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A1. Catalyse acide et basique générale - Biologie

A1. Catalyse acide et basique générale - Biologie



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Les réactions en solution qui ne sont pas catalysées sont lentes car le développement et la séparation des charges se produisent dans l'état de transition. Lorsque des liaisons sont établies ou rompues, il se forme souvent des intermédiaires chargés dont l'énergie est supérieure à celle des réactifs. Étant donné que l'intermédiaire est plus énergétique que les réactifs, l'état de transition serait encore plus énergétique et ressemblerait donc plus à l'intermédiaire chargé. Tout ce qui peut stabiliser les charges sur l'intermédiaire et donc les charges en développement dans les états de transition abaissera l'énergie de l'état de transition et catalysera la réaction. Dans cette section, nous étudierons le mécanisme sous-jacent à la catalyse par de petites molécules de réactions chimiques. Vraisemblablement, le catalyseur macromoléculaire biologique (comme les enzymes protéiques) utilisera des mécanismes similaires dans leurs effets catalytiques (qui seront discutés dans la section suivante).

Les catalyseurs, y compris les enzymes, peuvent employer au moins 5 manières différentes de stabiliser les états de transition.

Le développement de charge dans le TS peut être diminué soit par le don d'un proton d'acides généraux (comme l'acide acétique ou un cycle indole protoné) à un atome tel qu'un carbonyle O qui développe une charge négative partielle dans le TS lorsqu'il est attaché par un nucléophile. Le don de protons diminue le développement négatif dans le TS. Alternativement, un nucléophile tel que l'eau qui développe une charge positive partielle dans le TS lorsqu'il commence à former une liaison avec un C électrophile dans un carbonyle peut être stabilisé par la présence d'une base générale (telle que l'acétate ou le cycle indole déprotoné) . L'abstraction de protons diminue la charge positive en développement

Figure : ÉVOLUTION DE LA CHARGE DANS L'ÉTAT DE TRANSITION POUR L'HYDROLYSE DE L'ESTER

Figure : MÉCANISME DE CATALYSE GÉNÉRALE DES ACIDES

Figure : MÉCANISME DE CATALYSE DE BASE GÉNÉRALE


A1. Catalyse acide et basique générale - Biologie

Comment les enzymes obtiennent-elles des améliorations de vitesse aussi élevées dans des conditions modérées de pH, de température et de pression ?

Examinons quelques-unes des nombreuses façons dont les enzymes effectuent la catalyse.

N'oubliez pas que les mécanismes catalytiques ne peuvent généralement pas être observés, car les structures des protéines peuvent être obtenues par cristallographie aux rayons X, mais sont plutôt déduites des structures cryastal et d'une variété d'autres approches

1) Hydrolyse acide générale (hydrolyse basique générale)

Est utilisé par de nombreuses enzymes. Considérez l'hydrolyse des esters, qui est catalysée par un acide ou une base.

(Dans les réactions ci-dessous, venez en classe pour obtenir des détails.)

L'hydrolyse acide générale fait référence à un transfert partiel de protons d'un donneur de protons (un acide général) à un substrat, par exemple pour stabiliser l'état de transition. Les formes protonées de His, Asp et Glu peuvent fonctionner comme des acides généraux. Aussi Tyr, Cys et Lys. L'état de transition dans cette réaction serait une forme tétraédrique, similaire à celle illustrée ci-dessus.

De même, la catalyse basique générale fait référence à l'abstraction partielle de protons par un accepteur de protons illustré ci-dessous :

La catalyse basique générale peut être réalisée par les formes non protonées des acides aminés listés ci-dessus : Asp, Glu, His, Tyr, Cys, Lys.

Il est possible qu'un seul résidu d'acide aminé participe à la fois à la catalyse acide générale et basique générale à différents points d'un seul cycle enzymatique.

Une liaison covalente se forme entre l'enzyme et le substrat au cours du cycle enzymatique.

  • 1) attaque nucléophile du substrat par un groupe enzymatique (par exemple, groupe amino)
  • 2) retrait électrophile des électrons du substrat
  • 3) feuilles du groupe nucléophile, régénérant l'enzyme d'origine

L'exemple est montré dans le texte : Fig 11-9, pour la décarboxylation de l'acétoacétate, catalysée par une amine.

Les résidus typiques utilisés en catalyse covalente sont Lys, His, Cys, Asp, Glu, Ser, ainsi que certains coenzymes

La forme nucléophile de ces résidus est la forme non protonée.

Les ions métalliques sont utilisés en catalyse

  • a) Fortement lié aux enzymes, par ex. Fe, Cu, Zn (Voir exemple FeS)
  • b) Lâchement lié, comme dans les complexes transitoires de Mg-ATP
  • orientation de la liaison du substrat (via la charge)
  • réactions d'oxydo-réduction (transfert d'électrons)
  • stabilisation électrostatique de la charge négative (dans le substrat ou l'état de transition)

exemple anhydrase carbonique

Zn 2+ a besoin de 4 ligands. Il possède 3 ligands His de la protéine et 1 molécule d'eau sous forme d'OH-

Le Zn 2+ stabilise l'hydroxyde, lui permettant d'attaquer le CO2.

OH - est régénéré par le Zn 2+ de l'eau

Pour plus d'informations sur l'anhydrase carbonique, voir l'exercice interactif de la figure 11-11 sur le CD-ROM

4) Catalyse électrostatique

Cela fait référence à l'amélioration des interactions électrostatiques dans l'environnement non polaire de l'intérieur des enzymes.

H2O est généralement exclu des sites actifs, sauf lorsqu'il est nécessaire par voie catalytique. Cela crée un environnement à faible diélectrique où les interactions électrostatiques sont plus fortes.

Les interactions enzyme-état de transition qui impliquent une stabilisation de la charge sont améliorées.

5) Proximité et orientation

Ceux-ci font référence à l'importance de l'arrangement précis des groupes catalytiques sur le site actif.

Les résidus catalytiques de la trypsine sont Ser et His, mais ces chaînes latérales (méthanol et imidazole) n'augmentent pas sensiblement la vitesse de protéolyse non enzymatique en solution.

La proximité est importante car tous les groupes nécessaires sont fournis par l'enzyme au substrat lorsqu'elle se lie au site actif. La "concentration efficace" est augmentée. L'orientation est également importante. parce que les chaînes latérales dans les protéines sont relativement "fixes", et les considérations géométriques sont importantes dans la catalyse.

Liaison d'état de transition préférentiel

Il s'agit d'interactions entre l'enzyme et l'état de transition qui n'existent pas dans le complexe substrat enzymatique

Ceci est lié au concept de "souche", selon lequel l'enzyme déformera le substrat pour le rendre plus proche de l'état de transition, par ex. géométriquement.

Pour augmenter la catalyse par une enzyme, il est absolument nécessaire d'augmenter les interactions enzyme-état de transition par rapport aux interactions substrat enzymatique

Une enzyme efficace stabilise S ‡ plus que S.

L'enzyme doit se lier au substrat, avec la bonne orientation, mais pas nécessairement aussi étroitement.

Une enzyme parfaite ressemble à ce qui suit, dans lequel toutes les barrières sont à peu près les mêmes. Ainsi, la liaison du substrat et la libération du produit se produisent à des vitesses pas plus rapides que l'étape de réaction.

Une conséquence de la théorie des états de transition est que les analogues des états de transition devraient être de puissants inhibiteurs compétitifs.

Les produits sont généralement des inhibiteurs de la concurrence, car ils ressemblent toujours, dans une certaine mesure, à des substrats.

Ce raisonnement a conduit à la production d'anticorps catalytiques.

Les anticorps sont des protéines synthétisées par le système immunitaire, qui présentent une liaison spécifique à haute affinité avec d'autres molécules.

Si un anticorps se lie étroitement à un analogue d'état de transition, il peut également fonctionner comme une enzyme pour cette réaction particulière.

Sur la base de cette stratégie, de nombreux anticorps catalytiques ont été générés, pour une variété de réactions.

Il faut synthétiser un analogue d'état de transition approprié, l'injecter dans un lapin et récolter l'anticorps en quelques mois.

Voir le lien vers la liaison à l'antigène par l'anticorps.

Dépendance au pH de la cinétique enzymatique :

De nombreuses enzymes présentent des taux qui varient avec le pH. Cela reflète que l'état de charge ou de protonation d'un ou plusieurs groupes peut influencer la catalyse.

1) Le site actif de l'enzyme contient un groupe qui doit être protoné ou non protoné. Cela peut affecter à la fois les étapes catalytiques et de liaison.

2) Un changement de conformation peut se produire dans l'enzyme en raison de la protonation/déprotonation, et un état est moins actif ou inactif. Cela pourrait être la perte d'une paire d'ions.

3) Le substrat peut contenir un groupe dont l'état de protonation affecte la liaison à l'enzyme.

