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Le réactif d'Ellman est-il spécifique des protéines de faible poids moléculaire et des thiols ?

Le réactif d'Ellman est-il spécifique des protéines de faible poids moléculaire et des thiols ?


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Est-il toujours possible de quantifier des protéines de faible poids moléculaire riches en cystéine telles que la métallothionéine dans un échantillon donné à l'aide du réactif d'Ellman si l'échantillon est contaminé par des protéines de poids moléculaire élevé ?


C'est spécifique aux thiols en général. Si les protéines contaminantes contiennent des thiols accessibles aux solvants, le DTNB réagira avec eux.


Introduction

Les thiols, également connus sous le nom de mercaptans, sont une classe de composés organiques qui contiennent un groupe sulfhydryle (–SH) composé d'un atome de soufre et d'un atome d'hydrogène attaché à un atome de carbone [1]. Le pool plasmatique de thiols est principalement constitué de thiols d'albumine, de thiols de protéines et légèrement constitué de thiols de bas poids moléculaire tels que la cystéine (Cys), la cystéinylglycine, le glutathion, l'homocystéine et la -glutamylcystéine [2].

Les thiols (RSH) peuvent subir une réaction d'oxydation via des oxydants et former des liaisons disulfure (RSSR) [3]. Une liaison disulfure est une liaison covalente, la liaison est également appelée liaison SS ou pont disulfure. Dans des conditions de stress oxydatif, l'oxydation des résidus Cys peut conduire à la formation réversible de disulfures mixtes entre les groupements thiols des protéines et les thiols de faible masse moléculaire. Les liaisons disulfure formées peuvent à nouveau être réduites en groupes thiol, ainsi, l'homéostasie dynamique thiol-disulfure est maintenue [4].

Le statut dynamique de l'homéostasie du disulfure de thiol joue un rôle essentiel dans la protection antioxydante, la détoxification, la transduction du signal, l'apoptose, la régulation de l'activité enzymatique et les facteurs de transcription et les mécanismes de signalisation cellulaire [5], [6]. De plus, l'homéostasie dynamique du disulfure de thiol est de plus en plus impliquée dans de nombreux troubles. Il existe également un nombre croissant de preuves démontrant qu'un état anormal de l'homéostasie du disulfure de thiol est impliqué dans la pathogenèse de diverses maladies, notamment le diabète [7], les maladies cardiovasculaires [8], le cancer [9], la polyarthrite rhumatoïde [10], maladie rénale chronique [11], syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) [12], maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, ataxie de Friedreich (FRDA), sclérose en plaques et sclérose latérale amyotrophique [13], [14], [ 15] et des troubles hépatiques [16]. Par conséquent, la détermination de l'homéostasie dynamique du disulfure de thiol peut fournir des informations précieuses sur divers processus biochimiques normaux ou anormaux.

Le taux plasmatique de thiol est le plus souvent mesuré à l'aide du réactif d'Ellman classique, l'acide 5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoïque) (DTNB). Ce composé est réduit stoechiométriquement par des thiols libres dans une réaction d'échange, formant un disulfure mixte et libérant une molécule d'acide 5-thionitrobenzoïque, qui peut être mesurée à 412 nm [17]. Un réactif alternatif au DTNB est la 4,4'-dithiodipyridine (4-DPS) [18]. La réduction du 4-DPS conduit au tautomère de la 4-thiopyridone, et cela peut être mesuré à 324 nm, qui est une longueur d'onde proche de l'ultraviolet. Cette longueur d'onde ne peut pas être utilisée par les analyseurs automatisés car la longueur d'onde la plus basse est de 340 nm dans tous les analyseurs automatisés utilisés dans les laboratoires de chimie clinique.

A notre connaissance, il n'existe pas de méthode de mesure colorimétrique automatisée des niveaux dynamiques plasma/sérum de disulfure [19]. Dans quelques études récentes, les niveaux de disulfure et de thiol des composés disulfure de bas poids moléculaire du plasma ont été déterminés en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) [20], [21], l'électrophorèse capillaire de fluorescence [22] et des systèmes bioluminescents. [23]. Dans ces systèmes sophistiqués, des processus de séparation tels que l'élimination des réducteurs restants, qui sont NaBH4, la Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) et la tributylphosphine, ainsi que la précipitation des protéines, sont également nécessaires [19]. Ces applications de prétraitement et procédures de mesure prennent du temps, demandent beaucoup de travail et sont coûteuses, et nécessitent des techniques compliquées.

Dans cette étude, un nouveau test automatisé déterminant l'homéostasie dynamique thiol/disulfure est décrit et un nouveau concept de groupe de test contenant -S-S-, -SH, -S-S-/-SH, -S-S-/(- SH + –S–S–) et –SH/(–SH + –S–S–) est introduit.


