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Quelle est la meilleure façon d'exprimer deux protéines dans une cellule de mammifère ?

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J'ai deux protéines et je vais préparer un vecteur avec les deux gènes pour une transfection stable. Chaque protéine aura son propre promoteur et j'utiliserai le vecteur piggyBac pour insérer une seule cassette contenant les deux gènes dans les chromosomes. Mes questions sont :

  1. Si j'utilise le même promoteur (CMV, SV40 ou inductible) pour les deux gènes, comment cela affecterait-il les niveaux d'expression ? J'ai lu dans certains articles que l'un des gènes pouvait être exprimé plus bas que l'autre. Si vous avez une expérience de première main, je vous serais reconnaissant de la partager.
  2. Si j'utilise le même promoteur pour les deux, mais que je les place loin (c'est-à-dire les extrémités de la cassette), les niveaux d'expression seraient-ils à nouveau affectés ? Cela semble assez simple, mais je pense que les gens auraient publié quelque chose s'ils avaient eu un bon résultat avec ça.
  3. Si j'utilise des promoteurs différents pour chaque gène (par exemple, CMV pour l'un et inductible par Tet pour l'autre), comment cela fonctionnerait-il ? Je n'ai pas pu trouver d'article qui l'ait utilisé et j'aimerais continuer avec cette approche ; Par conséquent, si vous avez une expérience, je serai vraiment reconnaissant pour toute aide.

Je ne veux pas utiliser IRES ou 2A-peptide. J'aimerais pouvoir contrôler cette expérience au stade de la transcription.


Vous pouvez utiliser un promoteur bidirectionnel. Le problème que vous avez mentionné au sujet des protéines non exprimées au même niveau se produit en raison de la compétition pour la polymérase. Mais il existe des pièces bien optimisées et des vecteurs disponibles dans le commerce qui fonctionnent bien.

Vous pouvez cloner des gènes dans un ordre séquentiel. Ce ne sera pas un problème. Il suffit de laisser un linker de 100 pb après le signal polyA du gène précédent. Si votre cassette devient trop grande, alors l'insertion devient légèrement difficile. C'est pourquoi les gens utilisent IRES ou TA-peptides, etc.

Les insertions basées sur des rétrovirus fonctionnent assez bien, mais vous ne pouvez pas contrôler la variation du nombre de copies entre les différentes cellules.

Vous pouvez utiliser deux promoteurs différents. La dynamique dépendra de la force du promoteur et de la concentration de l'inducteur.


Je parcourais mes questions et j'ai réalisé qu'il n'y avait toujours pas de réponse. Eh bien, j'ai la réponse maintenant.

J'ai conçu la construction avec deux promoteurs séparés (CMV pour l'un et Tet-inductible pour l'autre) et j'ai obtenu de très bons résultats. Je n'ai eu aucune difficulté à exprimer les protéines. J'ai pu très bien contrôler la protéine inductible par le Tet et obtenir des niveaux stables de l'autre protéine avec le CMV.

Pour faire court : vous pouvez placer en toute sécurité deux gènes sous deux promoteurs distincts, préparer des lignées cellulaires stables avec eux et obtenir de bons niveaux d'expression.


Quelle est la meilleure façon d'exprimer deux protéines dans une cellule de mammifère ? - La biologie

Qu'est-ce qu'une protéine recombinante ? Les protéines sont l'une des molécules biologiques les plus importantes pour la vie. Et ces protéines remplissent une vaste gamme de fonctions au sein des organismes, notamment la catalyse des réactions métaboliques, la réplication de l'ADN, la réponse aux stimuli et le transport des molécules d'un endroit à un autre. Cependant, lorsque nous voulons analyser la structure, la fonction, le mécanisme, la voie ou d'autres faits de ces protéines, nous constaterons que les quantités ne sont pas suffisantes de source naturelle. Dans ce cas, nous devons produire des protéines en grande quantité et pureté en peu de temps et à faible coût dans notre laboratoire. Ainsi, la technologie des protéines recombinantes est nécessaire. La protéine recombinante est une forme manipulée de protéine, qui est générée de diverses manières pour produire de grandes quantités de protéines, modifier des séquences de gènes et fabriquer des produits commerciaux utiles. La protéine recombinante est codée par l'ADN recombinant, qui a été cloné dans un système qui prend en charge l'expression du gène et la traduction de l'ARNm. L'ADN recombinant, généralement la séquence d'ADNc de la protéine cible, est conçu pour être sous le contrôle d'un promoteur bien caractérisé et exprimer la protéine cible dans la cellule hôte choisie pour obtenir une expression de protéine de haut niveau. La modification du gène par la technologie de l'ADN recombinant peut conduire à l'expression d'une protéine mutante ou d'une grande quantité de protéine.

Le choix d'un système d'expression de protéines approprié est la clé du succès de l'expression de protéines recombinantes. Plusieurs facteurs doivent être pris en considération, notamment la propriété de la protéine cible, l'application prévue, le rendement en protéines et le coût. En outre, des défis existent pour de nombreux projets d'expression de protéines, en particulier pour les grandes protéines, les protéines membranaires, les protéines nucléaires et les protéines avec de lourdes modifications post-traductionnelles.

De nos jours, il existe plusieurs systèmes d'expression à utiliser. Différents systèmes ont des caractéristiques et des applications différentes. Ici, nous allons présenter quatre systèmes qui sont couramment utilisés dans la recherche et l'industrie. Ce sont un système d'expression de bactéries, un système d'expression de levure, un système d'expression de baculovirus et un système d'expression de mammifère.

Fig. 1. Quatre systèmes d'expression

Le système d'expression d'E. coli est le système d'expression le plus utilisé et le plus mature. La méthode principale consiste à transférer un vecteur qui a inséré un fragment d'ADN cible dans la cellule hôte. Et ensuite induire l'expression des protéines par IPTG.

En tant que premier développement et système d'expression classique le plus largement utilisé, le système d'expression E. coli présente les avantages d'un fond génétique clair, d'une reproduction rapide, d'un faible coût, d'une expression élevée, d'une purification facile du produit, d'une bonne stabilité, d'une forte capacité anti-pollution et large gamme d'applications. Cependant, il existe de nombreuses lacunes dans le système d'expression procaryote : toutes les protéines ne sont pas solubles. Les protéines mal repliées formées dans le cytoplasme peuvent former des agrégats insolubles appelés corps d'inclusion, ce qui conduit à une purification difficile. De plus, le traitement de modification post-traductionnelle du système d'expression procaryote est imparfait et l'activité biologique du produit exprimé est faible.
Ainsi, d'autres systèmes plus sophistiqués sont également en cours de développement, de tels systèmes pouvant permettre l'expression de protéines que l'on croyait auparavant impossibles dans E. coli, par exemple des protéines glycosylées.