Vous trouverez ci-dessous 3 types typiques de dépendance au pH de l'activité enzymatique.

Que pouvons-nous apprendre de telles intrigues ?

Si la parcelle a un plateau, le pKune La valeur sera révélée comme le milieu de la transition (indiquée par un point).

Du pKune valeur, nous pouvons deviner l'acide aminé impliqué, mais pas avec certitude.

Par exemple, pKune 3-5 suggèrent Asp ou Glu

Cependant, ces pKune les valeurs d'Asp ou de Glu pourraient être décalées, comme expliqué précédemment :

Dans une paire d'ions, le pKune de l'acide sera déplacé vers le bas, car il sera plus difficile de protoner l'acide (et de perdre la charge nécessaire)

Dans un environnement non polaire, le pKune de l'acide sera déplacé vers le haut car il sera plus difficile de déprotoner l'acide, créant une charge défavorable.

A partir de la dépendance du pH, nous pouvons facilement déterminer si la forme protonée ou non protonée est l'état actif. Si une activité élevée se produit à un pH élevé, alors la forme non protonée est l'état actif.


  • Ici, l'enzyme protone ou déprotone le substrat pour abaisser l'énergie libre de l'état de transition.
    • L'enzyme peut agir comme un acide ou une base
    • Exemples de catalyse acide/base
      • ARNase A
        • Une hydrolase qui hydrolyse les liaisons phosphodiester dans l'ARN
        • Les sites actifs ont deux histidines
        • Implique un intermédiaire nucléotidique cyclique 2' 3'
        • Feuille de bêta principalement
        • His 12 agit comme une base générale et His 119 comme un acide général pour favoriser l'attaque nucléophile et le clivage des liaisons.
        • Un mécanisme catalytique impliquant un intermédiaire covalent enzyme-substrat
        • La formation transitoire du complexe augmente les vitesses de réaction
        • L'enzyme attaque nucléophile le substrat (également appelée catalyse nucléophile)
        • Réversible

        Résumé

        Les histones désacétylases (HDAC) régulent les processus cellulaires tels que la différenciation et l'apoptose et sont ciblées par les thérapies anticancéreuses en développement et en clinique. HDAC8 est un HDAC de classe I métal-dépendant et il est proposé d'utiliser une paire catalytique acide-base générale dans le mécanisme de l'hydrolyse des liaisons amides. Ici, nous rapportons la mutagenèse dirigée et des mesures enzymologiques pour élucider le mécanisme catalytique de HDAC8. Plus précisément, nous nous concentrons sur la fonction catalytique de Y306 et les dyades histidine-aspartate H142-D176 et H143-D183. De plus, nous rapportons les structures cristallines aux rayons X de quatre mutants HDAC8 représentatifs : D176N, D176N/Y306F, D176A/Y306F et H142A/Y306F. Ces structures fournissent un cadre utile pour comprendre les mesures enzymologiques. La dépendance au pH de kchat/KM pour le type sauvage Co(II)-HDAC8 est en forme de cloche avec deux pKune valeurs de 7,4 et 10,0. Le p supérieurKune reflète l'ionisation de la molécule d'eau liée au métal et passe à 9,1 dans Zn(II)-HDAC8. Le mutant H142A a une activité 230 fois inférieure à celle de HDAC8 de type sauvage, mais le pKa1 la valeur n'est pas modifiée. Y306F HDAC8 est 150 fois moins actif que les structures cristallines enzymatiques de type sauvage montrent que Y306 se lie à l'hydrogène du substrat carbonyle, prêt pour la stabilisation de l'état de transition. Les mutants H143A et H142A/H143A présentent une activité >80000 fois inférieure à celle de HDAC8 de type sauvage. Les mutants enterrés D176N et D176A ont des effets catalytiques significatifs, avec des effets plus subtils causés par D183N et D183A. Ces études enzymologiques et structurelles suggèrent fortement que H143 fonctionne comme un seul catalyseur général base-acide général, tandis que H142 reste chargé positivement et sert de catalyseur électrostatique pour la stabilisation de l'état de transition.


        Valeur de la catalyse acide-base générale en ribonucléase A

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        CONCLUSIONS

        Les résultats de cette étude fournissent des preuves biochimiques convaincantes que HDAC8 utilise un mécanisme catalytique dans lequel H143 est un seul catalyseur acide général basique, tandis que H142 est un catalyseur électrostatique qui peut également aider à positionner correctement H143 par le biais d'interactions stériques. Un mécanisme HDAC8 révisé basé sur ces résultats est présenté à la figure 8 . Ce mécanisme diffère de celui proposé à l'origine sur la base de la structure cristalline de la protéine de type histone désacétylase de Aquifex aeolicus, dans laquelle H142 sert de catalyseur basique général et H143 sert de catalyseur acide général. 31 Il est important de noter que le mécanisme révisé prédit différents états de protonation de H142 et H143 dans l'enzyme native que ceux proposés à l'origine, qui peuvent être ciblés par des inhibiteurs efficaces de HDAC. Le mécanisme révisé est cohérent avec les résultats des études QM/MM rapportés par Zhang et ses collègues suggérant que H143 sert d'acide général basique-général, 60,61 mais il contraste avec les conclusions des études QM/MM rapportées par Wiest et ses collègues suggérant que H142 sert de base générale et H143 sert d'acide général. 62 Des études futures exploreront et clarifieront davantage les détails de la chimie acide-base pour la catalyse et la liaison des inhibiteurs à HDAC8 ainsi qu'à d'autres membres de la famille d'enzymes HDAC.

        Les données rapportées ici soutiennent un nouveau mécanisme dans lequel H143 est à la fois la base générale et le catalyseur acide général, et H142 est protoné et sert de catalyseur électrostatique. L'ion métallique catalytique et Y306 orientent le substrat carbonyle et stabilisent l'intermédiaire tétraédrique et ses états de transition flanquants.


        Catalyse homogène

        Lorsque le catalyseur et les substances réagissantes sont présents ensemble dans un même état de matière, généralement sous forme de gaz ou de liquide, il est d'usage de classer les réactions comme des cas de catalyse homogène. Les oxydes d'azote servent de catalyseurs pour l'oxydation du dioxyde de soufre dans le procédé en chambre de plomb pour produire de l'acide sulfurique, un exemple de catalyse homogène dans laquelle le catalyseur et les réactifs sont des gaz. Des traces de vapeur d'eau catalysent certaines réactions gazeuses, par exemple l'interaction du monoxyde de carbone et de l'oxygène, qui ne se déroule que lentement dans des conditions sèches. L'acide sulfurique utilisé comme catalyseur pour la formation d'éther diéthylique à partir d'alcool éthylique est un exemple de catalyse homogène en phase liquide (lorsque les produits, eau et éther, sont éliminés en continu par distillation) par cette méthode, des quantités considérables d'alcool peuvent être converti en éther avec une seule charge d'acide sulfurique. L'inversion du sucre de canne et l'hydrolyse des esters par des solutions acides sont également des exemples de catalyse homogène en phase liquide.

        L'oxydation des solutions de sulfite de sodium par l'oxygène dissous est fortement accélérée par de minuscules traces d'ions cuivre dans le système liquide homogène. Ce système présente un intérêt particulier car il a été démontré que le processus est une réaction en chaîne. Dans ce cas, plusieurs milliers de molécules de sulfite de sodium peuvent être oxydées en sulfate si le processus d'activation initial est produit par l'absorption d'un nombre limité de quanta (mesures d'énergie discrètes) de lumière. Le meilleur exemple d'une réaction en chaîne initiée par la lumière est la photocombinaison d'hydrogène (H2) et le chlore (Cl2) jusqu'à un million de molécules de chlorure d'hydrogène peuvent être formées par absorption d'un seul quantum de lumière (appelé h). Ici, la séquence de réaction est

        avec les réactions 2 et 3 répétées encore et encore. Il est intéressant de noter que de telles réactions en chaîne peuvent être retardées par la présence de catalyseurs négatifs, plus communément appelés inhibiteurs. Ce sont des matériaux qui ralentissent la réaction globale en raccourcissant les chaînes de réaction, généralement en entrant dans une réaction non en chaîne avec l'un des composants chimiques qui maintiennent la chaîne. Une grande variété de substances, y compris les alcools, les sucres et les phénols, se sont avérées agir comme inhibiteurs de l'oxydation des solutions de sulfite.