Taux de réactions d'échange thiol-disulfure entre les mono- et dithiols et le réactif d'Ellman

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Résumé

Les groupes thiols dans les molécules biologiques jouent un rôle important dans diverses fonctions physiologiques et conditions pathologiques. Les thiols sont divisés en deux groupes principaux : les thiols protéiques et les thiols non protéiques. De nombreuses méthodes ont été décrites pour les dosages des thiols. La plupart de ces méthodes ont été développées pour le glutathion, le principal thiol non protéique, malgré le fait que les thiols protéiques cellulaires soient plus abondants que le glutathion. En outre, ces méthodes impliquent généralement un processus de préparation d'échantillons biologiques suivi d'une méthode de séparation, et elles prennent du temps. Nous avons rapporté précédemment une série de sulfures de benzofurazan fluorogènes spécifiques du thiol. Ces sulfures de benzofurazan non fluorescents réagissent rapidement et spécifiquement avec un thiol pour former un puissant adduit de thiol fluorescent. La réaction rapide, la nature spécifique des thiols et fluorogène des sulfures a permis d'obtenir une application de l'un des sulfures pour la quantification relative des thiols totaux dans les cellules vivantes par microscopie à fluorescence. Dans ce travail, nous avons utilisé le même composé pour développer la première méthode à haut débit pour la surveillance simultanée des thiols protéiques, des thiols non protéiques et des thiols totaux dans les cellules dans une plaque à 96 puits sur un lecteur de microplaque à fluorescence à λex = 430 nm etem = 520 nm, respectivement. La méthode est rapide et sensible, et a été validée par une méthode de dosage des thiols HPLC. La méthode peut détecter des thiols avec des concentrations cellulaires aussi faibles que 500 cellules/puits. Nous avons également démontré que la méthode peut facilement surveiller les changements dans les niveaux de thiol cellulaire. Bien que la méthode ne puisse pas fournir une quantification absolue pour les thiols car l'intensité de fluorescence des différents adduits de thiols varie, elle fournit une mesure précise de la quantification relative, par rapport au témoin. La méthode sera un outil précieux dans la recherche biomédicale/pharmaceutique liée au thiol.


Matériaux

Tous les réactifs et produits chimiques étaient de qualité analytique ou supérieure. Le réactif d'Ellman (acide 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoïque), l'acide 2-mercaptoéthanesulfonique, le sel de sodium (MES) et d'autres produits chimiques utilisés ont été obtenus auprès de VWR Chemicals (BDH Prolab) et Sigma Aldrich.

Le gel de silice ODS AQ (produit 12S50) a été acheté auprès de YMC Co. Ltd. Kyoto, Japon. Bio-Gel P2 des Laboratoires Bio-Rad Inc.

Tous les solvants utilisés étaient de qualité analytique fournis par Sigma Aldrich ou Merck. Les solvants pour HPLC étaient de qualité Merck LiChroSolv. Europe GMBH.

Les grandes colonnes de verre ont été fournies par Soham Scientific, Fordham, Ely, Cambs., UK

Les cellules LNCaP (cellules d'adénocarcinome humain de la prostate sensibles aux androgènes, clone FGC-ECACC n° 89110211) et PNT2 (une lignée cellulaire épithéliale normale de la prostate humaine immortalisée par le virus SV40) ont été achetées auprès des Public Health England Laboratories (ECACC-HPA) à Porton Down , Salisbury, Angleterre. Les cellules ont été cultivées jusqu'à confluence dans des usines de cellules dans un milieu constitué de RPMI 1640 + 2 mM de glutamine + 1 mM de pyruvate de sodium contenant 10 % de FBS Zone 2. Les cellules confluentes ont été soumises à une incubation de deux heures dans du milieu frais avant d'être récoltées par trypsinisation (Tryple Express). Les comptages cellulaires ont été effectués sur un Nucleocounter NC3000 et les cellules collectées par centrifugation. Les culots cellulaires résultants ont été surgelés et stockés à -80 0 C jusqu'à utilisation.


Résultats

Dans ce rapport, nous avons utilisé la N-acétylcystéine (NAC) et la protéine redox contenant du thiol, la thiorédoxine-1 humaine (Trx1), pour tester si MB est réactif au thiol et modifie de manière covalente les thiols des protéines. Les résultats (Fig. 1 A) montrent que la concentration en thiol libre diminue en fonction de la concentration en MB avec une perte complète lorsque MB:NAC atteint 2:1. Un essai cinétique a montré que la constante de vitesse apparente de 2ème ordre était de 5,03 M -1 s -1 (données non présentées). Nous avons ensuite examiné la réactivité de MB avec la protéine thiol en utilisant Trx1 recombinant comme modèle. Cette protéine contient des résidus thiol accessibles aux solvants, possédant un spectre de réactivité et essentiels à sa fonction biologique [12]. La figure 1B montre une perte stoechiométrique de thiols protéiques due au traitement MB. Trx1 contient 5 résidus Cys et le signal de la biotine a été perdu lors de l'incubation avec MB:Trx1 à un rapport molaire de 5:1, indiquant une modification complète des thiols (soit par adduction, soit par oxydation, voir ci-dessous). La réactivité du MB aux amines primaires a également été étudiée (Fig. 1 C) en utilisant une procédure similaire à la visualisation des thiols de protéine. Après l'incubation de MB, les amines libres ont été marquées et visualisées à l'aide de sulfo-NHS-biotine, comme le montre la figure 1 B. Ces résultats montrent que MB ne réagit pas avec les amines dans les conditions du test, ne modifiant de préférence que les protéines thiols. . La cinétique de la réaction a été étudiée avec un rapport de concentration de 5:1 en utilisant le mPEG2-méthode à la biotine (Fig. 1 D). En accord avec les données de réactivité du NAC, les résultats de cette expérience montrent que la réaction entre MB et Trx1 est relativement lente, approchant la modification complète de tous les thiols Trx1 à 60 & # x000a0min.

