminés clés à travers la division mitochondriale, le gluatamate et l'asparatate. L'une de ces enzymes clés est COMMEpartate Amino Ttransférase (AST), alias glutamate Oxalacétate Transaminase (EU), du nom de la réaction inverse de l'aspartate + α−cétoglutarate ↔ oxalacétate + glutamate. Comme mentionné dans la section du chapitre précédent, cette enzyme clé peut être trouvée dans le sang si le foie est endommagé, de sorte que ses niveaux sont couramment utilisés dans les tests médicaux pour une insuffisance hépatique.

Une autre fonction clé de la navette malate asparate est d'amener dans les mitochondries des "équivalents" réduits de NADH qui est produit dans le cytoplasme à partir de la glycolyse et de l'oxydation des acides gras. Il n'y a pas de transporteur membranaire pour le NAD+ ou NADH. Au lieu de cela, le malate cytoplasmique, produit par la réduction cytosolique de l'oxalacate par le NADH, peut être transporté dans la matrice où il peut reformer le NADH mitochondrial lors de la reconversion en oxalacétate. Le NADH peut ensuite être utilisé pour alimenter la production d'ATP par des voies de transpsort d'électrons/phosphoyrlation oxydative mitochondriale.

D'un point de vue énergétique, quatre liaisons phosphoanhydrides dans 2 molécules d'ATP sont utilisées pour produire une molécule d'urée. Cette grande dépense énergétique est partiellement compensée par l'ATP fabriqué à partir des « équivalents fumarate » qui pénètre dans les mitochondries via les shunts asparate arginosuccinate et asparate arginosuccinate et le passage du NADH par phosphorylation oxydative.


Ontogénie du métabolisme et de l'excrétion de l'azote

Chez de nombreuses espèces de poissons, le schéma initial du métabolisme et de l'excrétion de l'azote est influencé par la prédominance des acides aminés comme combustible principal et par le produit final toxique qui en résulte, l'ammoniac. Les œufs pélagiques de téléostéens marins au moment du frai contiennent un grand bassin de jaune de FAA. Au cours de la maturation finale des ovocytes, les FAA proviennent de l'hydrolyse de protéines spécifiques du jaune et contribuent à l'hydratation de l'œuf. Au début de l'alimentation exogène, les larves de poissons marins ingéreront inévitablement un nouvel apport de FAA avec leurs proies zooplanctoniques et elles peuvent ainsi continuer une dissipation d'énergie à base d'acides aminés malgré une faible capacité protéolytique intestinale. Les taux d'excrétion d'ammoniac augmentent avec le stade de développement, mais l'ammoniac s'accumule également à des niveaux substantiels au moment de l'éclosion. Historiquement, l'excrétion d'urée a été considérée comme d'importance mineure dans les embryons et les larves de téléostéens, mais des niveaux significatifs d'enzymes du cycle de l'urée ont récemment été détectés au cours de l'embryogenèse chez certaines espèces, malgré des niveaux faibles ou non détectables chez les adultes. Les mécanismes d'excrétion d'azote n'ont été étudiés que chez des embryons de truite arc-en-ciel d'eau douce, où l'excrétion d'ammoniac dépend du gradient de pression partielle de NH3. Les recherches futures sur un large éventail d'espèces avec des cycles biologiques et des environnements différents élargiront notre compréhension de l'ontogenèse de l'excrétion d'azote.


Modèles changeants d'excrétion d'azote et de capacité de catabolisme des acides aminés au cours du cycle de vie de la lamproie marine (Petromyzon marinus)

Le poisson sans mâchoire, la lamproie marine (Petromyzon marinus), passe une partie de sa vie en tant que larve vivant dans des terriers et se nourrissant de suspensions (ammocète) avant de subir une métamorphose en un juvénile parasite nageant librement qui se nourrit du sang des poissons. Nous avons prédit que les animaux de ce stade juvénile et parasitaire ont une grande capacité à cataboliser les acides aminés lorsque de grandes quantités de sang riche en protéines sont ingérées. Les taux d'excrétion d'ammoniac (J(Amm)) six fois à 20 fois plus élevés chez les lamproies postmétamorphiques (non nourrissantes) et parasites par rapport aux ammocètes suggèrent que les taux basaux de catabolisme des acides aminés augmentent après la métamorphose. Cela était probablement dû à une plus grande capacité basale de catabolisation des acides aminés dans laquelle il y avait une activité de glutamate déshydrogénase hépatique (GDH) six fois plus élevée chez les lamproies parasites par rapport aux ammocètes. L'immunobuvardage a également révélé que la quantité de GDH était 10 fois et trois fois plus élevée chez les lamproies parasites que chez les ammocètes et les lamproies migratrices en amont, respectivement. Des activités hépatiques plus élevées d'alanine et d'aspartate aminotransférase chez les lamproies parasites suggèrent également une capacité accrue de catabolisme des acides aminés à ce stade de la vie. Contrairement aux lamproies parasites, le pool d'acides aminés libres deux fois plus important dans le muscle des lamproies migratrices en amont a confirmé que cette période de famine naturelle s'accompagne d'une protéolyse importante. La carbamoyl phosphate synthétase III a été détectée à de faibles niveaux dans le foie des lamproies parasites et migratrices en amont, mais il n'y avait aucune preuve de production d'urée extrahépatique (muscle, intestin) via le cycle de l'urée ornithine. Cependant, la détection de l'activité de l'arginase et des concentrations élevées d'arginine dans le foie à tous les stades de la vie examinés laisse entendre que l'hydrolyse de l'arginine est une source importante d'urée. Nous concluons que la métamorphose s'accompagne d'une réorganisation métabolique qui augmente la capacité des lamproies marines parasites à cataboliser par intermittence de grandes charges d'acides aminés résultant de l'ingestion de sang riche en protéines de leurs proies/hôtes. La génération subséquente de squelettes carbonés riches en énergie peut ensuite être oxydée ou retenue pour la synthèse de glycogène et d'acides gras, qui sont des carburants essentiels pour les phases de migration en amont et de frai du cycle de vie de la lamproie marine.