        Un traitement généralisé de la catalyse homogène par les acides et les bases a été donné par le physico-chimiste danois J.N. Brønsted au milieu des années 1920 sur la base de son concept d'acides et de bases. Selon Brønsted, un acide est une molécule qui peut fournir un proton, et une base est une molécule qui absorbe un proton. Dans cette hypothèse, la gamme des acides comprend des matériaux aussi variés que l'ion bisulfate, HSO4 − acide acétique, CH3eau COOH, H2O ion hydronium, H3O + et ion ammonium, NH4 + . Les bases correspondantes sont l'ion sulfate, SO4 2− ions acétate, CH3COO - ion hydroxyde, OH - eau, H2O et ammoniac, NH3 (ces substances acceptent les protons pour produire les acides énumérés). Brønsted a étudié un certain nombre de réactions catalysées par un acide et une base, notamment (1) l'hydrolyse catalysée par un acide d'un ester, l'orthoacétate d'éthyle, (2) la catalyse basique de la décomposition du nitramide (H2N–NON2→ H2O + N2O), et (3) la catalyse acido-basique de la conversion (mutarotation) du glucose en une forme étroitement apparentée. Dans chaque cas, il a observé une relation directe entre la vitesse de la réaction catalysée et la concentration de la substance catalysante.

        Basé en partie sur les idées de Brønsted, un schéma général pour un changement de substance UNE à une autre substance B catalysé par un matériau C peut être formulé ainsi :

        La désignation Z se réfère à une étape intermédiaire, qui est formée avec une vitesse indiquée par k1 Z peut disparaître soit pour se réformer UNE + C, avec une vitesse k2, ou il peut se décomposer par le chemin 2, avec une vitesse k3, pour donner le produit B et régénérer le catalyseur C. Si k3 est beaucoup plus grand que k2, l'intermédiaire Z s'use presque aussi vite qu'il se forme. Le produit sera alors formé à une vitesse régie par l'expression k1[UNE][C], dans laquelle les crochets indiquent les concentrations de réactif et de catalyseur. Si k2 est beaucoup plus grand que k3, cependant, le processus de détermination de la vitesse est la décomposition de Z, la vitesse de formation du produit étant représentée par l'expression k3[Z], dans lequel [Z] est la concentration de l'intermédiaire. Des exemples des deux types de changement ont été étudiés.

        Dans certains cas, deux catalyseurs ou plus présents en même temps produisent des effets supérieurs à ceux que l'un ou l'autre produirait seul. Il est alors d'usage de parler d'action promotrice. Ainsi, les ions fer en solution renforcent l'action des ions cuivre en catalysant une réaction entre le peroxyde d'hydrogène et l'iode. On suppose que chaque catalyseur n'active qu'un seul des réactifs.

        Les exemples modernes les plus importants de catalyse homogène se trouvent dans l'industrie pétrochimique.La réaction oxo est l'un de ces processus : du monoxyde de carbone et de l'hydrogène sont ajoutés aux oléfines (hydrocarbures insaturés) à environ 150 °C (300 °F) et 200 atmosphères de pression pour former des aldéhydes et des alcools, des composés organiques contenant de l'oxygène. Un catalyseur cobalt carbonyle Co2(CO)8 est utilisé ce catalyseur soluble dans les hydrocarbures est censé activer l'hydrogène par formation de HCo(CO)4, qui réagit alors avec l'oléfine. Cette réaction a conduit à un certain nombre d'études de chimie organométallique. Les cations cuivre, argent et mercure (ions chargés positivement) et les anions permanganate (ions négatifs) sont également connus pour agir comme des catalyseurs homogènes pour l'activation de l'hydrogène. Le chlorure de palladium est utilisé industriellement dans l'oxydation catalytique de l'éthylène en acétaldéhyde en présence de chlorure cuivrique. Le palladium est présumé être converti à plusieurs reprises du sel en métal libre, la fonction du chlorure cuivrique étant de participer à la reformation du sel de palladium à partir du métal.

        Les acides phosphorique, sulfurique, sulfonique et bromhydrique sont des agents importants dans les procédés industriels d'isomérisation, de polymérisation, d'hydratation et de déshydratation, ainsi que dans les réactions classiques d'estérification. Les radicaux libres (fragments moléculaires portant des électrons non appariés) générés par la décomposition de peroxydes ou d'alkyles métalliques initient également des processus catalytiques homogènes.


        Catalyseurs biologiques : les enzymes

        Les enzymes sont des substances présentes dans les systèmes biologiques qui sont des catalyseurs pour des processus biochimiques spécifiques. Bien que des découvertes antérieures d'enzymes aient été faites, une confirmation significative de leur importance dans les systèmes vivants a été trouvée en 1897 par le chimiste allemand Eduard Buchner, qui a montré que la liqueur acellulaire filtrée des cellules de levure broyées pouvait entraîner la conversion du sucre en gaz carbonique. Depuis lors, plus de 1 000 enzymes ont été reconnues, chacune spécifique à une réaction chimique particulière se produisant dans les systèmes vivants. Plus de 100 d'entre eux ont été isolés sous une forme relativement pure, y compris un certain nombre d'enzymes cristallisées. Les premières enzymes à cristalliser ont été l'uréase, isolée de la fève jack et cristallisée en 1926 par James Batcheller Sumner, et la pepsine, cristallisée en 1930 par John Howard Northrop, tous deux lauréats du prix Nobel de chimie pour leurs travaux. Ces matériaux purifiés se sont avérés être des protéines-composés en chaîne d'environ 20 acides aminés naturels RCH(NH2)COOH, allant de la plus simple, la glycine, dans laquelle R est l'hydrogène, au tryptophane, dans lequel R est

        Non seulement des méthodes ont été élaborées pour déterminer les acides aminés trouvés dans une enzyme, mais aussi la séquence d'acides aminés dans une enzyme peut être élucidée par une méthode développée par le biochimiste anglais Frederick Sanger pour déterminer la structure de l'hormone protéique insuline. La première enzyme à avoir sa séquence complète d'acides aminés déterminée de cette manière était la ribonucléase pancréatique bovine, qui a 124 acides aminés dans sa chaîne et un poids moléculaire d'environ 14 000 l'enzyme catalyse la dégradation de l'acide ribonucléique, une substance active dans la synthèse des protéines dans cellules vivantes. En janvier 1969, la synthèse de cette même enzyme a été signalée par deux laboratoires différents. L'activité d'une enzyme dépend d'une structure tridimensionnelle ou tertiaire, mais celle-ci, à son tour, semble dépendre uniquement de la séquence linéaire des acides aminés. Le succès de la synthèse d'une enzyme peut être vérifié sans équivoque par le test de son activité enzymatique.

        Les enzymes sont extrêmement réactives, comme le montre une réaction très simple - la séparation du peroxyde d'hydrogène pour former de l'eau et de l'oxygène - provoquée par les métaux colloïdaux et par l'enzyme catalase. On a constaté qu'une molécule de ce dernier provoquerait la décomposition de plusieurs millions de molécules de peroxyde par minute, vitesse comparable à celle obtenue avec les meilleures préparations colloïdales. Cette vitesse de décomposition de la catalase est probablement un maximum pour les enzymes. Les enzymes à action plus lente réagissent normalement à des vitesses de centaines de réactions par minute. La vitesse de réaction est souvent exprimée par une équation développée par L. Michaelis et M.L. Menten de la forme

        dans lequel V et K sont des constantes pour le processus enzymatique particulier, K étant appelé la constante de Michaelis et [S] désigné comme la concentration du réactif subissant un changement. A de faibles concentrations de S le taux est V[S]/K ou proportionnel à la concentration du substrat [S], alors qu'à des concentrations élevées de substrat, le [S] les termes s'annulent et la réaction est essentiellement indépendante de la concentration du substrat.

        Une deuxième caractéristique des enzymes est leur extrême spécificité. Il a été suggéré que chaque processus biochimique a sa propre enzyme spécifique. Les processus biochimiques induits par les enzymes entrent dans de larges classifications, telles que l'hydrolyse, la décomposition (ou "séparation"), la synthèse et l'hydrogénation-déshydrogénation, car avec les catalyseurs en général, les enzymes sont actives à la fois pour les réactions directes et inverses.

        Comme les catalyseurs de laboratoire, les enzymes ont fréquemment des activateurs - des coenzymes, qui peuvent être des groupes prosthétiques (fermement liés à l'enzyme elle-même) et des ions inorganiques. L'adénosine triphosphate (ATP) est une coenzyme importante participant aux processus de production d'énergie et au passage à travers les membranes cellulaires. Les coenzymes contiennent souvent des vitamines dans le cadre de leur structure. Les ions calcium et magnésium sont d'importants activateurs d'enzymes. Il existe également de nombreuses substances qui inhibent ou empoisonnent les enzymes. L'ion cyanure est un puissant inhibiteur dans de nombreux processus enzymatiques, tout comme les gaz neurotoxiques et les insecticides.