Le maneb (MB) est un composé réactif aux thiols. (A) L'ajout de MB à la N-acétylcystéine entraîne une perte de la teneur en thiol telle que mesurée par le réactif d'Ellman. Maneb à un rapport de 2:1 M a entraîné une perte presque complète de thiol. (B) En utilisant la thiorédoxine-1 (Trx1) comme protéine modèle, le maneb provoque stoechiométriquement une perte de thiols protéiques. Protéines thiols marquées au mPEG2-biotine, un N-éthylmaléimide biotinylé, et visualisé en analyse Western blot avec de la streptavidine marquée par fluorescence. (C) MB ne modifie pas les amines détectées par la réaction d'amines libres avec la sulfo-NHS-biotine et l'analyse ultérieure par Western blot avec de la streptavidine marquée par fluorescence. (D) Un cours du temps démontre que le maneb provoque la perte de la plupart des thiols libres en 15 minutes.

L'activité de Trx1 a été évaluée pour déterminer les conséquences fonctionnelles de l'adduction MB. Trx1 a été incubé pendant 1 heure avec MB (5:1, comme ci-dessus), puis dessalé pour éliminer tout MB n'ayant pas réagi avant le test d'activité. Les données montrent que la modification MB de Trx1 a ralenti de 43 % l'oxydation dépendante de Trx1 du NADPH en présence de Trx réductase (Fig. 2 A et B). Contrairement à ces résultats, la réduction de l'insuline catalysée par Trx1 par le DTT n'a montré aucun effet sur l'activité en raison de la modification de MB (données non présentées). L'inhibition incomplète de l'activité malgré la preuve d'une modification presque complète des thiols a indiqué que la modification des thiols dépendante du MB est susceptible d'être réversible.

Le maneb inhibe l'activité de la thiorédoxine-1 (Trx1). Trx1 a été traité avec 5 équivalents de maneb et l'activité a été mesurée en termes de réduction de l'insuline en présence de NADPH et de thiorédoxine réductase-1. Une activité réduite était évidente dans le taux d'oxydation du NADPH (A) et l'activité calculée (B). L'essai avec du DTT comme réducteur au lieu de la NADPH/thiorédoxine réductase n'a pas montré d'inhibition de l'activité (non montré). La perte de thiols protéiques est associée à la formation d'un dimère Trx1 et inversée par l'ajout d'un réducteur. Le réducteur DTT (C) et la N-acétylcystéine (D) peuvent inverser la perte de protéines thiols induite par le maneb.

Pour examiner la réversibilité, le Trx1 modifié par MB a été incubé avec 1 mM DTT, et la teneur en thiol a été examinée avec mPEG2-biotinylation et Western blot comme ci-dessus. Les résultats ont montré que la bande correspondant à la forme thiol non modifiée de Trx1 était restaurée (Fig. 2 C). Le titrage avec du NAC (augmentant le rapport NAC:MB de 0 à 13,3) a montré qu'un excès de NAC supérieur à 5 fois était nécessaire pour restaurer tous les thiols (Fig. 2 D). Les résultats montrent donc que la modification de Trx1 par MB est complètement réversible par traitement avec des thiols.

La cristallographie aux rayons X a montré que la Trx1 oxydée est cristallisée sous la forme d'un dimère formé par un disulfure entre les résidus C73 [14]. Nous avons étudié la possibilité que le traitement MB ait provoqué la formation d'un dimère Trx1 en traitant Trx1 avec des concentrations croissantes de MB, une séparation via SDS-PAGE dans des conditions non réductrices et une visualisation avec du bleu de Coomassie (Fig. 3 A). Les données démontrent que MB entraîne l'apparition d'une bande à 25 kD, correspondant à deux fois le poids moléculaire de Trx1, avec aussi peu que 1 M équivalent de MB. Ce résultat indique qu'un seul résidu Cys est impliqué dans la dimérisation.

Le traitement MB amène Trx1 à former un dimère qui est inversé par le DTT (A). L'analyse spectrale de masse de Trx1 intact (B) et de Trx1 modifié par MB montre (C) une seule modification MB (ajout de 210 unités de masse correspondant à l'ajout de l'éthylène bis-dithiocarbamate (EBDTC)). L'astérisque (*) désigne un m/z correspondant à un adduit potentiel Mn-Trx1 (+54,9).

En raison de l'observation de la réticulation des protéines médiée par MB, nous avons mené des études LC&# x02013MS de Trx1 intact et traité au MB en utilisant ESI en mode d'ionisation positive et une détection avec un LTQ-Orbitrap-Velos (Thermo). Ces expériences ont abouti à la détection de Trx1 et d'un seul produit modifié (Fig. 3 B et C). Dans l'échantillon modifié par MB, nous avons observé une forte diminution de l'intensité du pic Trx1 non modifié (m/z 11,602) et un nouveau pic (m/z 11,810) causée par la liaison du bis-dithiocarbamate d'éthylène (EBDTC) à Trx1, entraînant un décalage de masse de 210 unités de masse par rapport au pic non modifié. Ce résultat suggère que le MB ne provoque pas une simple oxydation des thiols en disulfures mais participe plutôt à des processus réactionnels plus complexes.