Fig2. Corps mal pliés et inclusions

Le système d'expression de levure en tant que nouveau système d'expression de protéine exogène, contenait des avantages du système d'expression à la fois procaryote et eucaryote. Il est largement utilisé dans le domaine du génie génétique. La séquence complète des gènes de Saccharomyces cerevisiae est séquencée en 1996. L'utilisation de S.cerevisiae dans l'industrie de la brasserie et du pain est connue depuis des milliers d'années et est considérée comme des créatures GRAS (généralement reconnues comme sûres) qui ne produisent pas de toxines et ont également été reconnu par la FDA. Ainsi, les productions exprimées à partir du système de levure ne nécessitent pas beaucoup d'expériences de sécurité de l'hôte.

Cependant, par rapport au nouveau système de levure, le système d'expression de S.cerevisiae n'est pas adapté à une culture à haute densité dépourvue d'un promoteur de régulation fort et strict. Et l'efficacité de la sécrétion est faible. En particulier, de nombreuses protéines cibles dont le poids moléculaire supérieur à 30 kD ne sécrète presque pas.

Plus tard, les gens ont développé un système d'expression de levure de fission et de levure de méthanol. Parmi eux, le système d'expression de levure méthanol est le système d'expression de levure le plus largement utilisé. De nos jours, les levures méthanoliques principalement utilisées sont H Polymorpha, Candida Bodini et Pichia Pastris. Pichia Pastoris est l'outil le plus populaire. La plupart des levures méthanoliques contiennent le gène 1 de l'oxydase de levure méthanolique (AOX1). Le gène exogène a été exprimé sous l'action du promoteur (PAOX1). PAOX1 est un puissant promoteur utilisant du glucose ou du glycérol comme source de carbone. L'expression du gène AOX1 dans la levure méthanolique était généralement inhibée. Et PAOX1 pourrait être activé lorsque le méthanol était la seule source de carbone. Par conséquent, l'expression du gène AOX1 pourrait être augmentée sous le contrôle du gène. L'utilisation de levure méthanol pour exprimer la production de protéines exogènes est souvent jusqu'à des grammes. Par rapport à S.cerevisiae, sa traduction est plus proche des cellules de mammifères et ne subit pas d'hyperglycosylation.

Le système d'expression des insectes est un système d'expression eucaryote largement utilisé qui a la capacité de traduire et de modifier des protéines étrangères similaires à celles des eucaryotes supérieurs. L'expression d'une protéine exogène dans le système cellulaire d'insecte par un baculovirus recombinant est une méthode d'expression plus populaire. Le niveau de protéines est jusqu'à 1

500mg/L. Mais il est limité et influencé par de nombreux facteurs tels que le milieu de culture, l'apport d'oxygène et la croissance logarithmique et ainsi de suite.

Le baculovirus est le plus grand groupe de virus d'insectes connus et est le virus d'insecte le plus ancien, le plus étudié et le plus applicable. Le génome du baculovirus est une seule molécule d'ADN double brin circulaire fermée d'une taille de 80 à 160 kb. Son génome peut être répliqué et transcrit dans des noyaux d'insectes. La réplication de l'ADN est assemblée dans l'écorce du baculovirus, qui a une grande flexibilité et pourrait accueillir de gros fragments d'insert d'ADN étranger. C'est le support idéal pour l'expression de gros fragments d'ADN.

Les principaux avantages du système baculovirus comprennent :

  1. La protéine recombinante a une fonction biologique complète, telle que le repliement correct des protéines et la liaison disulfure
  2. Modification post-traduction
  3. Haut niveau d'expression, jusqu'à 50 % de la quantité totale de protéines
  4. Adapte la grande protéine d'insertion
  5. Exprimer simultanément plusieurs gènes.

Le principal inconvénient est que l'expression des protéines exogènes est sous le contrôle du promoteur viral très tardif, où les cellules commencent à mourir en raison d'une infection virale.
Le système d'expression des insectes est normalement utilisé pour la production de protéines membranaires, bien que les glycosylations puissent être différentes de celles trouvées chez les vertébrés. En général, il est plus sûr à utiliser que le virus des mammifères, car il a une gamme d'hôtes limitée et n'infecte pas les vertébrés sans modifications.

Les protéines recombinantes exprimées dans des cellules de mammifères utilisent couramment la transfection plasmidique et l'infection par un vecteur viral. Une lignée cellulaire stable utilisant une transfection plasmidique prend plusieurs semaines, voire plusieurs mois, tandis que le vecteur viral peut infecter rapidement les cellules en quelques jours.

En fonction des différences temporelles et spatiales dans l'expression des protéines, le système d'expression peut être divisé en systèmes d'expression transitoires, stables et induits. Le système d'expression transitoire fait référence au fait que les cultures de cellules hôtes sans pression de sélection et vecteur exogène sont progressivement perdues lors de la division cellulaire. La durée d'expression de la protéine cible est courte. L'avantage du système d'expression transitoire est une période expérimentale simple et courte. Un système d'expression stable signifie que l'ADN porteur se réplique et s'exprime de manière stable pendant longtemps dans la cellule hôte. En raison de la nécessité de sélectionner des étapes de résistance et de pression, une expression stable est relativement longue et laborieuse. Le système d'expression par induction fait référence au fait que le gène cible commence à s'exprimer lorsqu'il est induit par de petites molécules étrangères. L'utilisation de promoteurs hétérologues, d'amplificateurs et de marqueurs génétiques amplifiables peut augmenter la production de protéines.
Le système d'expression des mammifères présente un avantage unique dans les signaux d'initiation des protéines, le traitement, la sécrétion, la glycosylation et convient à l'expression de macromolécules intactes.

Fig3.Développement de lignées cellulaires stables

La protéine étrangère produite par les cellules de mammifère, qui est plus proche de la protéine native, a beaucoup plus d'activité que les protéines produites par le système d'expression procaryote ou par un autre système d'expression eucaryote, comme les cellules de levure et d'insecte. L'inconvénient de la technique est la complexité, les exigences élevées, le faible rendement et parfois des infections virales.