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        4.4 Quelques propriétés du groupe phosphate (concepts généraux)

        Pour une meilleure compréhension des propriétés des nucléotides qui découlent de la présence d'un groupe phosphate dans leurs molécules, nous devons tout d'abord passer en revue les concepts actuellement adoptés concernant la structure du groupe phosphate et également discuter, en utilisant des analogues simples de nucléotides tels que les phosphates d'alkyle et les composés similaires à titre d'exemples, le mécanisme de substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore en tant que réaction la plus typique des phosphates. Cela permettra non seulement d'éclairer certaines régularités dans les propriétés des nucléotides, mais aussi d'en savoir plus sur les propriétés particulières conférées au groupement phosphate par le nucléoside. Dans cette section, la structure et les propriétés du groupe phosphate sont, chaque fois que nécessaire, comparées à celles de son analogue formel - le groupe carboxyle, ce qui nous permet de souligner le comportement particulier des dérivés organiques de l'acide phosphorique.

        De plus, les phosphates d'alkyle sont utilisés comme exemples pour illustrer les transformations d'une importance cruciale dans la chimie des nucléotides et des acides nucléiques, à savoir l'hydrolyse et les réactions impliquant les groupements voisins.

        4.4.1 Structure du groupe phosphate et mécanisme de Substitution nucléophile à l'atome de phosphore

        Comme on le sait, la configuration électronique du phosphore est de 1s2 2s2 2p6 3s2 3p3 . Sa valence est déterminée par la structure de l'enveloppe la plus externe qui, de façon caractéristique, comprend non seulement 3s et 3p mais aussi 3 orbitales (Fig. 4-2).

        L'acide phosphorique et ses esters appartiennent à des composés avec un atome de phosphore à quatre coordonnées. De telles molécules sont tétraédriques. Les quatre liaisons s avec sp 3 hybridation des orbitales électroniques sont dirigées vers les sommets du tétraèdre :

        Ainsi, la structure du groupe phosphate diffère largement de celle du groupe carboxyle dans les acides carboxyliques. Il est bien connu que ce dernier groupe a une structure bidimensionnelle : la formation des trois liaisons s qu'il contient implique la sp2 orbitales hybrides de l'atome de carbone (elles se trouvent dans le même plan et forment des angles de 120 0), tandis que la quatrième, la liaison p résulte du chevauchement des orbitales p des atomes de carbone et d'oxygène à angle droit par rapport à ce plan. La liaison p est polarisée en raison de l'électronégativité prononcée de l'atome d'oxygène, par rapport au carbone, le degré de polarisation étant dépendant de l'effet inductif et de la mésomérie des substituants au niveau du carbone carbonyle.

        À l'heure actuelle, il n'y a pas de consensus sur la nature de la liaison dans les composés avec un atome de phosphore tétraédrique. Néanmoins, toutes les hypothèses à cet effet sont basées sur les concepts généraux concernant la structure et les propriétés de p et orbitales. Il a été supposé que la liaison p dans le groupe phosphoryle (P = O) peut impliquer 3 vacants orbitale. Comme il existe cinq de ces orbitales (voir Fig. 4-2) et que chacune d'elles peut, en principe, recevoir le cinquième électron, l'atome de phosphore peut interagir avec celui de l'oxygène de plusieurs manières pour former une liaison p dans le groupe phosphoryle. En raison du chevauchement partiel des 3 et p orbitales des quatre atomes d'oxygène dans le groupe phosphate, la double liaison n'est pas localisée dans le groupe phosphoryle mais est distribuée, quoique de manière inégale, parmi tous les atomes d'oxygène du groupe phosphate. Par exemple, la connaissance des longueurs des liaisons PO (données structurelles aux rayons X) dans le dibenzyl phosphate, (C6H5CH2O)2P(O)OH, a conduit à la conclusion que chacune des liaisons PO simples représente 10% de la double liaison et la liaison P=O dans le groupe phosphoryle représente 70 %. En outre, la différence entre les doubles liaisons dans les groupes C = O et P = O réside dans le fait que cette dernière liaison est beaucoup plus polarisée (l'atome de phosphore perd facilement des électrons des orbitales d et est probablement pour cette raison moins électronégatif que le carbone). De telles caractéristiques structurelles du groupe phosphate se manifestent par la plus grande nucléophilie de l'oxygène phosphoryle et l'électrophilie de l'atome de phosphore. Le transfert des effets électroniques des substituants, en particulier l'effet de conjugaison avec participation du groupe phosphoryle, dans les esters phosphates et leurs dérivés est beaucoup moins prononcé que dans les dérivés d'acide carboxylique car les substituants ne se situent pas dans le même plan.

        En même temps, les groupes phosphate et carboxyle partagent une caractéristique commune à savoir que leur atome central porte une charge positive partielle et est donc susceptible d'être attaqué par des agents nucléophiles. Lorsque l'atome de phosphore subit une telle attaque, une substitution nucléophile de l'un des ligands (comme sont généralement appelés les substituants de l'atome de phosphore) peut avoir lieu dans les dérivés de l'acide phosphorique.

        Ce processus peut reposer sur l'un des deux mécanismes : associatif (A) et dissociatif (B). Dans le premier cas, le substrat est coordonné avec le nucléophile à l'étape déterminant la vitesse de réaction. L'association résultante est plutôt stable et peut être considérée comme un composé intermédiaire. Ce processus est généralement représenté par le symbole SN2. Le mécanisme dissociatif est caractérisé par le fait que l'étape de détermination du taux de substitution implique

        départ de l'un des substituants et formation d'un composé phosphoré actif avec un plus petit nombre de substituants au niveau de l'atome central. Ce type de transformation est représenté par le symbole SN1. Dans certains cas, cependant, l'événement de substitution est un processus biomoléculaire synchrone et aucun composé intermédiaire n'est formé, contrairement à la substitution SN2 au niveau de l'atome de carbone. Le mécanisme de telles réactions est appelé intermédiaire et noté Iune( SNi ) ("quota" indique que le processus de substitution est toujours par essence associatif). Les deux premiers mécanismes sont discutés dans ce qui suit ici dans cette section mécanisme Iune est traité dans la section traitant des propriétés des amides d'acide phosphorique dont les transformations ont conduit à sa découverte en premier lieu.

        Mécanisme SN2 de substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore tétraédrique a été corroborée par de nombreuses expériences cinétiques d'hydrolyse et d'alcoolyse des phosphates halogénés. Il a été supposé que, formellement, la réaction se déroule à peu près de la même manière que la substitution nucléophile au niveau du carbone saturé : le nucléophile Nu attaque le site de réaction « derrière », par rapport au groupe partant X.

        Après départ du substituant X, la configuration est retournée. Une inversion de Walden au cours de la substitution nucléophile à l'atome de phosphore tétraédrique a été démontrée dans de nombreuses expériences visant à élucider la réactivité de composés contenant du phosphore optiquement actifs.

        On pense que la structure la plus probable du composé intermédiaire est une bipyramide trigonale dans laquelle les groupes entrants et sortants (substitués) (Nu et X, respectivement, sur la figure 4-3A) occupent une position axiale.

        Géométriquement, cette structure rappelle l'état de transition survenant lors d'une réaction S,2 au niveau de l'atome de carbone saturé (Fig. 4-3B). Dans ce dernier cas, cependant, les cinq liaisons diffèrent nettement en force : les trois liaisons à la base de la bipyramide sont assez fortes, tandis que les deux autres (C-X et C-Nu) sont proches des liaisons ioniques. Dans le même temps, en raison de la capacité de l'atome de phosphore à accepter des électrons au 3 orbitales (voir Fig. 4-2), il peut former des composés avec cinq liaisons covalentes de force comparable, sinon identique. Dans les composés intermédiaires de type A, par exemple (voir Fig. 4-3), les trois liaisons à la base bipyramide (liaisons équatoriales), formées avec la participation de sp2-les orbitales hybrides, sont plus fortes. Les deux autres liaisons (axiales) impliquant pd-les orbitales hybrides sont plus faibles.

        Par conséquent, nous avons affaire ici à une propriété unique importante de l'atome de phosphore, à savoir sa capacité à former des liaisons supplémentaires impliquant son vide 3d orbitales. Dans ce cas, la règle de l'octet n'est généralement pas respectée et l'atome de phosphore dans des structures similaires peut être entouré d'une couche de dix électrons.

        Le mécanisme de substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore, décrit dans le contexte du groupement phosphate, diffère sensiblement de celui de la substitution nucléophile au niveau du carbone carbonyle dans les dérivés d'acide carboxylique, où la formation de la structure intermédiaire est assurée par rupture du double C= lien.

        L'attaque nucléophile du carbone dans le groupe carbonyle se déroule à angle droit par rapport au plan logeant la molécule RCOX. La structure émergeant après la rupture de la liaison C=0 est caractérisée par sp 3 hybridation des orbitales électroniques dans l'atome de carbone (les quatre liaisons s étant dirigées vers les sommets du tétraèdre).

        Le taux de substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore tétraédrique est déterminé par les trois facteurs principaux suivants : (1) les espèces substituantes, (2) les espèces du groupe partant et (3) les espèces de l'agent nucléophile.

        Substituts. La facilité de substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore tétraédrique peut dépendre à la fois des propriétés donneur-accepteur des substituants et de leur structure tridimensionnelle.