Résumé

Les protéines tyrosine phosphatases (PTP) jouent un rôle important dans la régulation de la transduction du signal chez les mammifères. Au cours de certains processus de signalisation cellulaire, la génération de peroxyde d'hydrogène endogène inactive les PTP sélectionnés via l'oxydation du groupe thiolate de cystéine catalytique de l'enzyme. Il est important de noter que les thiols de faible poids moléculaire et de protéines dans la cellule ont le potentiel de régénérer les PTP catalytiquement actifs. Ici, nous avons examiné la récupération de l'activité catalytique de deux PTP inactivés par oxydation (PTP1B et SHP-2) par divers thiols de faible poids moléculaire et l'enzyme thiorédoxine. Tous les monothiols examinés ont régénéré l'activité catalytique de la PTP1B oxydée, avec des constantes de vitesse apparentes qui variaient d'un facteur d'environ 8. En général, les molécules à faible pKune les groupes thiols étaient particulièrement efficaces. Le thiol glutathion biologique a réparé le PTP1B oxydé avec une constante de vitesse apparente de second ordre de 0,023 ± 0,004 M –1 s –1 , tandis que le dithiol dithiothréitol (DTT) affichait une constante de vitesse apparente de second ordre de 0,325 ± 0,007 M –1 s – 1 . L'enzyme thiorédoxine a régénéré l'activité catalytique de la PTP1B oxydée à un rythme sensiblement plus rapide que le DTT. La thiorédoxine (2 M) a converti la PTP1B oxydée en sa forme active avec une constante de vitesse observée de 1,4 × 10 –3 s –1 . Les vitesses auxquelles ces agents régénéraient la PTP1B oxydée suivaient l'ordre Trx > DTT > GSH et des valeurs comparables observées à 2 M de Trx, 4 mM de DTT et 60 mM de GSH. Divers disulfures qui sont des sous-produits du processus de réactivation n'ont pas inactivé la PTP1B native à des concentrations de 1 à 20 mM. L'agent réducteur biochimique commun tris(2-carboxyéthyl)phosphine régénère l'activité enzymatique de la PTP1B oxydée un peu plus rapidement que les réactifs à base de thiol, avec une constante de vitesse de 1,5 ± 0,5 M –1 s –1 . Nous avons observé de profondes différences cinétiques entre la régénération thiol-dépendante de l'activité de PTP1B oxydé et SHP-2, mettant en évidence le potentiel des différences structurelles dans diverses PTP oxydées à jouer un rôle significatif dans les taux auxquels les thiols de faible poids moléculaire et contenant des thiols des enzymes telles que la thiorédoxine et la glutarédoxine renvoient une activité catalytique à ces enzymes lors d'événements de signalisation cellulaire.


RÉSULTAT ET DISCUSSION

Nous croyons fermement que seul le développement de sondes chimiques capables de piéger sélectivement le SO2H permettra une élucidation claire du rôle de la sulfinylation des protéines. Dans ce cadre, nous avons récemment développé la chimiosélectivité S acide ulfinique N itroso L igation (SNL). 16 L'ajout de SO2Les composés H à C-nitroso sont connus depuis plus d'un siècle, cependant, l'adduit résultant est labile aux bases (figure S1). Afin de piéger cette espèce instable, nous avons incorporé un centre électrophile ( Figure 1 ) dans le ortho-position d'un dérivé nitroso-benzène (1). L'oxyanion transitoire (2) réagit avec l'ester par trans-estérification intramoléculaire pour former une benzisoxazolone stable (3). En nous basant sur cette idée, nous avons synthétisé une classe de composés C-nitroso qui montrent une réactivité rapide avec le SO de faible poids moléculaire.2H. Ces réactifs ne réagissent pas avec d'autres nucléophiles biologiquement pertinents en dehors des thiols, qui, cependant, ne forment pas d'adduits stables (Figure S2).

Marquage chimiosélectif de l'acide sulfinique avec des composés aryl-nitroso.

Utilisation du SNL pour le marquage des acides sulfiniques protéiques

Forts de ces résultats, nous avons employé SNL développer des sondes chimiques pour la détection de la sulfinylation des protéines. Tout d'abord, nous avons exploré la capacité de NO-Ph ( Figure 2 ), le dérivé C-nitroso qui a montré la meilleure réactivité, pour modifier le SO2H au sein du double mutant (C64,82S) de la thiol peroxydase Gpx3 de levure. 17 En présence de H2O2, GPx3 forme une liaison disulfure intramoléculaire par sulfénylation du C36 catalytique, suivie d'une condensation avec le C82 résolvant. La mutation de C82 en sérine stabilise le Cys36-SOH transitoire, permettant son oxydation contrôlée en SO2H (voir Informations complémentaires).

Sondes nitroso pour le marquage sélectif des acides sulfiniques protéiques.