Comment les insectes excrètent les déchets azotés

Les micro-organismes et les animaux invertébrés utilisent des mécanismes plus primitifs et plus simples pour se débarrasser de leurs déchets métaboliques que le système mammifère de la fonction rénale et urinaire. Trois systèmes excréteurs ont évolué dans les organismes avant les reins complexes : les vacuoles, les cellules de flamme et les tubules de Malpighi.

Objectifs d'apprentissage

  • Expliquer comment les vacuoles, présentes dans les micro-organismes, agissent pour excréter les déchets
  • Décrire la manière dont les cellules flammes et les néphridies des vers remplissent les fonctions d'excrétion et maintiennent l'équilibre osmotique
  • Expliquer comment les insectes utilisent les tubules de Malpighi pour excréter les déchets et maintenir l'équilibre osmotique
  • Identifier les déchets courants et les systèmes de déchets

Transport d'urée

La protéine transporteur d'urée (UT)-A1 est exprimée dans la membrane plasmique apicale du canal collecteur médullaire interne terminal (IMCD) (10&# x0201312). Il se compose de 12 domaines transmembranaires reliés par une boucle cytoplasmique (figures 2 et ​ et 3) 3 ) (13). UT-A3 est la moitié N-terminale de UT-A1 et est également exprimé dans l'IMCD, principalement dans la membrane basolatérale, mais peut être détecté dans la membrane apicale après stimulation par la vasopressine (14,15). UT-A2 est la moitié C-terminale de UT-A1 et est exprimé dans la branche descendante mince (11,15&# x0201317). UT-A4 est le 25 % N-terminal de UT-A1 épissé au 25 % C-terminal (11). La protéine UT-B1 est exprimée dans les globules rouges (11,16,17) et dans les cellules endothéliales non fenêtrées caractéristiques des vasa recta descendants, en particulier dans celles qui sont externes aux amas de canaux collecteurs (18).

Transporteurs d'urée le long du néphron. Le dessin et l'histologie montrent les transporteurs d'urée (UT-A1/UT-A3, UT-A2 et UT-B1) le long du néphron. UT-B1 se trouve principalement dans les vasa recta, UT-A2 se trouve dans la branche descendante mince de l'anse de Henle, et UT-A1 (apical) et UT-A3 (basolatéral) se trouvent dans le canal collecteur médullaire interne. Modifié à partir de la référence 12, avec permission.

Les quatre isoformes de la protéine UT-A rénale. UT-A1 est la plus grande protéine contenant 12 hélices transmembranaires. Les hélices 6 et 7 sont reliées par une grande boucle intracellulaire qui, selon des études récentes, est cruciale pour les propriétés fonctionnelles de UT-A1 (1). UT-A3 est la moitié N-terminale de UT-A1, tandis que UT-A2 est la moitié C-terminale de UT-A1. UT-A4 est le quartier N-terminal de UT-A1 épissé au quartier C-terminal. Modifié à partir de la référence 13, avec permission.

Traitement de l'urée le long du néphron

L'urée est filtrée à travers le glomérule et pénètre dans le tubule proximal. La concentration d'urée dans l'ultrafiltrat est similaire à celle du plasma, de sorte que la quantité d'urée pénétrant dans le tubule proximal est contrôlée par le DFG. En général, 30%�% de la charge d'urée filtrée est excrétée. La concentration d'urée augmente dans les premiers 75 % du tubule contourné proximal, où elle atteint une valeur environ 50 % supérieure à celle du plasma (11). Cette augmentation résulte de l'élimination de l'eau, secondaire au transport du sel, et est maintenue dans tout le reste du tubule proximal. Le transport de l'urée à travers le tubule proximal n'est pas régulé par la vasopressine (également appelée hormone antidiurétique) mais augmente avec une augmentation du transport du sodium.

Il existe deux types d'anses de Henlé : les anses longues dans les néphrons juxtamédullaires et les anses courtes dans les néphrons corticaux. La différence est que les néphrons à boucle courte n'ont pas de branche ascendante mince (Figure 4). Toutes les portions d'anses courtes sont perméables à l'urée, mais la direction et l'amplitude du mouvement de l'urée varient avec l'état diurétique de l'animal (11). La concentration d'urée dans le tubule distal précoce (à la fin de l'anse) peut atteindre 7 fois la concentration plasmatique chez les rats antidiurétiques, supérieure à la concentration au début de l'anse. Par conséquent, les segments intermédiaires soutiennent la sécrétion d'urée dans des conditions antidiurétiques. En revanche, au cours de la diurèse hydrique, il n'y a pas de différence dans le mouvement tubulaire proximal de l'urée, alors qu'il y a une réabsorption nette de l'urée dans les anses courtes (11).

Structure du néphron. La caricature représente le cortex (en haut), la moelle externe (au milieu) et la moelle interne (en bas), montrant l'emplacement des différentes sous-structures du néphron étiquetées comme suit : 1, glomérule 2, tubule contourné proximal 3s et 3je, tubule droit proximal dans le néphron à anse courte (3s) et néphron à longues boucles (3je) 4s et 4je, branche descendante fine 5, branche ascendante fine 6s et 6je, membre médullaire ascendant épais 7, macula densa 8, tubule contourné distal 9, canal collecteur cortical 10, canal collecteur médullaire externe 11, canal collecteur médullaire interne initial et 12, canal collecteur médullaire interne terminal. Modifié à partir de la référence 11, avec la permission de l'American Physiological Society.