        On devrait commencer la discussion sur l'effet exercé par les groupes alcoxy dans les phosphates en les comparant à des dérivés analogues d'acides carboxyliques. C'est un fait bien connu que les groupes alcoxy peuvent produire des effets mésomères inductifs et positifs négatifs sur les atomes ou groupes d'atomes associés. Dans les cas où la conjugaison est possible, l'effet mésomère positif est beaucoup plus prononcé que l'effet inductif négatif.

        Il a déjà été mentionné ci-dessus que les composés carbonylés ont une structure bidimensionnelle. C'est pourquoi les électrons à paire unique de certains atomes adjacents au groupe carbonyle interagissent assez fortement avec lui (sont en conjugaison):

        Une conjugaison similaire dans les phosphates de configuration tétraédrique n'est pas aussi manifeste (pour les caractéristiques structurelles du groupe phosphoryle, voir ci-dessus). Néanmoins, ils peuvent également afficher une conjugaison des atomes d'oxygène et de phosphore en raison du vide 3 orbitales de ce dernier (soi-disant) p p -d p conjugaison). Les électrons à paire unique de l'oxygène dans le groupe alcoxy peuvent être transférés au 3 orbitales de l'atome de phosphore, ce qui, à son tour, doit engendrer d'autres obstacles à l'interaction entre le phosphore et le nucléophile. La présence et le degré d'une telle conjugaison sont confirmés par les résultats d'hydrolyse des chlorures carboxyliques et phosphoriques :

        Dans un composé carbonylé, le substituant présentant des propriétés de donneur p ralentit drastiquement l'attaque nucléophile. Par exemple, le chlorocarbonate d'éthyle (1) est hydrolysé à une vitesse 10 4 fois plus lente que le chlorure d'acétyle (2). L'effet d'un tel substituant est également observé dans un composé phosphorylé, mais à un degré bien moindre. L'hydrolyse du dérivé méthoxyphosphorylé (3), par exemple, n'est que 15 fois plus lente que celle de son analogue alkyle (4).

        Le fait que la pp -dp , la conjugaison des substituants avec l'atome de phosphore affecte l'activité de ce dernier dans les réactions de substitution nucléophile est confirmé par des exemples bien connus de réactivité décroissante car les radicaux alkyle dans les composés de structure similaire sont substitués par des groupes alcoxy ou amide . Il a été constaté que la réactivité au cours de l'hydrolyse alcaline diminue sensiblement dans l'ordre suivant : (C2H5)2POCl > CH3O(C2H5)POCI > (CH3O)2POCI. Les encombrements stériques apparaissant lors de l'hydrolyse de ces composés sont sensiblement les mêmes. Tout comme dans le cas précédent, les changements de réactivité sont attribués au fait que les électrons à paire unique de l'oxygène dans le groupe alcoxy sont déplacés vers le 3d orbitales de l'atome de phosphore. Depuis le 3d les orbitales de l'atome de phosphore sont assez complètement occupées à la suite d'une telle conjugaison qui conduit également à une diminution de sa charge positive excédentaire, l'incorporation des électrons à paire unique de l'agent nucléophile dans le 3d orbitales de l'atome de phosphore est entravée de manière significative dans l'état de transition avec une baisse associée du taux de substitution nucléophile.

        Un effet inhibiteur encore plus prononcé sur la substitution nuéléophile au niveau de l'atome de phosphore est exercé par un groupe alkylamide (ou dialkylamide). Par exemple, l'hydrolyse alcaline du diamide [(CH3)2N]2P(O)F se déroule à un rythme plus lent d'un facteur de plusieurs dizaines de milliers que dans le cas du dérivé méthylméthoxy CH3O(CH3)P(O)F. Cette influence du groupe amino dans les phosphamides est attribuée au fait qu'en raison de son effet mésomère positif plus prononcé et inductif négatif moins prononcé, par rapport au groupe alcoxy, il affaiblit les propriétés électrophiles de l'atome de phosphore associé à un beaucoup plus degré plus élevé (en raison de la p p -d p conjugaison).

        Dans les phosphates halogénés (RO)2P(O)X, les halogènes (X = F et Cl) peuvent également être en p p -d p conjugaison avec l'atome de phosphore. Les preuves expérimentales attestent d'une moindre implication de l'atome de chlore dans une telle conjugaison, par rapport au fluor, malgré la plus grande électronégativité de ce dernier (les chlorures d'acide sont beaucoup plus réactifs que les fluorures d'acide).Ainsi, le degré de conjugaison semble dépendre non seulement de l'électronégativité, mais aussi de la structure de l'enveloppe la plus externe de l'atome associé au phosphore.

        Une relation similaire a également été observée dans le cas des phosphates et thiophosphates trisubstitués, (RO)2P(O)OR' et (RO)2P(O)SR', différant par la structure d'un substituant. Les thiophosphates de dialkyle sont des dizaines de milliers de fois plus réactifs que les phosphates de trialkyle.

        Le cours exact suivi par la substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore tétraédrique est fortement affecté non seulement par la capacité des substituants pour la conjugaison, mais aussi par leur taille. Dans ce cas, les encombrements stériques sont plus influents que dans la série de composés carboxyliques à structure plane au niveau du groupe carboxyle. Dans les esters de type (CH3O)2P(O)X, le remplacement du groupe méthyle par un tert-butyle conduit à une baisse assez brutale de la vitesse d'hydrolyse alcaline.

        Quitter le groupe. Ce facteur est aussi important dans les réactions de substitution nucléophile que l'électrophilie de l'atome de phosphore. L'effet du groupe partant est assez simple. Plus la facilité avec laquelle sa liaison avec le site de réaction est rompue est grande, plus la substance est réactive. Étant donné que le groupe partant part en emportant sa paire d'électrons, tous les facteurs propices à sa plus grande électronégativité facilitent généralement le déroulement de la réaction. Dans les composés de type (RO)2P(O)X, X est toujours le groupe partant s'il est associé à l'atome de phosphore par une liaison "plus faible" que celle liant le groupe alcoxy à ce dernier. Nous avons déjà vu des exemples dans lesquels le groupe X était représenté par un atome de chlore, RS et d'autres groupes. Si la fonction du groupe partant est assurée par un anion d'acide phosphorique, lorsque la substitution nuéléophile a lieu dans les pyrophosphates, par exemple, l'attaque se termine par la libération d'un anion plus stable, c'est-à-dire l'anion d'un acide plus fort. Par exemple, le pyrophosphate de dibenzyldiphényle asymétrique réagit avec les alcools pour donner exclusivement des phosphates de dibenzyle (l'acide diphénylphosphorique est plus fort que le dibenzylphosphorique).

        Agent nucléophile. Au cours de la substitution nucléophile. le nucléophile déplace le groupe en cours de substitution de la molécule du substrat (dans notre cas, le phosphate). Comme on l'a déjà souligné, la facilité avec laquelle la substance nucléophile est attachée à l'atome de phosphore agissant comme site de réaction dépend d'un certain nombre de facteurs. L'un d'eux est nucléophilie ou, en d'autres termes, capacité d'un réactif à céder sa paire d'électrons pour se combiner avec le site de réaction. La nucléophilie est déterminée par la mobilité des électrons dans la particule nucléophile, sa polarisabilité et les facteurs stériques. Les agents nucléophiles réagissant facilement avec l'atome de phosphore tétraédrique peuvent être disposés comme suit [par rapport aux chlorophosphinates de type R2P(O)CI] : HO- > C6H5O- > C2H5OH > C2H5S-, CH3COO-. L'hydroxylamine et les acides hydroxamiques présentent une nucléophilie beaucoup plus prononcée. L'activité accrue de ces composés provient du fait que l'atome impliqué dans l'attaque nucléophile se trouve à côté d'un autre ayant des électrons à paire unique ("effet a"). Ceci semble assurer une plus grande polarisabilité de l'agent nucléophile. Naturellement, en fonction du degré de 3d orbitales de l'atome de phosphore sont occupées en raison de p p - p , conjugaison avec les substituants. la basicité et la polarisabilité des nucléophiles peuvent influencer différemment la vitesse de réaction. Il a été démontré que plus la conjugaison de substituants, par exemple, des groupes alcoxy et dialkylamide avec 3d orbitales, moins l'effet de la basicité du nucléophile sur la vitesse de réaction est important et plus l'importance de la polarisabilité est grande.

        Il a déjà été mentionné que lors de la substitution basée sur le SN2 mécanisme dans l'état de transition, les liaisons de l'atome de carbone saturé (voir Fig. 4-3B) diffèrent largement en force, et l'état de transition n'est pas susceptible d'exister pendant plus ou moins longtemps. Dans le même temps, l'état correspondant de l'atome de phosphore dans les phosphates (voir Fig. 4-3A) est caractérisé par une différence beaucoup plus petite de force de liaison et est comparativement plus stable. Ce sont ces spécificités qui rendent possible la restructuration de l'état de transition (type A sur la figure 4-3), ce qui peut finalement affecter le résultat final de la substitution. Une telle restructuration ne s'accompagne pas d'un clivage des liaisons phosphore-substituant et se résume à des changements dans les angles et les longueurs des liaisons dans un état transitoire suffisamment persistant, comme représenté par la bipyramide trigonale. Ce type de restructuration est schématisé ci-dessous.