Surtout, il y a des avantages et des inconvénients pour tous ces systèmes d'expression. L'avantage du système d'expression d'E. coli et de levure est un niveau d'expression élevé et un faible coût. Mais leurs systèmes de modification sont différents des cellules d'insectes et des cellules de mammifères. La protéine produite par la cellule de mammifère est similaire à la protéine native. Cependant, l'inconvénient est un faible niveau d'expression et une opération compliquée. L'activité biologique et l'immunogénicité des protéines recombinantes produites par différents systèmes d'expression sont parfois différentes en raison du traitement post-traductionnel détourné. Par conséquent, lors de l'examen du système d'expression à choisir, nous devons prendre en considération une variété de facteurs, tels que si la protéine cible est toxique, si la protéine a besoin d'une activité biologique, si la glycosylation est nécessaire pour la protéine et la rentabilité, le rendement, purification, sécurité et ainsi de suite. Soutenue par des connaissances expérimentales expérimentées et tenant compte de tous ces facteurs, notre expertise fera une détermination et un choix appropriés.

Tableau 1. Comparez simplement entre les systèmes d'expression

Système d'expression bactérienne Système d'expression de levure Système d'expression des insectes Système d'expression des mammifères
La vitesse ★★★★ ★★★ ★★
Rendement ★★★ ★★★★ ★★
PTM
(par rapport à l'humain)
★★ ★★★ ★★★★
Coût ★★★★ ★★★ ★★
Application Protéine procaryote, protéine eucaryote simple Protéine intracellulaire/sécrétée, Protéine à pont disulfure, Protéine glycosylée Protéine membranaire, Protéine de grande taille,
Vaccins viraux, protéines de signalisation, cytokines, kinases
Protéine eucaryote complexe, la protéine a besoin d'un PTM précis

Nous fournissons tous les services de système d'expression de protéines dans notre entreprise. Si vous avez des questions sur le choix des protéines recombinantes et du système d'expression, n'hésitez pas à nous contacter pour plus de détails !


Durée de vie normale et dérivation de lignées cellulaires

Au cours des premiers stades de développement, les cellules animales subissent une prolifération et une différenciation étendues tout en se développant en différents tissus et organes. Chez un adulte, la grande majorité des cellules sont au repos bien qu'elles soient métaboliquement actives et remplissent leurs rôles physiologiques, tels que la filtration dans les reins ou la synthèse et la transformation chimique dans le foie, la plupart ne se divisent pas activement. La plupart des cellules adultes normales ne se divisent qu'en réponse à des stimuli pour reconstituer les cellules anciennes ou endommagées. Seules les cellules de tissus spécifiques, comme la peau ou les cellules épithéliales intestinales, se divisent régulièrement.

Le corps contient plus de 200 types de cellules différentes, dont beaucoup ne peuvent pas être excisées et cultivées en culture. Les cellules qui se prêtent mieux à la culture comprennent les fibroblastes et certaines cellules épithéliales. Une première étape de l'isolement cellulaire consiste à explanter un tissu dans un environnement physique et chimique approprié pour que ces cellules survivent et prolifèrent.

Un environnement permissif pour la croissance cellulaire nécessite un mélange complexe de nutriments, notamment des sucres, des acides aminés, des vitamines, des minéraux et des facteurs de croissance tels que l'insuline. À l'exception de certains types de cellules dans le sang, les cellules dérivées des tissus sont dépendantes de l'ancrage, ce qui signifie qu'elles ne se développent pas en tant que cellules individuelles flottantes. Par conséquent, après avoir été libérées de l'environnement tissulaire, les cellules ont besoin d'une surface sur laquelle elles peuvent se fixer, sinon elles ne survivront pas et ne se diviseront pas.

Après la fixation, les cellules se développent et s'étendent sur des surfaces vides jusqu'à ce que toute la surface soit recouverte d'une couche d'une cellule d'épaisseur (c'est à dire., une monocouche). À ce stade, ils arrêtent de se diviser et atteignent un état appelé inhibition de contact. Ensuite, une enzyme, telle que la trypsine, est utilisée pour dégrader les protéines qui «collent» les cellules à la surface, libérant ainsi les cellules en solution. Une fois détachées, les cellules peuvent être transférées dans un récipient de culture avec une plus grande surface pour reprendre la croissance.

Ce cycle d'attachement, d'expansion cellulaire et de détachement peut se répéter plusieurs fois, chaque cycle étant composé de plusieurs divisions cellulaires. Cependant, la plupart des cellules normales ont une horloge interne qui compte leurs propres doublements. La division cellulaire s'arrête une fois que la limite dite de Hayflick est atteinte (3, 4). La plupart des cellules dérivées des tissus peuvent se diviser jusqu'à 40 à 60 fois avant de cesser de proliférer (de devenir sénescentes) et de présenter un aspect anormal. Néanmoins, le nombre de doublements que ces cellules peuvent supporter en culture est suffisant pour les applications de production de vaccins.

La sénescence et l'inhibition de contact présentées par ces cellules sont des caractéristiques des cellules des tissus normaux. Certaines cellules isolées de cancers sont cependant immortelles et peuvent surmonter l'inhibition de contact. Il y a plus d'un demi-siècle, les scientifiques ont réussi à isoler des cellules qui ont survécu à la sénescence (5, 6). Ces cellules ont continué à se diviser après la mort de toutes les autres. Fait intéressant, contrairement aux cellules cancéreuses, certaines des cellules survivantes obéissaient toujours à l'inhibition du contact et semblaient morphologiquement normales.

Ces cellules immortelles qui contournent la limite Hayflick et continuent à se diviser sont appelées lignées cellulaires et sont immortelles en culture, contrairement aux souches cellulaires isolées de tissus normaux. Les souches cellulaires et les lignées cellulaires diffèrent d'une autre manière importante : toutes les cellules des souches cellulaires ont des chromosomes normaux avec deux ensembles par cellule, tandis que les cellules des lignées cellulaires n'ont généralement pas deux ensembles de chromosomes, même si elles sont morphologiquement normales.

De nombreuses lignées cellulaires induisent la formation de tumeurs lorsqu'elles sont injectées à des souris immunodéprimées. Cependant, parce qu'elles peuvent être cultivées pour toujours, les lignées cellulaires peuvent être génétiquement modifiées pour produire un produit en quantités pratiquement illimitées. Pour cette raison, toutes les protéines thérapeutiques produites dans les cellules de mammifères utilisent des lignées cellulaires.