La figure 5 résume les perméabilités à l'urée pour les différents segments de néphron du rein de rat. La perméabilité à l'urée des tubules contournés proximaux est plus élevée que dans les tubules droits proximaux. Les branches descendantes minces des anses courtes ont une faible perméabilité à l'urée dans la moelle externe, mais il y a une perméabilité à l'urée plus élevée dans les longues anses de la moelle interne. L'augmentation de la concentration d'urée intraluminale dans les membres descendants minces résulte d'un changement du rapport urée:eau en raison de la perte d'eau. Bien qu'il existe des différences considérables dans les valeurs absolues de perméabilité à l'urée mesurées chez différents animaux, il est généralement admis que l'urée est sécrétée dans la lumière des membres minces dans des conditions antidiurétiques (11). De plus, la concentration d'urée est augmentée par la réabsorption d'eau entraînée par l'interstitium médullaire hypertonique, qui résulte du mouvement de l'urée hors de l'IMCD.

Perméabilités à l'urée mesurées dans les différentes sections de néphron d'un rein de rat. CCD, canal collecteur cortical DCT, tubule contourné distal IMCD, canal collecteur médullaire interne mTAL, membre médullaire ascendant épais OMCD, canal collecteur médullaire externe PCT, tubule contourné proximal PST, tubule droit proximal tAL, membre ascendant mince tDL, membre descendant mince. Modifié à partir de la référence 11, avec la permission de l'American Physiological Society.

La concentration d'urée augmente dans les membres ascendants minces (11) en raison du gradient de sécrétion d'urée fourni par la réabsorption d'urée de l'IMCD. Le gradient diminue à mesure que les membres ascendants minces montent, et la force motrice pour déplacer l'urée dans la lumière tubulaire diminue également. La concentration d'urée atteint un niveau équi-osmolaire avec l'interstitium environnant au début de la branche ascendante épaisse médullaire. Contrairement aux membres ascendants minces, les membres ascendants épais ont une perméabilité à l'urée plus faible (11,16). Cependant, il y a une augmentation globale de la concentration d'urée dans la lumière depuis le début du membre ascendant épais jusqu'au tubule contourné distal.

Le tubule contourné distal a une faible perméabilité à l'urée, cependant, une certaine quantité d'urée est réabsorbée dans ce segment de sorte que la concentration en urée diminue d'environ 110 % de la charge filtrée à environ 70 % par la partie initiale du canal collecteur cortical. Les canaux collecteurs corticaux et médullaires externes ont de faibles perméabilités à l'urée (11,16). En revanche, l'IMCD a une perméabilité à l'urée élevée, qui est augmentée par la vasopressine. Il existe une importante réabsorption d'urée de la lumière IMCD dans l'interstitium. Le fluide tubulaire (urine) sortant de l'IMCD contient environ 50 % de la charge d'urée filtrée.

Mécanisme de concentration d'urine

L'urée et les transporteurs d'urée jouent un rôle clé dans les processus médullaires internes pour la production d'urine concentrée. L'importance de l'urée est appréciée depuis près de 8 décennies, depuis Gamble et al. décrit pour la première fois « l'économie d'eau dans la fonction rénale pouvant être rapportée à l'urée » (19). La privation de protéines réduit la capacité de concentration maximale de l'urine et est restaurée par l'infusion d'urée ou la correction de la malnutrition protéique (11,16). Une diminution de la capacité de concentration d'urine maximale est présente chez plusieurs souris génétiquement modifiées dépourvues de différents transporteurs d'urée, y compris les souris knock-out UT-A1/A3, UT-A2, UT-B1 et UT-A2/B1 (11,12,16) . Ainsi, bien que le mécanisme par lequel la moelle interne concentre l'urine reste controversé, un effet dérivé de l'urée ou des transporteurs d'urée doit jouer un rôle (11,16,17).

Le mécanisme le plus largement accepté pour produire de l'urine concentrée dans la moelle interne est l'hypothèse du mécanisme passif, proposée par Kokko et Rector (20) et Stephenson (21). Le mécanisme passif exige que la concentration d'urée interstitielle médullaire interne dépasse la concentration d'urée dans la lumière du membre ascendant mince. Si une quantité insuffisante d'urée est délivrée à la moelle interne profonde, la capacité de concentration de l'urine est réduite car les gradients chimiques nécessaires à la réabsorption passive du NaCl à partir du membre ascendant mince ne peuvent pas être établis. Le principal mécanisme d'administration d'urée dans l'interstitium médullaire interne est la réabsorption d'urée à partir de l'IMCD terminal (22). La réabsorption de l'urée est médiée par les protéines de transport d'urée UT-A1 et UT-A3 (11,16,17). La figure 2 montre l'emplacement des principales protéines de transport de l'urée qui sont impliquées dans la concentration dans l'urine.

Le transporteur d'urée UT-B1 joue également un rôle important dans la concentration urinaire (11). La protéine UT-B1 est exprimée dans les globules rouges et les vasa recta descendants (11). UT-B1 est l'antigène de groupe sanguin Kidd, un antigène de groupe sanguin mineur. Les personnes dépourvues d'UT-B1 sont incapables de concentrer leur urine 𾠀 mOsm/kg H2O, même après privation d'eau et administration de vasopressine (23). Les souris knock-out UT-B1 ont également une capacité de concentration d'urine maximale réduite par rapport aux souris de type sauvage (24). Ces données suggèrent que le transport de l'urée dans les globules rouges est important pour un échange à contre-courant efficace, qui est nécessaire pour une concentration urinaire maximale (25). Lorsque les globules rouges descendent dans la moelle, ils accumulent de l'urée pour rester en équilibre osmotique avec l'interstitium médullaire. Au fur et à mesure que les globules rouges montent dans les vasa recta ascendants, ils doivent perdre de l'urée. En l'absence d'UT-B1, les globules rouges sont incapables de perdre l'urée assez rapidement et de retirer une partie de l'urée de la moelle et dans la circulation sanguine, réduisant ainsi l'efficacité de l'échange à contre-courant et la capacité de concentration de l'urine (25).

Régulation rapide des protéines de transport d'urée

Vasopressine.