Incubation de NO-Ph avec C64,82S Gpx3-SO2H (22772 Da) donne le produit d'addition de sulfonamide attendu (22949 Da) comme confirmé par l'analyse ESI-LC/MS (figure 3A). Nos expériences préliminaires avec de petites molécules ont montré que les thiols réagissent avec les composés C-nitroso pour donner un adduit sulfénamide instable, qui est clivé par réaction avec un second thiol (Figure S2). Afin de confirmer ces résultats avec la protéine-SH, nous avons traité C64,82S GPx3 (22740 Da) entièrement réduit avec NO-Ph, suivi d'une incubation avec du DTT. Étonnamment, ESI-LC/MS a révélé la formation d'un adduit stable avec une masse de 22935 Da (figure 3B). L'alkylation du résidu Cys avec du N-éthylmaléimide (NEM), à l'inverse, a empêché la formation d'adduits (figure 3C). Même en considérant que le DTT était incapable de cliver le sulfénamide formé par l'ajout de NO-Ph à Cys36, l'augmentation de masse détectée (Δm = 195) ne correspond pas à l'adduit attendu (Δm = 177). Généralement, l'ajout de thiol au composé C-nitroso aryle donne un semimercaptale instable, qui peut réagir avec une seconde molécule de thiol ou subir un réarrangement pour former un sulfinamide plus stable (figure S3). 18 Le réarrangement spontané se produit via la dissociation d'un anion hydroxyle et la formation d'un intermédiaire d'ion nitrénium cationique, qui est ensuite hydrolysé par l'eau. En suivant la même voie, l'ajout de NO-Ph au C64,82S GPx3-SH formerait un adduit sulfinamide avec une augmentation de masse de 195 Da, ce qui correspond exactement à nos observations. L'environnement acide favorise généralement le réarrangement semi-mercaptale. Avec NO-Ph, cependant, une fois que la benzisoxazolone est générée, le réarrangement semble se produire même à pH neutre, probablement parce que le groupe carboxylate est beaucoup plus enclin à se dissocier de l'atome d'azote que l'anion hydroxyle (Figure S4). La formation du sulfinamide réarrangé expliquerait également pourquoi l'adduit n'a pas été réduit par le DTT. Étant donné que la formation de sulfinamide n'a jamais été observée avec des thiols de faible poids moléculaire, 16 nous nous sommes demandé pourquoi le réarrangement s'est produit avec la protéine SH. Nous avons émis l'hypothèse que, dans de tels cas, l'attaque d'une seconde molécule de thiol sur le sulfénamide transitoire est généralement plus rapide que le réarrangement de ce dernier. Une fois que le sulfénamide est formé, cependant, l'attaque d'une seconde Cys-SH serait exclue avec l'utilisation de C64,82S GPx3-SH en raison de l'encombrement stérique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons testé la réactivité de NO-Ph vers C64S GPx3, qui possède à la fois des cystéines actives redox et des cystéines résolvantes. Comme prévu, l'incubation du C64S GPx3 avec NO-Ph exclusivement favorisé la formation du disulfure interne (figure 3D). La présence de la Cys résolvante, qui peut facilement interagir avec l'adduit sulfénamide formé avec la Cys catalytique, empêche le réarrangement de cette dernière. Ce résultat suggère que la formation de sulfinamide et de disulfure stables reflète des voies de réaction compétitives influencées par des facteurs cinétiques (Figure S5). Comme preuve supplémentaire, nous avons incubé du 2-méthyl 2-propanethiol avec un excès de NO-Ph. Dans ce cas, nous avons supposé que, parce que l'interaction de deux molécules de thiols serait plus entravée pour l'encombrement stérique, le réarrangement des sulfénamides serait facilité. Comme prévu, les analyses LC-MS ont montré la formation du produit d'addition de sulfinamide attendu (Figure S6).

Spectres ESI-LC/MS de (A) C64,82S GPx3-SO2H, (B) C64,82S Gpx3-SH, (C) C64,82S Gpx3-S-NEM et (D) C64S Gpx3-SH avant et après traitement avec NO-Ph. Chaque forme GPx3 a été incubée avec NO-Ph (40 équivalents) pendant 1 h à température ambiante dans du PBS pH 7,4.