        Supposons que les substituants E1, E2 et E3 dans la bipyramide trigonale de départ occupent des positions équatoriales, les substituants Al et A2 étant axiaux.

        A un certain moment, les substituants A1 et A2 commencent à se rapprocher dans le plan de la page. Simultanément, les substituants E2 et E3 se déplacent dans un plan perpendiculaire à celui de la page de sorte que E3 se déplace vers le haut à partir de la page, tandis que E2 se déplace en sens inverse. En conséquence, un état (6) apparaît dans lequel les substituants A1, A2 et E3 forment la base d'une bipyramide tétragonale avec le sommet E1. Les changements d'angles ultérieurs, procédant dans les mêmes directions, conduisent à un état (7) où les substituants E3 et E2 se trouvent sur la même ligne droite, tandis que El, A1 et A2 sont disposés dans le plan de la page sous un angle de 120 0 . Dans la bipyramide trigonale résultante, les positions axiales sont maintenant occupées par les substituants E3 et E2 et les positions équatoriales sont occupées par El, A1 et A2. Une telle restructuration de l'état transitoire, (5) (7), qui, bien sûr, est réversible, est appelée pseudorotation. La ligne reliant l'atome central au substituant El est appelée axe de rotation. Le phénomène de pseudorotation est observé dans de tels composés où les énergies des liaisons phosphore-substituant sont raisonnablement proches. Dans l'état (6), les longueurs de liaison sont pratiquement égalisées (réhybridation des trois sp2 équatoriale et deux pd orbitales axiales, conduisant à cinq sp3 orbitales hybrides), et la fonction de l'axe de rotation peut être réalisée par pratiquement n'importe quelle liaison phosphore-substituant, à condition qu'elle ne diffère pas sensiblement des autres. Quelques exemples de pseudorotation sont examinés ci-dessous dans la section 4.4.4 traitant des phosphates cycliques.

        Mécanisme SN1. On pense que certaines réactions de substitution nucléophile à un atome de phosphore tétraédrique impliquent un mécanisme différent de SN2 décrit ci-dessus. La réaction se déroule apparemment en deux étapes, dans ce cas : d'abord, l'un des substituants (X) dans le groupe phosphate est éliminé avec formation intermédiaire du métaphosphate correspondant, puis, l'agent nucléophile (Y - ) s'y attache :

        C'est ce qu'on appelle le mécanisme SN1 de substitution du phosphore. Cependant, la preuve existante de ce dernier ne peut pas encore être considérée comme suffisamment convaincante. Suivons maintenant des exemples de réactions supposées être basées sur ce mécanisme.

        Le phosphate de salicyle (8) s'hydrolyse beaucoup plus rapidement que le phosphate de phényle non substitué ou para-carboxyphényl phosphate (la vitesse d'hydrolyse est maximale à pH 5). Il a été supposé plus tôt que la catalyse nucléophile a lieu et que le phosphate de salicyloyle (9) subit une hydrolyse. Comme cela a été établi plus tard. la réaction se déroule différemment : le phosphate de salicyle (8) s'hydrolyse plus rapidement que le phosphate de salicyle (9) et est essentiellement un composé intermédiaire se formant lors de l'hydrolyse de ce dernier :

        La raison d'une vitesse de réaction plus rapide en passant de (9) à (8) semble être la catalyse acide intramoléculaire conduisant à la formation de métaphosphate [PO3 - ]:

        Le 1,8-Dihydroxynaphtalène monophosphate est hydrolysé de manière similaire :

        L'hydrolyse des acyl phosphates et pyrophosphates semble également impliquer le mécanisme SN1 :

        Des preuves plus substantielles en faveur de la SNUn mécanisme de substitution au niveau de l'atome de phosphore a été fourni dans des études sur l'hydrolyse du pyrophosphate de tétraéthyle. La réaction se déroule à une vitesse rapide à des valeurs de pH supérieures à 9 et est catalysée par des ions phosphate. Si le catalyseur est un ion phosphate contenant l'isotope de l'oxygène 18 O , le marqueur est détecté dans la molécule du diéthylphosphate émergent. Ceci indique la formation intermédiaire d'un anion métaphosphate dans cette réaction.

        Cette conclusion est confirmée par la formation de phosphate de méthyle (11) lorsque la réaction est conduite dans du méthanol et également du trimétaphosphate (10) dans une solution aqueuse concentrée.

        4.4.2 Catalyse de la substitution nucléophile au Atome de phosphore

        Catalyse nucléophile (augmentation de la réactivité de l'atome de phosphore). De nombreuses réactions avec la participation de dérivés de phosphate se sont avérées impliquer une catalyse nucléophile par des amines tertiaires. L'alcoolyse du tétrabenzyl pyrophosphate, par exemple, est accélérée par l'imidazole :

        Un effet similaire est produit par la pyridine, cependant, les amines à encombrement stérique, telles que la 2,6-lutidine, ne catalysent pas de telles réactions.

        La catalyse avec un agent nucléophile réside dans le fait que la substitution du groupe partant avec formation d'un composé intermédiaire et le remplacement ultérieur du catalyseur par le nucléophile dont l'entrée est facilitée par lui se déroulent à des vitesses beaucoup plus rapides que dans une réaction non catalysée. Cela a l'explication suivante: l'amine tertiaire est un nucléophile plus fort que l'alcool, et l'intermédiaire de formation avec un groupe ammonium au niveau de l'atome de phosphore est plus réactif que le pyrophosphate car le pp -dp , la conjugaison entre le phosphore et le substituant contenant l'azote d'ammonium est complètement bouleversée et cette dernière exerce un fort effet d'induction négative. Un exemple de composés instables appartenant à cette catégorie est fourni par les dérivés de pyridinium des phosphates d'alkyle :

        Catalyse basique générale. Ce qui distingue ce type de catalyse de la nucléophile, c'est l'effet isotopique du deutérium. On sait que les réactions dont la vitesse est déterminée par le clivage des liaisons formées par les atomes de deutérium se déroulent cinq à huit fois plus lentement que les réactions correspondantes impliquant des atomes de protium (au lieu de deutérium). L'alcoolyse des pyrophosphates en présence de bases est ralentie de ROH à ROD. Cela indique que lors de l'étape précédant l'attaque nucléophile de l'atome de phosphore, l'alcool est activé par la base, l'activation se réduisant à "l'élimination" du proton :

        Comme dans ce cas la base servant de catalyseur ne participe pas à l'attaque nucléophile au niveau de l'atome de phosphore, ses caractéristiques stériques n'affectent pas la vitesse de réaction de manière significative. Par exemple, la phosphorylation d'alcools avec des pyrophosphates (voir ci-dessus) est catalysée par des amines tertiaires, y compris celles à encombrement stérique comme, disons, la 2,6-lutidine.

        Catalyse acide générale. Une bonne illustration de la catalyse acide de la substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore est fournie par les réactions entre le sarin (isopropyl methylphosphonofluoridate) et les phénols. Par exemple, le monoanion pyrocatéchol réagit avec le sarin à une vitesse beaucoup plus rapide que l'ion phénolate.

        Une raison possible est la liaison hydrogène entre le groupe hydroxyle non dissocié du pyrocatéchol et les atomes d'oxygène phosphoryle ou de fluor sarin, perturbant la conjugaison oxygène-phosphore avec pour résultat que l'atome de phosphore est plus facilement attaqué par le nucléophile, ou l'ion phénoxy pour être précis. Une catalyse selon des lignes similaires semble être probable pour les réactions dans lesquelles la fonction du groupe catalytiquement actif est assurée par le groupe ammonium contenant de l'hydrogène.

        La vitesse exceptionnellement élevée d'hydrolyse acide d'un analogue du sarin contenant un groupe amino trialkyle peut être attribuée à la catalyse intramoléculaire.

        La catalyse acide générale peut faire intervenir des groupes carboxyle non dissociés. Phénylphosphonate de diéthyle qui contient un groupe carboxyle dans le ortho position est facilement hydrolysée, lorsqu'elle est chauffée avec de l'eau, en un phosphate libre :

        La stabilité à l'hydrolyse dans les mêmes conditions du sel de sodium (12) et des esters d'alkyle (13) du même acide ainsi que du paraisomère correspondant (14) fournit une preuve supplémentaire pour soutenir la catalyse acide intramoléculaire avec la participation d'un ortho-carboxyle grouper.