La vasopressine régule les deux transporteurs d'urée IMCD UT-A1 et UT-A3. La vasopressine augmente la phosphorylation et l'accumulation apicale dans la membrane plasmique de l'UT-A1 et de l'UT-A3 (14,26). La vasopressine phosphoryle les sérines 486 et 499 dans UT-A1, et les deux doivent être mutées pour éliminer la stimulation de la vasopressine (27). La vasopressine augmente le transport de l'urée, la phosphorylation du transporteur d'urée et l'accumulation apicale de la membrane plasmique par deux voies dépendantes de l'AMPc : la protéine kinase A et la protéine d'échange activée par l'AMPc (28) (Figure 6). Les souris génétiquement modifiées dépourvues d'UT-A1 et d'UT-A3 ont une capacité de concentration d'urine réduite, ont une teneur en urée interstitielle médullaire interne réduite et manquent de transport d'urée stimulé par la vasopressine dans leurs IMCD (29).

Transport d'urée à travers une cellule IMCD. La vasopressine se lie au V2R, situé sur la membrane plasmique basolatérale, et active le α sous-unité de la protéine G hétérotrimérique Gsα. L'activation de la protéine G stimule AC pour synthétiser l'AMPc. L'augmentation de l'AMPc intracellulaire stimule plusieurs protéines en aval, notamment la PKA et l'Epac, qui phosphorylent l'UT-A1 et augmentent son accumulation dans la membrane plasmique apicale. L'urée pénètre dans la cellule IMCD via UT-A1 et sort sur la membrane plasmique basolatérale passant par UT-A3. AC, adénylyl cyclase Epac, protéine d'échange directement activée par les AMPc Gs, sous-unité P stimulatrice de la protéine G, phosphate PKA, protéine kinase A V2R, V2 récepteur de la vasopressine. Modifié à partir de la référence 13 avec permission.

Hypertonie.

Le transport de l'urée à travers l'IMCD est régulé indépendamment par l'hypertonie (11,16,17). La perméabilité à l'urée augmente rapidement dans les IMCD perfusés lorsque l'osmolalité est augmentée, même en l'absence de vasopressine (30,31). La vasopressine et l'hyperosmolalité ont un effet stimulant additif sur la perméabilité à l'urée (11,16,17). L'hyperosmolalité, similaire à la vasopressine, augmente la phosphorylation et l'accumulation dans la membrane plasmique de l'UT-A1 et de l'UT-A3 (14,26,32,33). Cependant, l'hyperosmolalité et la vasopressine signalent par différentes voies : l'hyperosmolalité passant par augmentation de la protéine kinase Cα et calcium intracellulaire, et vasopressine passant par augmente l'adénylylcyclase (11,16,17). L'hyperosmolalité ne stimule pas le transport de l'urée dans la protéine kinase Cα souris knock-out et elles ont un défaut de concentration de l'urine (31,34,35).

Réglementation à long terme des transporteurs d'urée

Vasopressine.

La vasopressine régule les transporteurs d'urée IMCD à long terme par des changements dans l'abondance des protéines (11,16,17). L'administration de vasopressine pendant 2 semaines à des rats présentant un manque congénital de vasopressine et, par conséquent, un diabète insipide central, augmente l'abondance de la protéine UT-A1 dans la moelle interne (36). La suppression de la vasopressine endogène par des rats chargés en eau pendant 2 semaines diminue l'abondance de la protéine UT-A1 (36). L'augmentation de l'abondance de la protéine UT-A1 après l'administration de vasopressine correspond à l'évolution dans le temps de l'augmentation de la teneur en urée médullaire interne après l'administration de vasopressine à des rats qui ont un manque congénital de vasopressine. L'expression de la protéine UT-A3 est diminuée chez les rats chargés en eau pendant 3 jours et augmentée chez les rats limités en eau pendant 3 jours. L'effet de la vasopressine sur l'abondance d'UT-B1 n'est pas clair car certaines études montrent une augmentation et d'autres une diminution (11,16,17).

Régimes pauvres en protéines.

Rats fed a low-protein diet for at least 2 weeks have a decrease in the fractional excretion of urea (37). This results, at least in part, from the functional expression of vasopressin-stimulated urea permeability in the initial IMCD, a segment in which it is not normally present, and an increase in UT-A1 protein abundance (11,16,17). The effect of a low-protein diet on the other urea transporters has not been studied.

Adrenal Steroids.

Glucocorticoids increase the fractional excretion of urea (38). Despite this increase, serum urea nitrogen (SUN) increases in patients given glucocorticoids. This indicates that the increase in urea excretion is insufficient to offset the increase in production in patients given glucocorticoids.

Adrenalectomy, which eliminates both glucocorticoids and mineralocorticoids, produces a urine concentrating defect, although the mechanism is unknown (11). Adrenalectomy increases UT-A1 protein abundance and urea permeability in rat terminal IMCDs (39). Administering dexamethasone to adrenalectomized rats decreases UT-A1 protein abundance and urea permeability (39). Both UT-A1 and UT-A3 protein abundances decrease in rats given dexamethasone (40). The decrease in urea transporters in dexamethasone-treated rats could explain the increase in the fractional excretion of urea because a reduction in urea transporter abundance could result in less urea being reabsorbed and, thus, more being excreted.

Administering mineralocorticoids to adrenalectomized rats also decreases UT-A1 protein abundance in the inner medulla (41). This decrease can be blocked by spironolactone, a mineralocorticoid receptor antagonist (41). Both mineralocorticoid and glucocorticoid hormones appear to work through their respective receptors because spironolactone does not block the decrease due to dexamethasone (41).

Acidosis.

Metabolic acidosis is a common complication of renal failure. Acidosis increases protein degradation and shifts the nitrogen and urea loads within the kidney (42). UT-A1 protein abundance increases in the inner medulla of acidotic rats, which may represent compensation for the loss of kidney concentrating ability (increase in urine volume and a decrease in urine osmolality) that occurs during acidosis (43).