Méthodes de transfection transitoire

Les liposomes sont des analogues synthétiques de la bicouche phospholipidique, la pierre angulaire de la membrane cellulaire. Ces composés de transfection partagent un certain nombre de caractéristiques avec leurs homologues naturels, notamment la présence de régions hydrophobes et hydrophiles de chaque molécule qui permettent la formation de liposomes sphéroïdes dans des conditions aqueuses. En présence d'ADN ou d'ARN libre, les liposomes encapsulent les acides nucléiques pour créer un système d'administration efficace. La charge, la composition et la structure du liposome définissent l'affinité du complexe pour la membrane cellulaire. Dans des conditions spécifiques, le complexe liposome-acide nucléique est capable d'interagir avec la membrane cellulaire pour accéder à la cellule par endocytose et ensuite libérer les acides nucléiques dans le cytoplasme. Il existe plusieurs facteurs qui déterminent l'administration réussie d'acides nucléiques par liposome dans des cellules de mammifères, notamment la taille des particules, la formulation des lipides, le rapport de charge et la méthode de préparation des liposomes.

Les alternatives aux liposomes comprennent les lipides non liposomaux et les polymères capables de former des complexes avec l'acide nucléique pour former des micelles, ou de minuscules gouttelettes d'encapsulation. La transfection est généralement réalisée dans des conditions aqueuses, ce qui permet à la partie lipophile du composé amphiphile, ou à la partie de la gouttelette qui présente une affinité pour les composés d'acides gras tels que la membrane cellulaire, de former la capsule micellaire qui enveloppe les acides nucléiques exogènes. .

Les dendrimères sont des macromolécules globulaires hautement ramifiées capables d'interagir avec l'ADN pour former de petits complexes. Les dendrimères sont stables dans les liquides biologiques et ne sont pas sensibles à la température. Ces propriétés font des dendrimères des outils très efficaces pour les transfections de cultures tissulaires. L'inconvénient des dendrimères est qu'ils ne sont pas biodégradables et peuvent donc être toxiques pour les cellules en cas d'exposition prolongée.

L'électroporation est une technique très efficace pour délivrer des acides nucléiques exogènes aux cellules en suspension et aux cellules primaires non adhérentes (comme les lymphocytes). Cette technique utilise l'électricité pour créer des pores transitoires (électropores) dans la membrane cellulaire afin de permettre l'absorption de molécules d'acide nucléique chargées (ARN ou ADN) dans les cellules cibles.


Sélection positive dans les cellules de mammifères

Pour obtenir une transfection stable, il devrait y avoir une pression sélective pour forcer les cellules à incorporer l'ADN plasmidique dans le génome. Pour les besoins de cet article, nous définirons la sélection positive comme le moyen de capter des traits positifs (c'est-à-dire que le plasmide contient une cassette qui rendra les cellules résistantes à une toxine), alors que la sélection négative serait le captage d'un trait négatif ( c'est-à-dire que le plasmide contient une cassette qui rendra les cellules sensibles à une toxine). Dans le tableau ci-dessous, nous nous concentrons sur la sélection positive, cependant, les techniques de sélection négative peuvent être utilisées en conjonction avec la sélection positive pour garantir que votre gène est ciblé vers un emplacement spécifique dans le génome.

La sélection positive dans les cellules de mammifères fonctionne de manière similaire à celle des bactéries et un tableau des marqueurs de sélection les plus couramment utilisés est répertorié ci-dessous :

HeLa, NIH3T3, CHO, COS-1, 293HEK

*Non exhaustif. ** Chez les eucaryotes. *** La concentration utilisée pour la sélection est généralement plus (double) que celle utilisée pour le maintien d'une lignée cellulaire transfectée.


Optimiser l'expression des protéines

Comme un train qui se compose d'une séquence particulière de voitures, de la locomotive au fourgon de queue, les protéines ne peuvent « quitter la gare » qu'après que chacun de ses segments, les acides aminés, sont reliés entre eux.

En fait, la navette des wagons dans une gare de triage est beaucoup plus simple que les processus qui composent l'expression des protéines - des processus qui commencent par la transcription, culminent dans la traduction et sont même élaborés dans la modification post-traductionnelle. Il est cependant possible de prendre le contrôle de ces processus et de transporter des marchandises précieuses telles que des produits biopharmaceutiques complexes.

Visant à fournir des solutions pratiques aux défis d'aujourd'hui, le récent Sommet sur le biotraitement a concentré un segment de son programme de conférence sur les progrès de l'expression des protéines. Ce segment couvrait de nouvelles approches telles que l'utilisation de l'interférence ARN à l'échelle du génome (ARNi), l'amélioration de la glyco-ingénierie des systèmes d'expression cellulaire toujours populaires de l'ovaire de hamster chinois (CHO) et l'harmonisation de l'expression transitoire et stable pour améliorer le développement de médicaments.

Des présentations ont également été consacrées aux cellules d'insectes. Comme d'autres systèmes d'expression, les cellules d'insectes peuvent être utilisées pour produire des produits biothérapeutiques avec une optimisation minutieuse des processus compatibles avec la fabrication. Enfin, certaines présentations ont abordé des questions d'externalisation, telles que les avantages relatifs d'utiliser une ou plusieurs sociétés pour les multiples processus impliqués dans l'expression des protéines.

Approche pluridisciplinaire

Compte tenu de la myriade de défis qui peuvent compromettre l'expression efficace des protéines, il est parfois judicieux de consulter des spécialistes. Par exemple, les problèmes d'externalisation ont incité de nombreuses entreprises à travailler avec Ingenza, qui se veut le partenaire de choix en biotechnologie industrielle et biologie synthétique.

« Il existe de nombreuses facettes inconnues et connues de l'expression efficace des protéines qui nécessitent un haut niveau d'expertise pour être simultanément optimisées », a déclaré Ian Fotheringham, Ph.D., directeur général d'Ingenza. « Certains laboratoires ont des connaissances dans un aspect ou un autre, mais il est souvent plus efficace de travailler avec quelqu'un ayant les capacités pour aborder les multiples aspects d'une expression efficace des protéines. Nous nous distinguons à cet égard.

Le Dr Fotheringham a affirmé que l'externalisation est désormais une option bien établie dans le domaine de l'expression des protéines : « Les clients veulent quelqu'un qui peut produire, innover, dépanner et dialoguer continuellement avec eux pour augmenter leurs chances de succès. Nous sommes une entreprise multidisciplinaire pour une raison.

À titre d'exemple, le Dr Fotheringham a décrit sa collaboration avec une société biopharmaceutique américaine de premier plan dont la protéine cible exprimée a été tronquée dans l'hôte recombinant. « Tout d'abord, nous avons optimisé le gène cible pour l'expression dans Escherichia coli à l'aide d'une bibliothèque de

50 000 variants de séquences de régions codantes. Nous avons conçu un simple écran de plaque de Petri qui a rapidement identifié les meilleurs artistes interprètes ou exécutants.