Blocage sélectif des résidus de cystéine libres

Le réarrangement des sulfénamides limite apparemment l'utilisation de SNL pour la détection de la sulfinylation des protéines. Comme le suggère l'expérience avec le NEM, cependant, la protection des cystéines libres peut être employée pour empêcher la formation d'adduits non réductibles avec des thiols encombrés. En fait, de nombreuses méthodes chimiques pour la détection de modifications spécifiques des thiols (par exemple, la S-nitrosylation) impliquent le blocage sélectif des thiols réduits. 19 Le succès de ces tests repose sur la sélectivité de l'étape de blocage des thiols et l'efficacité du réactif à protéger pleinement les thiols libres sans réaction croisée avec le SO2H. Nous avons évalué la réactivité de plusieurs réactifs bloquant les thiols vis-à-vis du C64,82S Gpx3-SO2H. Lorsque nous avons utilisé un grand excès d'agents alkylants courants tels que le NEM ou l'iodoacétamide (IAM), les analyses ESI-LC/MS ont détecté des quantités faibles mais significatives d'acide sulfinique alkylé (Figures S7A et S7B). Bien que ce résultat puisse sembler inattendu, la réaction du SO de bas poids moléculaire2H avec des accepteurs de Michael et des composés a-halogénocarbonyles a été rapporté. 20 Inversement, les composés réactifs au sulfhydryle qui favorisent les formations de disulfure mixte, tels que le 2,2′-dipyridyl disulfure (DPS) et le S-méthyl méthanethiosulfonate (MMTS), n'ont montré aucune réactivité croisée vis-à-vis du SO.2H (figures S7C et S7D). Ensuite, nous avons examiné si la protection des résidus Cys libres en tant que disulfures était suffisante pour empêcher la réactivité croisée avec NO-Ph. Après que C64S, 82S GPx3-SH ait été pré-incubé avec du DPS (Figure S8A) ou du MMTS (Figure S8B), l'excès de réactifs bloquant les thiols a été éliminé et la protéine a été incubée avec NO-Ph. Les analyses ESI-LC/MS ont confirmé que le DPS et le MMTS bloquaient efficacement la formation du produit d'addition sulfinamide avec la protéine réduite.

Conception et synthèse de NO-Bio

Ayant établi que SNL peut être utilisé efficacement pour marquer la protéine SO2H, nous avons conçu et synthétisé NON-Bio ( Figure 2 ). La nouvelle sonde chimique combine l'ogive C-nitroso (bleue) avec une poignée en biotine (violette), qui permet la détection de la sulfinylation des protéines dans les échantillons biologiques. La synthèse de NON-Bio (Figure S9), qui est décrite en détail dans les informations de support, impliquait le couplage de Biotine-PEG4-NHS disponible dans le commerce avec un lieur diamino, N-tert-Butoxycarbonyl-1,6-hexanediamine. Le groupe amino protégé a ensuite été clivé par traitement au TFA, et l'aminé primaire générée a été couplée à l'ester N-succimidyle de NO-Ph pour donner NO-Bio, qui a été purifié par HPLC en phase inverse.

Développement d'une approche chimique pour la détection d'acide sulfinique protéique

Comme le montre la figure 4A, la sulfinylation des protéines pourrait être détectée sélectivement par une méthode en deux étapes. Dans le premier, un composé réactif au sulfhydryle (DPS ou MMTS) est introduit pour bloquer sélectivement les résidus Cys libres. Ensuite, l'échantillon est traité avec la sonde biotine-tag, NON-Bio, pour marquer les acides sulfiniques. Nous avons testé cette approche en utilisant le DJ-1 recombinant comme modèle. La protéine associée de Parkinson a un résidu Cys conservé, C106, qui est extrêmement sensible au stress oxydatif et a tendance à former un SO2H stable. De nombreuses études démontrent que DJ-1 protège les cellules contre l'apoptose induite par le stress oxydatif par la formation de C106-SO2H. 21,22 De plus, DJ-1 contient deux autres résidus Cys libres, C46 et C53, qui ne sont pas redox-actifs. Bien que C53 ne soit pas modifié par ROS, il est toujours très réactif envers les électrophiles. 23 Par conséquent, DJ-1 représente un excellent modèle pour tester la sélectivité de notre stratégie. Le WT DJ-1 réduit ou oxydé a été incubé avec du DPS, suivi d'un traitement avec NON-Bio. Comme le montre la figure 4B, l'analyse de masse a clairement confirmé la modification sélective du DJ-1 uniquement oxydé. Fait intéressant, le DPS a favorisé la formation d'un disulfure interne entre C46 et C53. Nous avons supposé que le DPS réagirait d'abord avec le C53 hautement exposé aux solvants pour produire un disulfure mixte. Plus tard, le C46 relativement plus profondément enfoui attaquerait le disulfure actif avec pour conséquence la génération d'une liaison disulfure interne (figure S10). Une protection sélective de la Cys libre peut également être obtenue en utilisant le MMTS (Figure S11). Cependant, nos résultats indiquent que le MMTS réagit avec les thiols à une vitesse relativement plus lente que le DPS. En fait, de petites quantités de Cys-SO2H ont été détectées même dans l'échantillon réduit, ce qui indique que le C106 a été partiellement oxydé pendant le blocage du thiol. Bien que l'ajout d'EDTA dans le tampon ait empêché cette oxydation indésirable, nous avons choisi d'utiliser le DPS le plus efficace dans toutes les expériences ultérieures. Le manche en biotine de la sonde permet la visualisation des protéines marquées par transfert de streptavidine. Par conséquent, la sélectivité de NON-Bio le marquage a également été confirmé par une analyse Western blot. DJ-1 réduit ou oxydé a été traité avec du DPS, suivi d'une incubation avec NON-Bio. Les réactions ont ensuite été soumises à SDS-PAGE et analysées par transfert de streptavidine. Traitement du DJ-1 oxydé avec NON-Bio a permis un marquage sélectif des protéines, tandis que DJ-1 n'a pas été détecté du tout par transfert de streptavidine en l'absence de l'oxydant, démontrant la spécificité de notre approche chimiosélective (Figure S12). NON-Bio a également montré une sensibilité plus élevée par rapport à un anticorps disponible dans le commerce contre DJ-1 hyperoxydé (figure S13), permettant la détection de DJ-1 sulfinylé à des concentrations relativement faibles.