Hypokalemia.

Prolonged hypokalemia can cause a decrease in urine concentrating ability (44). The abundance of UT-A1, UT-A3, and UT-B1 proteins in the inner medulla is reduced in rats fed a potassium-restricted diet (44,45). UT-A2 protein abundance was reduced in one study but increased in another (44,45). The reason for the different findings is unclear.

In summary, renal urea transport and urea transport proteins mediate a central role in the urine concentrating mechanism. Urine concentrating defects have been demonstrated in several urea transporter knockout mice (11,12,16). In many clinical conditions associated with altered urine concentrating ability or water homeostasis, changes in urea excretion and urea transporters may be contributory factors.


Matériaux et méthodes

Experimental animals

Laboratory-reared Rivulus marmoratus Poey were maintained as described previously (Frick and Wright, 2002). Wild-caught fish were collected from Twin Cays and Little Lagoon Cay, near Dangriga, Belize, and held as described previously (Frick and Wright, 2002).

Experimental protocol

Excretion during emersion

Two separate experiments were performed on laboratory-reared fish. (i) Fish were exposed in air for 12 h (N=18) and then returned to water excretion rates were measured every 2 h following emersion and compared with rates measured ‘pre-emersion’. (ii) Fish were exposed in air for 11 days (N=6), and excretion rates were measured during emersion and compared with rates measured in fish under control conditions (immersion).

Under air-exposed conditions, the fish were removed from water and placed onto a moist substratum (filter paper and cotton batting saturated with approximately 2 ml of 16 ‰ sea water). In experiment ii, the amount of urea and ammonia excreted over a 24 h period was measured after 1, 3, 5, 7, 9 and 11 days of air-exposure and under control conditions. Technical control experiments were performed in which a known amount of ammonia and urea were placed on the filter paper and left for 24 h to determine whether there was any loss (or gain) due to bacterial contamination or other factors. The filter paper and cotton were collected after 24 h, and the water was carefully extracted.

Ammonia volatilization

To measure the amount of ammonia excreted through volatilization, an apparatus was constructed similar to that used by Davenport and Sayer (1986). Air was first bubbled through acidified distilled water (ADW) (pH 6) to remove any ammonia in the air supply. The air was then passed into a second chamber containing the fish on filter paper saturated with 16 ‰ sea water at pH 6. The air exiting the second chamber was bubbled through a third chamber containing 0.5 mol l –1 KOH, which removed CO2. Air from the third chamber was bubbled through five separate acid traps each containing ADW to ‘fix’ any ammonia present in the air. Preliminary studies showed that five acid traps were necessary to ensure maximal recovery of the volatilized ammonia. Control trials were run in which filter paper was saturated (i) with ammonia-free, pH 6, 16 ‰ sea water or (ii) with a known amount of ammonia (100 μmol l –1 ) in 16 ‰ sea water, pH 6. These control trials established that no ammonia volatilization was measured in the absence of a fish.

Routes of excretion

To determine the sites of JAmm et JUrea in laboratory-reared R. marmoratus, a Plexiglas chamber (see Wells and Pinder, 1996) was used to separate the anterior (representing primarily branchial excretion) and posterior (cutaneous, kidney and intestinal excretion) of the fish. Fish were lightly anaesthetized in 2-phenoxy-ethanol (1.2 ml l –1 ) to reduce stress during the restraining period. The head end of the fish was then positioned through a small hole (approximately 5 mm in diameter) in a 3 cm×3 cm piece of dental dam, forming a tight seal around the fish just posterior to the operculum. Under control conditions (N=7), 4 ml of 16 ‰ sea water was placed into both the front and back ends of the chamber. In a separate group of fish, moist pieces of cotton were placed in the front and back ends of the chamber during air-exposure (N=7). After 1 h, water or cotton/filter samples were collected for later determination of ammonia and urea concentrations. In a preliminary experiment, to test for leakage across the dental dam barrier, a dye was placed in one half of the chamber and distilled water in the other half. Absorbance at 660 nm was used to quantify leakage. There was negligible (<1 %) leakage between the anterior and posterior portions of the chamber.

Nitrogen metabolism

Laboratory-reared fish held under air-exposed and control conditions were killed after 1, 4 and 10 days. Tissue samples were stored at –80°C and analysed within 3 weeks. Tissue ammonia, urea and FAA levels and enzyme activities were measured in whole-body samples (N=6) as adequate amounts of individual tissues were not available because of the small size of the fish and the limited number of fish available. Although whole-animal samples include both intracellular and extracellular fluid, values represent mostly tissue intracellular concentrations (approximately 95 % of volume).

Amphibious fish typically experience water loss during emersion, which could concentrate tissue solutes (e.g. ammonia, urea or FAAs). Wet mass measurements were taken in laboratory-reared fish after 1, 3 and 10 days of air-exposure (N=7) and under control conditions (N=7) to test for significant mass loss.

Analytical techniques

Ammonia and urea analyses

The concentrations of ammonia and urea levels in the water were determined as described previously (Frick and Wright, 2002). Ammonia levels in the acid traps of the volatilization experiment were determined using the method of Verdouw et al. (1978).

Tissue ammonia and urea levels of whole fish were determined as described previously (Frick and Wright, 2002) and were expressed as mmol N g –1 wet mass. All spectrophotometric measurements were performed using a Perkin Elmer UV/VIS spectrophotometer (Lambda 2) (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT, USA).

Tissue amino acid analysis

Tissue FAA levels were measured using high-performance liquid chromatography (HPLC) (Hewlett-Packard series II 1090 liquid chromatograph), as described previously (Frick and Wright, 2002).