        Catalyse électrophile. De nombreux exemples peuvent être utilisés pour illustrer la catalyse de l'hydrolyse du phosphate par des ions métalliques. C'est le cas par exemple de l'alcoolyse du tétrabenzyl pyrophosphate avec un mélange d'alcool propylique et d'amine tertiaire dont le taux augmente sensiblement en présence d'ions lithium ou calcium.

        Cet effet semble également être une conséquence des propriétés électrophiles améliorées de l'atome de phosphore après avoir tiré des électrons de l'oxygène phosphoryle. Par conséquent, le mécanisme de catalyse dans ce cas est proche de celui de l'acide, à la différence que le rôle du proton est joué par l'ion métallique. De même, le fluorophosphate de diisopropyle et les composés apparentés sont rapidement hydrolysés en présence de complexes formés par le cuivre bivalent et l'a,a'-dipyridyle :

        4.4.3 Hydrolyse des phosphates d'alkyle

        Les nucléotides et polynucléotides étant longtemps restés des composés relativement peu connus, la plupart des conclusions tirées sur les mécanismes de leurs transformations associées au groupement phosphate reposaient le plus souvent sur des analogies avec les réactions correspondantes impliquant les phosphates d'alkyle. Au début des années cinquante, par exemple, des preuves ont été apportées, par les mécanismes d'hydrolyse des phosphates de mono- et dialkyle ainsi que des phosphates de polyols simples, pour expliquer la différence de stabilité hydrolytique entre l'ARN et l'ADN. Les mêmes découvertes ont permis de prédire et d'expliquer de nombreuses propriétés des dérivés nucléotidiques à partir de la structure du nucléoside associé et de la position du groupe phosphate dans ce dernier. Les faits accumulés jusqu'à présent ne sont pas encore suffisants pour une analyse détaillée des mécanismes de nombreuses réactions impliquant des nucléotides et leurs dérivés, en particulier des réactions enzymatiques avec participation du groupe phosphate. Il ne fait aucun doute, cependant, qu'une contribution majeure à l'étude de ces processus sera apportée par les réactions soigneusement étudiées impliquant des analogues de nucléotides tels que les phosphates d'alkyle et les phosphates de polyols. En conséquence, cette section traite des réactions impliquant des phosphates de mono-, di- et trialkyle ainsi que celles des polyols. Les réactions discutées ici sont d'une grande importance dans la chimie des nucléotides et de leurs dérivés. Une attention particulière est accordée aux processus avec la participation des groupes voisins, c'est-à-dire accompagnés d'une catalyse intramoléculaire. La plupart des réactions considérées dans cette section sont basées sur le mécanisme de substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore tétraédrique. Cependant, selon la forme exacte sous laquelle le groupement phosphate participe à la réaction (anion, molécule neutre), celle-ci peut également suivre un cours différent. Les concepts généraux concernant de telles réactions sont également discutés.

        Hydrolyse des phosphates de monoalkyle. La vitesse d'hydrolyse de la plupart des phosphates de monoalkyle simples passe par un maximum se situant dans la plage de pH de 3 à 5. Une courbe typique montrant la vitesse d'hydrolyse des phosphates d'alkyle en fonction du pH du milieu est donnée à la figure 4-4.

        Aux valeurs de pH alcalines, le taux d'hydrolyse chute fortement. Aux pH acides, un minimum est observé (à pH 1), puis la vitesse d'hydrolyse augmente à nouveau avec l'acidité du milieu. Étant donné que les valeurs de pKa pour les première et deuxième étapes de dissociation du phosphate de méthyle sont respectivement de 1,54 et 6,31, on peut supposer que la vitesse d'hydrolyse maximale à pH 4 correspond à la concentration de monoanion la plus élevée dans la solution. La diminution de la vitesse d'hydrolyse en milieu alcalin suggère que le dianion n'est pas actif (apparemment parce que la répulsion électrostatique gêne l'attaque du dianion par l'ion hydroxyle). Un acide non dissocié est moins actif que son monoanion. A pH < 1, on peut observer une hydrolyse catalysée par un acide avec formation d'un acide conjugué :

        Le mécanisme d'hydrolyse du monoanion phosphate de méthyle a été au centre de débats prolongés qui ont abouti au rejet de l'hypothèse de la substitution bimoléculaire (SN2). Le taux d'hydrolyse du monoanion phosphate de méthyle est beaucoup plus élevé que celui du monoanion phosphate de diméthyle (voir ci-dessous). Cela a conduit à des spéculations selon lesquelles pour qu'une molécule affiche une sorte de réactivité "spéciale", dans un phosphate substitué, un hydroxyle non dissocié doit coexister avec un atome d'oxygène chargé négativement. Deux mécanismes S,1 très similaires de la catalyse acide intramoléculaire générale avec participation du groupe hydroxyle non dissocié dans le monoanion ont été discutés. Il a été supposé que le proton peut être transféré au groupe partant soit avec l'implication de l'eau, par l'émergence d'un état de transition cyclique à six chaînons, soit sans une telle implication, par migration intramoléculaire :

        Les deux mécanismes incluent la formation d'un métaphosphate hypothétique. Il n'y a pas de preuve directe de la formation de métaphosphate lors de l'hydrolyse des phosphates monoalkyliques à pH

        4, mais l'hypothèse est étayée par des preuves indirectes. La stabilité des dianions monophosphates, si leur hydrolyse est supposée être basée sur un S similaireN1, semble provenir du fait que de nombreux groupes alcoxy sont éliminés mais difficilement et ne peuvent "partir" que s'ils sont protonés à l'avance, comme c'est le cas avec les monoanions. La dissociation en milieu alcalin avec formation d'un anion RO - n'a lieu que dans le cas d'esters contenant de forts groupements accepteurs d'électrons par exemple :

        Malgré les nombreuses difficultés rencontrées dans l'étude de l'hydrolyse de la forme neutre des phosphates de monoalkyle, ROPO3H2, il s'est avéré qu'elle s'accompagnait d'une rupture de la liaison oxygène-carbone dans le radical R. Ainsi, dans ce cas, le monophosphate agit comme agent d'alkylation, tout comme les sulfates d'alkyle. La substitution se déroule comme un SNRéaction de type 2 à l'atome de carbone saturé :

        Concernant tert-butyl phosphate et un -D-glucose 1-phosphate, dont les formes neutres sont hydrolysées à une vitesse 10 5 fois plus rapide que le méthyl phosphate mais aussi avec clivage de la liaison C-O, leur hydrolyse serait basée sur le SN1 mécanisme.

        Le mécanisme d'hydrolyse de tels esters semble être déterminé par la facilité de formation du carbocation intermédiaire.

        L'hydrolyse des monophosphates d'alcools primaires à pH 1 repose sur un mécanisme bimoléculaire. Expériences avec H2 18 0 ont montré que deux processus parallèles se produisent. Le premier processus implique le clivage de la liaison C-0 (73 %), tandis que dans le second processus c'est la liaison P-O qui est rompue (27 %) :

        Les monophosphates formés par les alcools secondaires et tertiaires sont hydrolysés en milieu acide par un mécanisme monomoléculaire avec coupure de la liaison C-O uniquement, par exemple :

        Le tableau 4-2 est un bref résumé de l'effet de la structure moléculaire des phosphates de monoalkyle sur leur comportement pendant l'hydrolyse.

        4-5. Taux d'hydrolyse du diméthylphosphate en fonction du pH du milieu à 100 0 C

        Tableau 4-2.Effet de la structure moléculaire des phosphates monoalkyliques sur leur comportement pendant l'hydrolyse.

        Hydrolyse des phosphates de dialkyle. Les phosphates de dialkyle sont parmi les esters les moins réactifs. La courbe représentant leur constante de vitesse d'hydrolyse en fonction du pH n'a pas de maximum (Fig. 4-5), ce qui indique l'hydrolyse extrêmement lente du dialkyl phosphate monoanion.

        L'hydrolyse du diester sous sa forme neutre se déroule majoritairement (70-80 %) avec clivage de la liaison CO [équation (1)], tandis que le PO n'est rompu que dans 20 à 30 % des cas [équation (2)] .

        Au fur et à mesure que le milieu devient plus acide, la vitesse d'hydrolyse du phosphate de dialkyle augmente avec la concentration en acide. La forme protonée du diester est hydrolysée, principalement, au niveau de la liaison C-O (jusqu'à 90 %), de même que la forme neutre, la liaison P-O étant peu affectée (10 %) :

        Ainsi, la plus grande différence de vitesse d'hydrolyse des di- et monophosphates est observée dans le cas de la forme monoanionique. Les différences dans les taux d'hydrolyse des autres formes ioniques ne sont pas aussi prononcées.