« Poussés par de tels succès, nous avons par la suite fourni des souches de production conformes aux BPF pour de nombreuses cibles de nos clients. D'autres projets ont impliqué avec succès des vecteurs à double cassette (tels que la cible et le chaperon), des hôtes alternatifs, de nouvelles stratégies d'induction et une intégration ciblée du génome pour optimiser la stabilité, la production et la purification des protéines recombinantes.

Ingenza travaille également avec des institutions universitaires et des entreprises dérivées émergentes pour traduire des recherches innovantes. Le Dr Fotheringham a cité l'exemple de l'épidermicine, un puissant antimicrobien découvert par l'un des partenaires universitaires de l'entreprise. L'épidermicine peut lutter contre la résistance à la méthicilline Staphylococcus aureus (SARM), mais au départ, elle n'était exprimable qu'en faibles quantités en raison de la toxicité de l'hôte.

« Nous avons utilisé notre plate-forme d'assemblage combinatoire exclusive inABLE ® pour préparer et cribler des constructions de fusion clivables qui, combinées à une fermentation basée sur la conception de l'expérience (DOE), ont permis une surproduction d'épidermicine et de ses dérivés », a détaillé le Dr Fotheringham. "Le succès permet à une entreprise dérivée d'une université d'exploiter le résultat."

La société progresse maintenant dans le domaine des produits biologiques GMP avec des clients clés, en utilisant des systèmes de production microbiens et mammifères optimisés et des approches de fermentation modulaires à usage unique pour fournir des substances médicamenteuses pour l'évaluation clinique et la fabrication.


Ingenza utilise de simples écrans de boîte de Pétri pour optimiser l'expression du gène cible dans Escherichia coli à l'aide d'une bibliothèque de

Harmonisation de l'expression CHO transitoire et stable

Pour ceux qui travaillent en interne, l'expression de produits protéiques dans les cellules CHO reste l'une des plateformes d'expression les plus populaires pour diverses raisons, a déclaré Yashas Rajendra, Ph.D., chercheur scientifique, Eli Lilly and Company. « Les systèmes CHO », a-t-il expliqué, « sont intrinsèquement adaptables et faciles à étendre aux bioréacteurs industriels »

Cependant, pour la découverte de médicaments en phase précoce de produits biopharmaceutiques complexes, les entreprises s'appuient souvent sur les plateformes d'expression transitoire HEK293. "Cela peut augmenter le risque de surprises lorsque les molécules sont avancées et éventuellement exprimées en CHO", a averti le Dr Rajendra. "Pour réduire ce risque, nous avons développé une plate-forme CHO transitoire basée sur la même lignée cellulaire, le même paquet de supports et la même cassette d'expression d'ADN que celles utilisées pour notre plate-forme CHO stable."

Selon le Dr Rajendra, l'harmonisation des approches d'expression transitoires et stables peut fournir une meilleure prévisibilité de la qualité et de l'expression des protéines lors de la transition des molécules de la découverte au développement et finalement à la fabrication. "Ce système CHO transitoire peut rapidement (en sept jours) générer des titres élevés", a affirmé le Dr Rajendra. « Le système est évolutif jusqu'à 10 L.

Le groupe du Dr Rajendra a introduit une autre modification : l'utilisation de pools de CHO stables (au lieu de puits maîtres ou de clones) pour générer des quantités de grammes de protéines thérapeutiques. « Il faut 2 à 4 semaines pour générer un pool de CHO stable », a noté le Dr Rajendra. « En revanche, il faut généralement plusieurs mois pour générer des lignées cellulaires clonales CHO. Par conséquent, la vitesse est l'un des principaux avantages des piscines stables.

« De plus, les avantages par rapport à l'expression transitoire incluent l'utilisation de plus petites quantités d'ADN plasmidique pour la transfection, la facilité de mise à l'échelle volumétrique et la flexibilité d'effectuer plusieurs cycles de production sur une période prolongée à l'aide d'une banque de cellules congelées. Nous avons récemment publié des titres de pool de CHO allant de 2 à 7,6 g/L.

Le Dr Rajendra a indiqué qu'à l'heure actuelle, les pools stables sont principalement utilisés pour la génération de matériel préclinique en raison de problèmes d'hétérogénéité clonale, de stabilité génétique et d'expression et de cohérence de la qualité des produits. À l'avenir, cependant, l'utilisation de pools stables pourrait s'étendre à la génération de lots toxicologiques et aux premières études de dose chez l'homme.

"Bien que cela va prendre un certain temps", a conclu le Dr Rajendra, "compte tenu des progrès de l'ingénierie des cellules hôtes, des approches médiées par les transposons et des outils analytiques qui permettent une évaluation approfondie de la qualité des produits, j'espère que nous verrons un passage du paradigme de « clonalité » à un paradigme de « consistance de la qualité du produit ».

Glyco-ingénierie en CHO

Bien qu'ils soient largement utilisés, les systèmes d'expression CHO présentent des défis similaires à ceux posés par d'autres cellules de mammifères. En particulier, les cellules CHO produisent des protéines recombinantes hétérogènes en N-glycanes de type complexe.

"La glycosylation est l'une des modifications post-traductionnelles les plus importantes des protéines", a déclaré Andrew (Cheng-Yu) Chung, chercheur, département de génie chimique et biomoléculaire, Université Johns Hopkins (JHU). « Les glycanes sur les protéines jouent un rôle clé, en particulier dans le repliement des protéines. Ainsi, ils ont un impact significatif sur la stabilité des protéines et les interactions protéine-protéine.

Chung, qui est dans le laboratoire de Michael J. Betenbaugh, Ph.D., étudie la sialylation de protéines modifiées. "En raison de la charge négative, de la taille et des caractéristiques hydrophiles des groupes acide sialique, la sialylation est l'une des modifications les plus critiques sur l'extrémité glycane", a expliqué Chung. Ces propriétés ont permis à l'acide sialique d'avoir une influence substantielle sur les interactions protéine-protéine. De plus, la sialylation peut affecter l'efficacité des produits biothérapeutiques.

Chung et ses collègues ont examiné l'application de stratégies de génie génétique pour moduler le niveau de contenu de sialylation sur divers biothérapeutiques potentiels. "Une façon courante de manipuler la structure du glycane consiste à utiliser des outils de génie génétique tels que CRISPR/Cas9 pour assommer/assommer ou surexprimer certaines glycoenzymes", a-t-il noté. « Par exemple, la surexpression des glycoenzymes impliquées dans la voie de la sialylation est une stratégie pour produire des produits biologiques avec une teneur accrue en acide sialique qui peut affecter le temps de rétention dans la circulation (CRT). Une augmentation du CRT peut signifier des doses plus faibles pour les patients.