Enzyme analysis

Frozen tissues (whole fish) were ground to a fine powder under liquid nitrogen. The powdered tissue was then diluted 23-fold with extract buffer (50 mmol l –1 Hepes buffer, pH 7.5, 50 mmol l –1 KCl, 1 mmol l –1 dithiothreitol and 0.5 mmol l –1 EDTA), homogenized on ice (Euro Turrax T20b homogenizer) for three bursts of 10 s and then sonicated (Vibracell CV18 2368) for three bursts of 10 s. The homogenate was centrifuged (14 000 g, 4°C) for 10 min, and the resulting supernatant was used to measure the activities of the enzymes Ala-AT, Asp-AT, GDH, ME, CCO and CS. For the OUC enzymes (CPSase, OTCase and ARG) and the accessory enzyme GS, an additional step was carried out. The resulting supernatant was passed through a Sephadex G-25 column (10 ml) equilibrated with extract buffer to remove low-molecular mass (<5000 g mol –1 ) substrates and effectors (Felskie et al., 1998). The protein concentration of the extract was measured before and after filtration to calculate the dilution factor of the column.

The activities of OUC enzymes were measured as described previously: OTCase by Wright et al. (1995), ARG by Felskie et al. (1998) and GS by Shankar and Anderson (1985). CPSase activity was determined using the reaction mixture described by Chadwick and Wright (1999), and [ 14 C]carbamoyl phosphate production was measured using the technique described by Anderson et al. (1970). OTCase, ARG, GS and CPSase activities were measured at 27°C for consistency with methods in the literature. The limits of detection for these assays were estimated to be 0.04 nmol g –1 min –1 for CPSase, 0.01 μmol g –1 min –1 for OTCase and ARG and 0.08 μmol g –1 min –1 for GS (Chadwick and Wright, 1999).

The activities of both CPSase II and III were measured. CPSase II requires glutamine as a substrate, does not require N-acetylglutamate, AGA (nor is it affected by the addition of AGA) and is inhibited by UTP. CPSase III requires glutamine and AGA as substrates, and is not inhibited by UTP. Thus, to differentiate between CPSase II and III, activities were measured in the presence of glutamine alone (CPSase II), glutamine+AGA (CPSase II and III) and glutamine+AGA+UTP (CPSase III). To assess the ability of these fish to utilize ammonia as a substrate in the OUC rather than glutamine (as reported in H. fossilis) (Saha et al., 1997), preliminary tests were run using 5 mmol l –1 NH4Cl in place of glutamine. As activities in the presence of ammonia were relatively low compared with activities in the presence of glutamine, only glutamine was used as a substrate in subsequent experiments.

GDH, Ala-AT, Asp-AT, CS and ME were measured at 25°C, as described by Singer and Ballantyne (1991). CCO activity was measured at 25°C using the assay of Blier and Guderley (1988). The protein concentrations of extracts were measured using the method of Bradford (1976) with bovine serum albumin as a standard.

Statistical analyses

All data are presented as means ± standard error of the mean ( s.e.m .). Single-factor analyses of variance (ANOVAs) were used to examine the differences between control and air-exposed values for tissue analysis (levels of urea and ammonia and enzyme activities) and excretion rates. Amino acid data were analyzed using a General Linear models procedure using the SAS system (version 6.12 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). The Tukey test was used to determine where differences were significant (P⩽0.05) between treatment and control fish. Assumptions for normality were verified by generating appropriate residual plots. Data transformations (logarithmic, square root and inverse square root) were used when appropriate to meet the above assumptions.


18.3: Nitrogen Excretion and the Urea Cycle - Biology

Sixteen male Holstein calves were assigned to four treatments at 3 days of age. Treatments were whole milk, an all milk protein commercial replacer, a whey protein milk replacer, and a high fat whey protein milk replacer all fed at 10% of body weight. All treatments were isonitrogenous. Chopped wheat straw was fed ad libitum. Calves underwent preputial re-section for collection of urine. Five-day nitrogen balance trials were at 1, 5, 9, and 13 wk. Basic nitrogenous components of urine were separated with an amino acid analyzer. Analysis of body weights and straw intakes by balance period showed no differences. Nitrogen balance was lower for the whey protein and high fat milk replacers than for milk. Nitrogen digested was lower for commercial and whey protein milk replacers than for milk. Nitrogen retained was lower for the commercial, whey protein, and high fat milk replacers than for milk. Nitrogen excretion in urine and feces was greater for the commercial milk replacer treatment. The excretion of ornithine, arginine, lysine, 1-methylhistidine, and 3-methylhistidine was greater in the urine of the commercial and high fat milk replacer groups than in the urine of the milk group. Several ninhydrin positive compounds also were increased. Quantitative measurement of excreted basic nitrogenous compounds in urine may improve the evaluation of nitrogen metabolism in balance experiments.

Nutrition Institute, Ruminant Nutrition Laboratory. Beltsville, MD 20705.

Nutrition Institute, Dairy Food Nutrition Laboratory, Beltsville, MD 20705.


Résumé

In living organisms, nitrogen arise primarily as ammonia (NH3) and ammonium (NH4 + ), which is a main component of the nucleic acid pool and proteins. Although nitrogen is essential for growth and maintenance in animals, but when the nitrogenous compounds exceeds the normal range which can quickly lead to toxicity and death. Urea cycle is the common pathway for the disposal of excess nitrogen through urea biosynthesis. Hyperammonemia is a consistent finding in many neurological disorders including congenital urea cycle disorders, reye’s syndrome and acute liver failure leads to deleterious effects. Hyperammonemia and liver failure results in glutamatergic neurotransmission which contributes to the alteration in the function of the glutamate-nitric oxide-cGMP pathway, modulates the important cerebral process. Even though ammonia is essential for normal functioning of the central nervous system (CNS), in particular high concentrations of ammonia exposure to the brain leads to the alterations of glutamate transport by the transporters. Several glutamate transporters have been recognized in the central nervous system and each has a unique physiological property and distribution. The loss of glutamate transporter activity in brain during acute liver failure and hyperammonemia is allied with increased extracellular brain glutamate concentrations which may be conscientious for the cerebral edema and ultimately cell death.