Marquage de l'acide sulfinique DJ-1 avec NO-Bio.

DJ-1 possède un résidu G18 hautement conservé, qui facilite l'ionisation de C106, réduit son pKune, et aide à stabiliser C106-SO2H. De petits changements dans cette position peuvent considérablement influencer les propriétés oxydatives du C106. 24 Par exemple, le mutant E18D DJ-1 a une plus faible propension à former du SO2H, mais le mutant E18N structurellement similaire montre une propension à l'oxydation accrue grâce à une forte stabilisation de C106-SO2H. Nous avons évalué la sensibilité de NON-Bio, sondant les différentes propensions à l'oxydation de divers mutants DJ-1, y compris C106S DJ-1, qui ne contient pas de cystéine à activité redox. Chaque variante DJ-1 (WT, E18N, E18D et C106S) a été exposée à H2O2, traité avec du DPS, et enfin incubé avec NON-Bio. L'analyse Western blot était cohérente avec les résultats attendus (figure 4c). E18N DJ-1 a montré une fraction plus élevée de sulfinylation, même en l'absence de H2O2. Le niveau de sulfinylation du mutant E18D exposé au stress oxydatif, en revanche, était presque négligeable. Il est à noter que le C106S DJ-1 traité avec H2O2 n'a pas été détecté par transfert de streptavidine, confirmant que seul le C106 est capable de former du SO2H dans des conditions d'oxydation relativement douces.

NO-Bio détecte les protéines modifiées par l'acide sulfinique dans le lysat cellulaire

Après avoir établi la spécificité et la sensibilité de notre approche en deux étapes dans des solutions de protéines homogènes, nous avons ensuite recherché si NON-Bio pourrait détecter la protéine-SO2H dans un lysat cellulaire complexe non fractionné. À cette fin, nous avons testé notre chimie optimisée dans un extrait de cellules entières de cancer du col de l'utérus humain (HeLa), obtenu en lysant les cellules dans un tampon RIPA modifié contenant de la catalase et du DTT. Le tampon de lyse réducteur empêche la poursuite de l'oxydation du SO2H et maintient Cys libre sous forme réduite, évitant la surestimation de la sulfinylation des protéines. La figure 5A montre un western blot HRP-streptavidine, qui indique que des niveaux robustes de protéine SO2H peut être détecté dans des conditions normales. Pour démontrer que le DPS piégeait efficacement tous les thiols libres et donc que le transfert de streptavidine ne révélait que des protéines sulfinylées, nous avons utilisé l'iodoacétyl-PEG2-biotine (IAM-Bio). Le réactif biotinylé est capable d'alkyler des thiols tels que des résidus Cys libres. Le prétraitement de l'échantillon avec du DPS a complètement abrogé le signal IAM-Bio-dépendant (figure 5A, piste 3), ce qui a indirectement prouvé que NON-Bio n'a réagi qu'avec la protéine SO2H. Ensuite, nous avons déterminé si notre approche chimique pouvait détecter des augmentations de la sulfinylation des protéines dans la culture de cellules humaines. Les cellules HeLa ont été incubées avec des quantités croissantes de H2O2 pendant 15 minutes (ce moment a été choisi après une expérience préliminaire en fonction du temps - Figure S14A), lysée, puis étiquetée comme décrit ci-dessus. L'analyse Western blot a montré que le niveau de sulfinylation des protéines était augmenté par H2O2 d'une manière dose-dépendante (Figure S14B). Pris ensemble, ces résultats confirment que SO2H est suffisamment stable pour être détecté avec succès dans les lysats cellulaires et ne nécessite pas in vivo étiquetage.

Réactivité de No-Bio dans les lysats cellulaires - 5 μg de protéine chargée par piste - (A). Analyse de la sulfinylation des protéines dans les lysats de tissus tumoraux pulmonaires humains - 1 μg de protéine chargée par voie - (B). Légende : T1-001-T1 Adénocarcinome papillaire T1-001-N1 Tissu normal apparié T1-005-T1 Adénocarcinome T1-005-N1 Tissu normal apparié T1-013-T1 Carcinome adéno-squameux T1-013-N1 Tissu normal apparié.

Taux de sulfinylation des protéines dans le cancer du poumon humain

Afin de montrer que notre méthode peut être appliquée à des questions biologiques plus complexes, nous avons effectué un profilage comparatif de l'acide sulfinique dans le tissu tumoral pulmonaire humain. Pour ces expériences, la sulfinylation des protéines a été caractérisée par une analyse western blot de lysats de cellules entières. Nos résultats ont montré une présence très variable de SO2H parmi les trois échantillons de tissu tumoral du patient (figure 5B). Les trois tissus tumoraux (adénocarcinome papillaire, adénocarcinome et carcinome adéno-squameux) présentaient une augmentation significative de l'étendue du SO2Modifications H par rapport aux tissus normaux appariés. Bien que le nombre d'échantillons était trop petit pour tirer des conclusions générales, ces premières observations suggèrent que des niveaux élevés de SO2H pourrait être utilisé comme marqueur du cancer.