Une autre stratégie pour rendre la glycosylation dans les cellules CHO plus uniforme et similaire au processus analogue dans les cellules humaines consiste à ajouter des suppléments chimiques spécifiques au milieu de culture cellulaire.

Le groupe de Chung a décidé d'essayer les deux stratégies - le génie génétique et l'ajout de suppléments médiatiques - en même temps. "Le génie génétique des cellules CHO peut être utilisé pour produire des produits biologiques avec une sialylation améliorée ainsi que des titres de protéines plus élevés", a indiqué Chung. Cette approche, a poursuivi Chung, a été associée à l'utilisation de suppléments chimiques. Les analogues chimiques spécifiques qui sont ajoutés à l'alimentation ont été développés par Kevin Yarema, Ph.D, professeur associé de génie biomédical à JHU.

Expression des cellules d'insectes

Alors que la plupart des produits biothérapeutiques recombinants sont produits dans des cellules de mammifères, d'autres sont produits dans des cellules d'insectes. Par exemple, une plateforme de cellules d'insectes a été sélectionnée pour exprimer des protéines recombinantes pour Genocea Biosciences.

"Notre vaccin thérapeutique (GEN-003) contre l'herpès génital est composé de deux protéines recombinantes combinées à un adjuvant", a déclaré Rajiv Gangurde, Ph.D., directeur associé de la production de protéines. « Les deux protéines sont exprimées dans des cellules d'insectes.

« Le choix de la plate-forme d'expression a été principalement motivé par des modifications post-traductionnelles spécifiques requises pour l'activité, c'est-à-dire la capacité de provoquer une réponse immunogène appropriée, par l'un des antigènes. Ces modifications ne sont pas seulement spécifiques aux cellules hôtes dans lesquelles la protéine recombinante est exprimée, mais sont également bien tolérées chez l'homme, ce qui est l'un des plus grands avantages de l'utilisation de cellules d'insectes.

L'herpès génital est une infection chronique grave qui touche plus de 400 millions de personnes dans le monde et plus de 50 millions aux États-Unis seulement. Le Dr Rajiv a souligné qu'il n'y a pas eu de véritable innovation au nom des patients depuis des décennies, pas depuis que les antiviraux oraux ont été approuvés.

Prior to expressing the product in insect cells, Dr. Rajiv and colleagues needed to overcome some specific hurdles. “Early on, we faced several challenges in developing manufacturing-compatible processes,” he noted. “We have overcome those hurdles through extensive in-house process development work and choosing a contract manufacturing organization with insect cell production scale-up experience.

“One protein is expressed as a soluble, secreted protein, while the other is an intracellular, insoluble protein. This fundamental difference in expression makes it easier to express the proteins separately. Moreover, there are notable differences in the levels of expression hence, independent expression allows the required flexibility in downstream processing and drug product manufacture.”

The company, which is conducting its third clinical trial with GEN-003, expects to start Phase III in the second half of next year. Next, the company plans to file a Biologics License Application with the FDA in 2019. If the application is approved, the company will launch GEN-003 in 2020.

“We believe we have established GEN-003 as a highly attractive product that requires only a once-yearly injection offering similar efficacy to that of daily oral antiviral therapy,” asserts Dr. Rajiv. “Given that most patients choose not to take daily oral anti-viral pills and accounting for compliance challenges with daily therapy, we believe the real-world efficacy of GEN-003 from an annual injection could translate into significant patient benefits and a revenue opportunity in excess of $1 billion in the United States alone.”


Genocea Biosciences’ Rajiv Gurde, Ph.D., utilizes insect cells to separately express two key recombinant proteins for the company’s therapeutic vaccine, GEN-003, against genital herpes.

RNAi to Enhance Expression

Aside from its traditional use as a workhorse technique for basic research, RNAi also has applications for improving protein expression.

“RNAi has been often applied in the fields of medical and basic research, especially to understand disease mechanisms,” reports Joseph Shiloach, Ph.D., director of the Biotechnology Core Laboratory, Intramural Research at the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health. “We decided to use it for identifying genes that are currently not known to be involved in protein expression, yet whose knockdown could improve recombinant protein production in mammalian cells.”

Dr. Shiloach and colleagues performed a genome-scale, high-throughput RNAi screen using HEK293 cells expressing firefly luciferase. “The basic idea was to individually knock down approximately 22,000 genes one at a time and look for those that affected expression, but did not affect cell growth,” explained Dr. Shiloach. “We utilized three different siRNAs for each gene and performed the work collaborating with the National Center for Advanced Translational Science.”

Among the “hits” identified was the gene for ornithine decarboxylase antizyme 1. The protein product helps regulate intracellular polyamines that are needed for cell growth and proliferation. “We also performed a detailed investigation to confirm the findings,” continued Dr. Shiloach. “We are now assessing the long-term effects of knockdown, the mechanisms involved in metabolism, and feasibility of extending this approach to other mammalian cells.”

According to Dr. Shiloach, the take-home message from these studies is that genome-scale RNAi screens can identify key pathways and genes whose modulation may help improve the expression and production of recombinant proteins. “These studies are more a beginning than an ending,” he stated. “But we have established a different foundation for the targeted design of more efficient mammalian cell expression platforms.”

Boosting Expression

Expression levels of recombinant proteins (simple proteins as well as complex biologics) can be unpredictable in mammalian cells, and this causes major headaches for target discovery and scale-up manufacture, according to Tom Payne, Ph.D., head of cell engineering at Oxford Genetics. Scientists are familiar with finding that sometimes proteins express at unexpectedly low levels, even when under the control of strong promoters (e.g., CMV).

“To minimize protein-to-protein variability and maximize yield, we adopted a high-throughput approach to screen and optimize >5,000 recombinant promoters by random shuffling, >30 5’ UTRs in different configurations and >15 poly-A signals,” said Dr. Payne. “We also developed Kozak and stop codon libraries and screened >1,000 genes from diverse organisms encoding putative ancillary protein to generate expression plasmids that consistently produce high yields of diverse proteins in HEK-293 and CHO systems, termed SnapFast Pro.”

Validating the System

To validate this vector system, Dr. Payne and his team compared protein yields to an industry-standard protein-expression vector. To maximize the relevance of the dataset they algorithmically determined the frequency with which each gene in the human genome had been cited in publications (PubMed hits, 2000–2016), identifying those genes consistently increasing in hits, as an indication of importance in biomedical research.