Urea Production and Metabolism

Clinical Uses

Uremic symptoms are principally due to the accumulation of ions and toxic compounds in body fluids (79). Because protein-rich foods are the major source of these waste products, CKD can be considered a condition of protein intolerance. Indeed, it has been known since at least 1869 that restricting the amount of protein in the diet of patients with kidney diseases improves their uremic symptoms (80). More recently, we learned that dialysis efficacy is reflected in the removal of urea because changes in urea accumulation reflect changes in accumulated metabolic waste products. Again, this is not a new concept: The link between dietary protein and urea has been recognized since at least 1905, when Folin reported that urea excretion varies directly with different levels of dietary protein (81). These relationships were elegantly documented by Cottini et al. (Figure 12), who fed patients with CKD different amounts of protein (expressed on the abscissa as nitrogen intake because 16% of protein is nitrogen) (82). With low levels of dietary protein (e.g., approximately 12 g protein/d equivalent to approximately 2.5 g nitrogen), nitrogen balance was negative, indicating that this level of dietary protein causes progressive loss of protein stores. When the diet was raised >4 g nitrogen/d, nitrogen balance became positive, signifying that protein stores were being maintained. With progressively more dietary protein, nitrogen balance remained positive but changed minimally. Instead, when dietary protein was above the level required to maintain nitrogen balance and protein stores, it was used to make urea. Clearly, urea production reflects the level of protein in the diet and the risk of developing complications of uremia. In addition, a high-protein diet invariably contains excesses of salt, potassium, phosphates, and so forth (83). The clinical problems that arise from high-protein diets in patients with CKD were recently highlighted in reports concluding that increases in salt intake or serum phosphorus will block the beneficial influence of angiotensin-converting enzyme inhibitors to delay the progression of CKD (84,85).

Urea excretion in adult humans with varying degrees of kidney malfunction fed milk, egg, or an amino acid mixture: assessment of nitrogen balance. Modified from reference 82, with permission.

Urea has special properties that can be used to evaluate the severity of uremia or the degree of compliance with prescribed changes in the diet. These properties include the following: (1) a very large capacity for hepatic urea production from amino acids, (2) urea is the major circulating pool of nitrogen and it crosses cell membranes readily so there is no gradient from intracellular to extracellular fluid under steady-state conditions, and (3) the volume of distribution of urea is the same as water (the urea space is estimated as 60% of body weight) (86–88).

One clinically useful calculation is the steady-state SUN (SSUN), which reflects the severity of uremia because it estimates the degree of accumulation of protein-derived waste products. The SSUN calculation is useful because uremic symptoms are unusual when SSUN is <70 mg/dl.

The requirements for the calculation are that the patient with CKD is in the steady state (i.e., his or her SUN and weight are stable) and urea clearance in liters per day is known. Using the equation below, the amount of dietary protein that will yield a SSUN of 70 mg/dl can be calculated as: The following steps are used to calculate the SSUN. First, the prescribed dietary protein in grams per day is converted into dietary nitrogen by multiplying the grams per day of dietary protein by 16%. Second, the nonurea nitrogen in grams of nitrogen excreted per day is calculated as the excretion of all forms of nitrogen except urea. This amount is approximated as 0.031 g nitrogen/kg per day multiplied by the nonedematous, ideal body weight (4,89). Third, the nonurea nitrogen is subtracted from the nitrogen intake to obtain the amount of urea nitrogen that must be excreted each day in the steady state. Finally, dividing the urea nitrogen excretion in grams per day by the urea clearance in liters per day yields the SSUN in grams per liter.

For example, consider a 70-kg adult with a urea clearance of 14.4 L/d (or 10 ml/min) who is eating 76 g protein/d. His SSUN (in grams per liter) is calculated from the following: 12.2 g/d dietary nitrogen−(0.031 g nitrogen/kg per day times 70 kg). The result is divided by the urea clearance in liters per day and multiplied by 100 to convert SSUN 0.69 g/L to 69 mg/dl.

This calculation arises from the demonstration that in the steady state, the production of urea is directly proportional to the daily protein intake (Figure 12). The only other assumption is that urea clearance is independent of the plasma urea concentration, which is reasonable for patients with CKD. The key concept is that steady-state concentrations of nitrogen-containing waste product produced during protein catabolism will increase in parallel to an increase in the SSUN (4,82,89). By varying the amount of dietary protein, changes in the diet can be integrated with different values of the SSUN. As shown in Table 1, similar concepts can be used to determine whether a patient is complying with the prescribed protein content of the diet (81,86,88).

Estimation of protein intake from urea metabolism

These examples emphasize that the net production of urea in patients with CKD (also known as the urea appearance rate) can be used to estimate protein intake (4,82,89). For dialysis patients, the same relationships have been labeled as “urea generation” or the “normalized protein catabolic rate” (nPCR). Obviously, the nPCR equals the net urea production rate or the urea appearance rate except that it is not expressed per kilogram of body weight. However, the designation nPCR is misleading because the rates of protein synthesis and “catabolism” are far greater than the protein catabolic rate: The nitrogen flux in protein synthesis and degradation amounts to 45–55 g nitrogen/d, equivalent to 280–350 g protein/d (1). The principle of conservation of mass, however, indicates the difference between whole-body protein synthesis and degradation does estimate waste nitrogen production.