Redox et Thiols en Archaea

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

  • Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout
  • p.11, l. 352 unclear sentence
  • p.12, l. 364 add UDP in Appendix A
  • p.12, l. 391 closing round bracket missing

Comments and Suggestions for Authors

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout

Response: We now use &gammaGC consistently throughout the manuscript. We no longer alternate with &gamma-GC.

p.11, l. 352 unclear sentence

Response: We corrected the sentence with stating cysteine instead of CoA. This correction now clarifies the sentence.

p.12, l. 364 add UDP in Appendix A

Response: UDP is now defined in Appendix A.

p.12, l. 391 closing round bracket missing

Response: The closing round bracket is now added.

Manuscript antioxidants-775988 by Rawat and Maupin-Furlow

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

  1. 67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite
  2. 276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here
  3. 311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA
  4. 332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite
  5. 334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase
  6. 371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

  1. 30 such as
  2. 38 the canonical pathway
  3. 76 auto-oxidation
  4. 107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo
  5. 109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors
  6. 140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo
  7. 187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?
  8. 202 &lsquoinsulin&rsquo instead of &lsquoinulin&rsquo
  9. 210 InterPro
  10. 266 &lsquosequences&rsquo
  11. 275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing
  12. 281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing
  13. 322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing
  14. 333 correct citation name
  15. 358 &lsquothan&rsquo instead of &lsquothat&rsquo
  16. 359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo
  17. 387 &lsquoto involve to&rsquo?
  18. 390-391 &lsquoan archaeal&rsquo
  19. 411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

Response: Thanks, we have altered this section of the manuscript to enhance organization and highlight the insight provided on thioredoxins in Archaea including reference to methanogens.

67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite

Response: Thanks, we have rewritten these sentences to emphasis the theme of this section is focused on GSH synthesis.

276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here

Response: we now state that DTNB would presumably oxidize all of the &ndashSH groups.

311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA

Response: we now state that it [leads to the induction of expression of the gene encoding OhrA]

332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite

Response: transition now added.

334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase

Response: this point is now corrected.

371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Response: we have reorganized this paragraph to more clearly explain this section of the manuscript.

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

Response: we now consistently use archaea in a general manner - since we do not specifically state Archées domain in the text.

Response: corrected to autoxidation.

107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo

109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors

Response: corrected to all &lsquoand&rsquo.

140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo

187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?

Response: corrected all Interpro to InterPro.

275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing

Response: Ellman's reagent [(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) or DTNB)] is now defined.

281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing

Response: Docosahexaenoic acid (DHA) and bis(2‐hydroxyethyl) disulfide (HED) are now defined.

322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing

Response: dithiothreitol (DTT) is now defined.

333 correct citation name

Response: We were unclear what is meant by this point but have added that the information is related to the binding of MsvR to its own promoter to clarify which promoter is under discussion if this is what the reviewer meant.

line 333 is related to the following: Incubation of oxidized MsvR with the M. acetivorans thioredoxin system, consisting of NADPH, thioredoxin reductase and one of the 7 thioredoxins, leads to reduction of the cysteines and binding to its own promoter [105].

The citation references the work by the following which appears appropriate for the information presented:

Sheehan, R. McCarver, A.C. Isom, C.E. Karr, E.A. Lessner, D.J. The Methanosarcina acetivorans thioredoxin system activates DNA binding of the redox-sensitive transcriptional regulator MsvR. J Ind Microbiol Biotechnol 2015, 42, 965-969, doi:10.1007/s10295-015-1592-y.

359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo

411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Response: the shade of gray is now darker for better contrast.

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

Response: FTR/FDR added to legend with explanation and citation.

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. Biochimie. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Line 163 Please change Halobacterium salinarum à H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus à P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobacées famille

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii dans P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus dans S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus dans S. solfataricus

Lane 320 Insert the follow reference: Lipscomb, G.L. , Schut, G.J. Scott RA, Adams, M.W.W. SurR is a master regulator of the primary electron flow pathways in the order Thermococcales. Mol Microbiol 2017, 104, 869-881, doi: 10.1111/mmi.13668

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus dans P. furiosus et Sulfolobus solfataricus dans S. solfataricus

Comments and Suggestions for Authors

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

Response: we replaced the , with : to avoid confusion and clarify that bacillithiol is one example of a LMW thiol that differs from GSH.

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. Biochimie. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Response: Thanks, we now include all of this information in the manuscript text in the section which discusses Prxs and the work performed in archaea. The references listed above and citations are now in the main body of the text.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

Response: We now use GRX and TRX throughout the manuscript.

Line 163 Please change Halobacterium salinarum à H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus à P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobacées famille

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii dans P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus dans S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus dans S. solfataricus

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus dans P. furiosus et Sulfolobus solfataricus dans S. solfataricus

Response: We have made all of these taxonomic changes and now use appropriate abbreviations.



Commentaires:

  1. Voodooramar

    It is exact

  2. Macnachtan

    Well, people, you wet!

  3. Vern

    Je serai libre - j'écrirai certainement ce que je pense sur cette question.

  4. Caolaidhe

    Je suis désolé, cela a gêné... Mais ce thème est très proche de moi. Écrivez en MP.

  5. Abdul-Haqq

    C'est conforme, c'est une excellente pensée



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