“The top 150 genes were batch codon-optimized, FLAG-tagged, and sub-cloned into the expression vector or SnapFast Pro,” continued Dr. Payne. “Following transient transfection into either CHO-K1 or HEK-293 cells, lysates and/or supernatants (depending on whether the protein is secreted) were subjected to high-throughput automated western blot. For both secreted and nonsecreted proteins, SnapFast Pro gave consistently high-level protein expression, in many cases showing high expression where no protein could be detected with the reference expression vector.”


Oxford Genetics is a specialist synthetic biology company focused on providing DNA, protein, virus, and cell-line design and development solutions. Two of the firm’s scientists can be seen working on a custom cell-line development project looking to optimize expression of a client’s gene of interest.


Protein Purification Strategies

Proteins are biological macromolecules that maintain the structural and functional integrity of the cell, and many diseases are associated with protein malfunction. Protein purification is a fundamental step for analyzing individual proteins and protein complexes and identifying interactions with other proteins, DNA or RNA. A variety of protein purification strategies exist to address desired scale, throughput and downstream applications. The optimal approach often must be determined empirically.

Purification des protéines

The best protein purification protocol depends not only on the protein being purified but also on many other factors such as the cell used to express the recombinant protein (e.g., prokaryotic versus eukaryotic cells). Escherichia coli remains the first choice of many researchers for producing recombinant proteins due to ease of use, rapid cell growth and low cost of culturing. Proteins expressed in E. coli can be purified in relatively high quantities, but these proteins, especially eukaryotic proteins, may not exhibit proper protein activity or folding. Cultured mammalian cells might offer a better option for producing properly folded and functional mammalian proteins with appropriate post-translational modifications (Geisse et al. 1996). However, the low expression levels of recombinant proteins in cultured mammalian cells presents a challenge for their purification. As a result, attaining satisfactory yield and purity depends on highly selective and efficient capture of these proteins from the crude cell lysates.

To simplify purification, affinity purification tags can be fused to a recombinant protein of interest (Nilsson et al. 1997). Common fusion tags are polypeptides, small proteins or enzymes added to the N- or C-terminus of a recombinant protein. The biochemical features of different tags influence the stability, solubility and expression of proteins to which they are attached (Stevens et al. 2001). Using expression vectors that include a fusion tag facilitates recombinant protein purification.

Isolation of Protein Complexes

A major objective in proteomics is the elucidation of protein function and organization of the complex networks that are responsible for key cellular processes. Analysis of protein:protein interactions can provide valuable insight into the cell signaling cascades involved in these processes, and analysis of protein:nucleic acid interactions often reveals important information about biological processes such as mRNA regulation, chromosomal remodeling and transcription. For example, transcription factors play an important role in regulating transcription by binding to specific recognition sites on the chromosome, often at a gene’s promoter, and interacting with other proteins in the nucleus. This regulation is required for cell viability, differentiation and growth (Mankan et al. 2009 Gosh et al. 1998).

Analysis of protein:protein interactions often requires straightforward methods for immobilizing proteins on solid surfaces in proper orientations without disrupting protein structure or function. This immobilization must not interfere with the binding capacity and can be achieved through the use of affinity tags. Immobilization of proteins on chips is a popular approach to analyze protein:DNA and protein:protein interactions and identify components of protein complexes (Hall et al. 2004 Hall et al. 2007 Hudson and Snyder, 2006). Functional protein microarrays normally contain full-length functional proteins or protein domains bound to a solid surface. Fluorescently labeled DNA is used to probe the array and identify proteins that bind to the specific probe. Protein microarrays provide a method for high-throughput identification of protein:DNA interactions. Immobilized proteins also can be used in protein pull-down assays to isolate protein binding partners in vivo (mammalian cells) or in vitro. Other downstream applications such as mass spectrometry do not require protein immobilization to identify protein partners and individual components of protein complexes.


Contenu

Commonly used protein production systems include those derived from bacteria, [2] yeast, [3] [4] baculovirus/insect, [5] mammalian cells, [6] [7] and more recently filamentous fungi such as Myceliophthora thermophila. [8] When biopharmaceuticals are produced with one of these systems, process-related impurities termed host cell proteins also arrive in the final product in trace amounts. [9]

Cell-based systems Edit

The oldest and most widely used expression systems are cell-based and may be defined as the "combination of an expression vector, its cloned DNA, and the host for the vector that provide a context to allow foreign gene function in a host cell, that is, produce proteins at a high level". [10] [11] Overexpression is an abnormally and excessively high level of gene expression which produces a pronounced gene-related phenotype. [12] [13]

There are many ways to introduce foreign DNA to a cell for expression, and many different host cells may be used for expression — each expression system has distinct advantages and liabilities. Expression systems are normally referred to by the host and the DNA source or the delivery mechanism for the genetic material. For example, common hosts are bacteria (such as E. coli, B. subtilis), yeast (such as S.cerevisiae [4] ) or eukaryotic cell lines. Common DNA sources and delivery mechanisms are viruses (such as baculovirus, retrovirus, adenovirus), plasmids, artificial chromosomes and bacteriophage (such as lambda). The best expression system depends on the gene involved, for example the Saccharomyces cerevisiae is often preferred for proteins that require significant posttranslational modification. Insect or mammal cell lines are used when human-like splicing of mRNA is required. Nonetheless, bacterial expression has the advantage of easily producing large amounts of protein, which is required for X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance experiments for structure determination.

Because bacteria are prokaryotes, they are not equipped with the full enzymatic machinery to accomplish the required post-translational modifications or molecular folding. Hence, multi-domain eukaryotic proteins expressed in bacteria often are non-functional. Also, many proteins become insoluble as inclusion bodies that are difficult to recover without harsh denaturants and subsequent cumbersome protein-refolding.

To address these concerns, expressions systems using multiple eukaryotic cells were developed for applications requiring the proteins be conformed as in, or closer to eukaryotic organisms: cells of plants (i.e. tobacco), of insects or mammalians (i.e. bovines) are transfected with genes and cultured in suspension and even as tissues or whole organisms, to produce fully folded proteins. Mammifère in vivo expression systems have however low yield and other limitations (time-consuming, toxicity to host cells. ). To combine the high yield/productivity and scalable protein features of bacteria and yeast, and advanced epigenetic features of plants, insects and mammalians systems, other protein production systems are developed using unicellular eukaryotes (i.e. non-pathogenic 'Leishmanie' cells).