Urea Nitrogen Reutilization

Discussion of urea metabolism would be incomplete without addressing urea degradation. It is calculated from the plasma disappearance of injected [ 14 C]urea or [ 15 N]urea (88,90) and averages about 3.6 g nitrogen/d in both normal individuals and patients with uremia. The 3.6 g nitrogen/d arises from degradation of urea by ureases of gastrointestinal bacteria thereby supplying ammonia directly to the liver (88). Because this source of nitrogen could be used to synthesize amino acids and ultimately protein, the degradation of urea has been intensively studied (91). The evidence negates the hypothesis that urea degradation is nutritionally important. First, the amount of urea degraded has been expressed as an extrarenal urea clearance by dividing the rate of urea degradation by the SSUN. In normal adults, the extrarenal urea clearance averages approximately 24 L/d if this value were present in patients with CKD and a high SUN, the amount of ammonia derived from urea would be very high (79,88). However, the quantity of ammonia arising from urea in patients with CKD is not significantly different from that of normal individuals, indicating that the extrarenal clearance of urea in patients with CKD must be greatly reduced the mechanism for this observation is unknown (88).

Results from other testing strategies lead to the conclusion that it is unlikely that urea degradation contributes a nutritionally important source of amino acids to synthesize protein. We fed patients with CKD a protein-restricted diet and measured the turnover of urea using [ 14 C]urea. The results were compared with those obtained in a second experiment in which patients received neomycin/kanamycin as nonabsorbable antibiotics in order to inhibit bacteria that were degrading urea. In roughly half of the patients, antibiotic administration blocked urea degradation but there was no associated increase in urea appearance. This result means that ammonia arising from degradation is simply recycled into urea production and hence does not change urea appearance (90). We also addressed the hypothesis that removal of nitrogen released by urea degradation would suppress synthesis of amino acids and thereby worsen Bn. In this case, the hypothesis was rejected because inhibiting urea degradation with nonabsorbable antibiotics actually improved Bn (92). Finally, Varcoe et al. measured the turnover of urea and albumin simultaneously and concluded that the contribution of urea degradation to albumin synthesis was minimal (93).

The possibility that ammonia from urea degradation is used to synthesize amino acids was recently examined in hibernating bears (94). The authors noted that hibernating bears have very low values of SSUN (approximately 5–10 mg/dl) despite a decrease in GFR and they suggested that SSUN was low because urea was being used to synthesize amino acids. This finding would contribute to another oddity of hibernating bears, namely that their muscle mass and other stores of protein are relatively “spared” from degradation. Why the metabolism of hibernating bears might differ from that of patients with CKD is unknown and we applaud the investigators who gathered the information as experimenting on bears is quite tricky, even if they are hibernating.

Is Urea Toxic?

Because excess dietary protein produces uremic symptoms and because urea is the major source of circulating nitrogen, the potential for toxic responses to urea have been investigated using different experimental designs. Johnson et al. added urea to the dialysate of hemodialysis patients who were otherwise well dialyzed (95). Complications induced by the added urea were minimal until the SSUN was chronically >150–200 mg/dl. This led to gastrointestinal irritation. There was no investigation of ammonia or inhibitors of urea degradation so the effect of urea can only be considered an association. An indirect evaluation of both mice with CKD and cultured cells revealed that urea may stimulate the production of reactive oxygen species. Reddy et al. concluded that a high SUN not only increased reactive oxygen species but also caused insulin resistance (96). However, it is difficult to assign insulin resistance to a single factor considering that there are so many uremia-induced complex metabolic pathways (97,98). It will be interesting to evaluate whether the production of reactive oxygen species initiates similar events in patients with CKD.

Another potential role of urea in producing uremia-induced toxicity is through the development of protein carbamylation, which could disrupt the structure of a protein interfering with signaling pathways and so forth. Stim et al. reported that the rate of carbamylation of hemoglobin increased in parallel with the increase in SUN and that carbamylation was significantly higher in patients with ESRD compared with normal individuals (99). These responses were confirmed by Berg et al. (100) except that the carbamylated protein was albumin, rather than hemoglobin. Thus, carbamylation of several proteins can occur in uremic individuals but whether this produces toxic reactions has not been defined.

Finally, there are patient-based reports that cast doubt on the hypothesis that urea is a toxin. Hsu et al. studied a man and a woman from a family of patients who had chronic but unexplained azotemia. Results of the evaluation indicated that the high SUN arose from a autosomal dominant genetic defect in urea reabsorption (101). Kidney function of the two participants revealed subnormal urea clearances but otherwise normal values of inulin clearance, urea excretion, and responses of urea clearance to diuresis and antidiuresis plus normal sodium clearances. Although the mechanism for the familial azotemia was not identified, the report is relevant because the participants had no clinical or laboratory findings attributable to the increase in SUN despite years of values varying from 49 to 65 mg/dl and from 55 to 60 mg/dl, respectively. In another case study, Richards and Brown studied a woman with prolonged azotemia to examine the association between a high SUN and the development of uremic symptoms (102). The participant subsisted on a diet consisting primarily of fish and a protein powder, yielding urea nitrogen production rates of 40–50 g/d for years. Although the participant maintained a SUN of 50–80 mg/dl for years, she had normal values of hemoglobin, plasma creatinine, BP, and no weight loss. Together, these reports indicate that even a prolonged increase in the concentration of urea does not produce toxic reactions, at least in patients with normal kidney function.

Urea is the largest circulating pool of nitrogen and its production changes in parallel to the degradation of dietary and endogenous proteins. These facts and other properties of urea can be used to estimate the degree of uremia and the compliance with prescribed amounts protein in the diet. The available evidence in patients with CKD suggests that reutilization of ammonia derived from urea degradation for the synthesis of amino acids and proteins is minimal. Whether the evidence would be more persuasive under extreme conditions, such as in hibernating bears, is unknown. The ability of urea to create toxicity is unsettled but years of high SUN values do not produce toxic reactions in individuals with otherwise normal kidney function.

In conclusion, renal urea and ammonia metabolism mediate critical roles in nitrogen balance, urine concentration, and acid-base homeostasis. In this review, we evaluated critical processes involved in these homeostatic mechanisms. Abnormal urea and ammonia metabolism both result from and can lead to a wide variety of conditions, including methods for evaluating issues that are critical to caring for patients with impaired renal function.