Bacterial systems Edit

Escherichia coli Éditer

E. coli is one of the most widely used expression hosts, and DNA is normally introduced in a plasmid expression vector. The techniques for overexpression in E. coli are well developed and work by increasing the number of copies of the gene or increasing the binding strength of the promoter region so assisting transcription.

For example, a DNA sequence for a protein of interest could be cloned or subcloned into a high copy-number plasmid containing the lac (often LacUV5) promoter, which is then transformed into the bacterium E. coli. Addition of IPTG (a lactose analog) activates the lac promoter and causes the bacteria to express the protein of interest.

E. coli strain BL21 and BL21(DE3) are two strains commonly used for protein production. As members of the B lineage, they lack lon et OmpT proteases, protecting the produced proteins from degradation. The DE3 prophage found in BL21(DE3) provides T7 RNA polymerase (driven by the LacUV5 promoter), allowing for vectors with the T7 promoter to be used instead. [14]

Corynébactérie Éditer

Non-pathogenic species of the gram-positive Corynébactérie are used for the commercial production of various amino acids. Les C. glutamicum species is widely used for producing glutamate and lysine, [15] components of human food, animal feed and pharmaceutical products.

Expression of functionally active human epidermal growth factor has been done in C. glutamicum, [16] thus demonstrating a potential for industrial-scale production of human proteins. Expressed proteins can be targeted for secretion through either the general, secretory pathway (Sec) or the twin-arginine translocation pathway (Tat). [17]

Unlike gram-negative bacteria, the gram-positive Corynébactérie lack lipopolysaccharides that function as antigenic endotoxins in humans.

Pseudomonas fluorescens Éditer

The non-pathogenic and gram-negative bacteria, Pseudomonas fluorescens, is used for high level production of recombinant proteins commonly for the development bio-therapeutics and vaccines. P. fluorescens is a metabolically versatile organism, allowing for high throughput screening and rapid development of complex proteins. P. fluorescens is most well known for its ability to rapid and successfully produce high titers of active, soluble protein. [18]

Eukaryotic systems Edit

Yeasts Edit

Expression systems using either S. cerevisiae ou Pichia pastoris allow stable and lasting production of proteins that are processed similarly to mammalian cells, at high yield, in chemically defined media of proteins.

Filamentous fungi Edit

Filamentous fungi, especially Aspergillus et Trichoderma, but also more recently Myceliophthora thermophila C1 [8] have been developed into expression platforms for screening and production of diverse industrial enzymes. The expression system C1 shows a low viscosity morphology in submerged culture, enabling the use of complex growth and production media.

Baculovirus-infected cells Edit

Baculovirus-infected insect cells [19] (Sf9, Sf21, High Five strains) or mammalian cells [20] (HeLa, HEK 293) allow production of glycosylated or membrane proteins that cannot be produced using fungal or bacterial systems. [19] It is useful for production of proteins in high quantity. Genes are not expressed continuously because infected host cells eventually lyse and die during each infection cycle. [21]

Non-lytic insect cell expression Edit

Non-lytic insect cell expression is an alternative to the lytic baculovirus expression system. In non-lytic expression, vectors are transiently or stably transfected into the chromosomal DNA of insect cells for subsequent gene expression. [22] [23] This is followed by selection and screening of recombinant clones. [24] The non-lytic system has been used to give higher protein yield and quicker expression of recombinant genes compared to baculovirus-infected cell expression. [23] Cell lines used for this system include: Sf9, Sf21 from Spodoptera frugiperda cells, Hi-5 from Trichoplusia ni cells, and Schneider 2 cells and Schneider 3 cells from Drosophila melanogaster cellules. [22] [24] With this system, cells do not lyse and several cultivation modes can be used. [22] Additionally, protein production runs are reproducible. [22] [23] This system gives a homogeneous product. [23] A drawback of this system is the requirement of an additional screening step for selecting viable clones. [24]

Excavata Éditer

Leishmania tarentole (cannot infect mammals) expression systems allow stable and lasting production of proteins at high yield, in chemically defined media. Produced proteins exhibit fully eukaryotic post-translational modifications, including glycosylation and disulfide bond formation. [ citation requise ]

Mammalian systems Edit

The most common mammalian expression systems are Chinese Hamster ovary (CHO) and Human embryonic kidney (HEK) cells. [25] [26] [27]

    [26] myeloma lymphoblstoid (e.g. NS0 cell) [25]
  • Fully Human
    • Human embryonic kidney cells (HEK-293) [26]
    • Human embryonic retinal cells (Crucell's Per.C6) [26]
    • Human amniocyte cells (Glycotope and CEVEC)

    Cell-free systems Edit

    Cell-free production of proteins is performed in vitro using purified RNA polymerase, ribosomes, tRNA and ribonucleotides. These reagents may be produced by extraction from cells or from a cell-based expression system. Due to the low expression levels and high cost of cell-free systems, cell-based systems are more widely used. [28]


    Information additionnelle

    Authors' contributions

    GC and VS designed the experiments. GC, VS and MG performed the experiments. AP developed the models and AP and DdB conducted simulations. AP, GC and DdB drafted the manuscript. DdB and MdB conceived and supervised the collaboration and overall strategy of the project and edited the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript.

    Giulia Cuccato, Athanasios Polynikis contributed equally to this work.


    Customer Testimonial for our Protein Expression & Purification Services

    "GenScript provides fast, professional protein synthesis services at very reasonable prices. By making it cost-effective to outsource protein production, GenScript has made it possible for my lab to focus on our own area of expertise and get more research done. The detailed planning, updates, and reports that GenScript provides all of the quality control that one could ask for. I strongly recommend GenScript's protein production service."

    — Dr. Barry Bradford, Kansas State University, Department of Animal Sciences & Industry


    Voir la vidéo: Quelle est la meilleure façon de prévenir et détecter le mélanome? (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Dugald

    Je crois que tu as eu tort. Je suis sûr.

  2. Najind

    N'a pas tout à fait bien compris.

  3. Voodookree

    Bravo, tu as une merveilleuse pensée

  4. Sachin

    Que ce soit un message drôle

  5. Rorey

    Les discussions sont toujours bonnes, mais rappelez-vous que toutes les opinions ne sont pas dignes de confiance. Souvent dans des sujets très sérieux et complexes, des commentaires sont insérés par les enfants, parfois cela mène à une impasse. Sans doute, il arrive que les mêmes écoliers puissent donner de bons conseils. Mais c'est plus l'exception que la règle.

  6. Franz

    Namana ça arrive

  7. Malachi

    Je félicite qu'il me semble que c'est l'idée remarquable



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