        Hydrolyse des phosphates de trialkyle. Les triphosphates subissent une hydrolyse en milieu acide et alcalin. A pH alcalin, le mécanisme de la réaction est bimoléculaire et comprend une attaque nucléophile de l'atome de phosphore tétraédrique par un ion hydroxyle (expériences avec H2 18 O ont montré que la liaison P-O est généralement rompue dans ce cas) :

        La structure géométrique de l'état de transition est une bipyramide trigonale dans laquelle les groupes entrants et sortants occupent des positions axiales. Ceci est corroboré par le fait que l'hydrolyse alcaline des triphosphates optiquement actifs s'accompagne généralement d'une inversion. La formation de l'état de transition implique la polarisation des liaisons - le nuéléophile (anion) donne des électrons à l'atome de phosphore. Lorsque le substituant part sous forme anionique, le phosphore perd ces électrons et passe à l'état initial. En raison de la grande sensibilité de la conjugaison à l'inversion de charge, elle est plus prononcée dans l'état de transition, par opposition à l'état fondamental. En présence d'un groupe RO avec un effet inductif négatif dans la molécule de triester, deux effets de signe opposé sont observés, à savoir : effet inductif, conduisant au déplacement d'un électron de l'atome de phosphore le long de la liaison PO (dans le groupe POR) , et une augmentation de la conjugaison pp -dp , avec déplacement des électrons à paire unique de l'oxygène dans le groupe RO vers le 3d orbitales de l'atome de phosphore. Au fur et à mesure que la propriété de donneur d'électrons des radicaux (R) dans le triphosphate devient plus prononcée, la mésomérie positive des groupes RO augmente, ce qui conduit à des liaisons P-O plus courtes dans les groupes P-O-R et à un taux beaucoup plus lent d'hydrolyse alcaline.

        Dans les solutions neutres et acides, la vitesse d'hydrolyse des triphosphates dépend faiblement de la concentration en protons, ce qui suggère que la forme non protonée du phosphate est hydrolysée à une vitesse plus rapide. Expériences avec H2 18 0 ont montré que c'est la liaison C-O qui est rompue majoritairement en milieu acide :

        Hydrolyse des phosphates cycliques. Contrairement aux phosphates de dialkyle simples, les diphosphates cycliques à cinq chaînons sont extrêmement réactifs. Le phosphate d'éthylène, par exemple, est hydrolysé avec des cas extrêmes à la fois en milieu acide et alcalin. Dans de telles conditions, la vitesse d'hydrolyse de ce composé est environ 10 7 ou 10 8 fois plus rapide que celle du diméthyl phosphate (voir ci-dessus), et seule la liaison P-O est rompue.

        La réactivité élevée des phosphates cycliques, par rapport aux phosphates non cycliques, peut s'expliquer par la déformation du cycle. La déformation semble se produire uniquement dans les phosphates cycliques à cinq chaînons, étant donné que la réactivité des composés avec un cycle plus grand (six et sept chaînons) est égale à celle du phosphate de diméthyle ou est même inférieure. La nature exacte de la conjugaison dans les phosphates cycliques à cinq chaînons n'est pas encore élucidée, cependant, la plus grande facilité de leur hydrolyse, par rapport aux dérivés acycliques, suggère que la formation de l'état de transition s'accompagne de l'élimination de l'état tendu. Cette hypothèse est étayée par le fait que le traitement du phosphate d'éthylène avec de l'eau marquée au 18 O en milieu acide ainsi que l'incorporation de l'isotope dans le groupement phosphate à la suite de l'hydrolyse conduisent également à un échange d'oxygène sans rupture du cycle, ce dernier réaction se déroulant à la même vitesse que l'hydrolyse (khydraulique/kéchange =5).

        Par conséquent, l'émergence d'un état de transition a été postulée pour les deux réactions, ayant la structure d'une bipyramide trigonale (15) (voir ci-dessous) dans laquelle les liaisons P-O du cycle à cinq chaînons occupent une position axiale et une position équatoriale. Dans cet anneau non plan, l'angle O-P-O est de 90 0 , contre 99 0 dans le phosphate cyclique de départ.

        Les calculs de la déformation angulaire ont montré que le gain en énergie. résultant de l'élimination de l'état de contrainte lors de l'émergence de l'état de transition (15), varie de 12 à 25 kJ/mole (3-6 kcal/mole). Conformément aux règles de substitution nucléophile au niveau de l'atome de phosphore tétraédrique, les groupes entrants et sortants occupent des positions axiales. Par conséquent, l'hydrolyse du phosphate cyclique d'éthylène doit s'accompagner d'un clivage de la liaison P-O en position axiale ainsi que de la formation de phosphate d'hydroxyéthylène contenant un isotope de l'oxygène dans le groupe phosphate :

        D'autre part, l'échange d'oxygène dans le phosphate d'éthylène avec le cycle à cinq chaînons restant intact doit également se produire conformément à la règle générale - c'est-à-dire le départ du groupe substitué (dans ce cas, hydroxyle) de la position axiale. Ainsi, dans l'état de transition de type (15), résultant d'une substitution nucléophile dans la molécule de phosphate d'éthylène, les positions axiales peuvent être occupées non seulement par des groupes -O-CH2- mais aussi par des groupes hydroxyles avec des atomes d'oxygène marqués et non marqués. Cela peut également se produire à la suite d'une restructuration de l'état de transition, connue sous le nom de pseudorotation. Dans le cas considéré, la transformation correspondante peut s'écrire comme suit :

        On voit que l'échange d'oxygène peut se produire sans ouverture de l'anneau. La probabilité d'une autre restructuration possible de la bipyramide trigonale de départ, au cours de laquelle le groupe O-P-O se retrouve en position équatoriale, est faible car dans un tel cas l'angle O-P-O serait égal à 120 0 et cela rendrait le système beaucoup plus tendu.

        Un mécanisme similaire semble également être impliqué dans l'hydrolyse du phosphate cyclique de méthyléthylène qui s'est avéré subir non seulement une rupture du cycle et un échange d'oxygène, mais également une hydrolyse rapide du groupe exocyclique avec le cycle restant intact.

        Réactions accompagnées par la formation de structures cycliques comprenant un groupe phosphate. Il est connu qu'en milieu acide le groupement phosphate des hydroxyaminoacides N-phosphorylés subit une migration N 0. Par exemple:

        Dans ce cas, on pourrait s'attendre à l'émergence d'un état de transition incorporant un cycle à cinq chaînons :

        Cependant, les trois atomes constitutifs du cycle à cinq chaînons résultant doivent se trouver sur la même ligne droite (le groupe partant X et le groupe entrant Y doivent être dans une position axiale ou, en d'autres termes, l'angle XPY doit être de 180 0 ), ce qui est impossible. Étant donné qu'une telle migration provoque le détachement des deux groupes isopropyle, il est plus probable de s'attendre à une séquence d'étapes comprenant l'hydrolyse et la cyclisation avec départ des groupes isopropoxy et ouverture du cycle :

        Une migration similaire du groupe phosphate a été observée lors du traitement alcalin du glycéro-1-méthyl phosphate (16) :

        La formation de quantités égales de glycérol I- et 2-phosphates est due à l'émergence d'un phosphate cyclique à cinq chaînons à la suite de l'attaque nucléophile de l'atome de phosphore par l'hydroxyle adjacent. Comme cela a déjà été mentionné, de tels composés sont très instables et subissent une hydrolyse pratiquement à la même vitesse le long des deux voies possibles (a) et (b).

        Le phosphate de méthyle (b -hydroxyéthyle) est entièrement converti en phosphate d'hydroxyéthyle de la même manière :

        Dans les mêmes conditions, le méthyl( b -méthoxyéthyl) phosphate, qui ne peut pas être transformé en une structure cyclique, n'est pas hydrolysé. Les découvertes ci-dessus suggèrent que l'hydrolyse des diphosphates plutôt stables en milieu alcalin (voir ci-dessus) est sensiblement facilitée dans les cas où des phosphates cycliques peuvent se former en tant que produits intermédiaires d'hydrolyse.

        Le fait que l'hydrolyse alcaline du glycéro-1-méthyl phosphate ne produise pas de glycéro-2-méthyl phosphate, le processus principal étant l'élimination du groupe méthoxy pour donner le phosphate cyclique correspondant, est révélateur d'un mécanisme possible de cette transformation. L'état de transition semble émerger à la suite de l'attaque de l'atome de phosphore par le groupe 2-hydroxyle du glycérol. En plus du groupe entrant, le groupe méthoxy se retrouve également en position axiale. La réaction se termine par le départ de ce dernier groupe.

        Si la structure intermédiaire (17) avait subi une pseudo-rotation [formation de la structure (18)], les produits de la réaction auraient inclus du glycéro-2-méthyl phosphate l'absence de ce dernier indique qu'aucune pseudo-rotation n'a lieu dans ce cas (ce phénomène sera discuté à plus longuement dans ce qui suit).

        Une migration du groupement phosphate peut se produire dans le cas des monophosphates de glycol non alkylés :

        Ce processus n'est possible qu'en milieu acide, ce qui s'accorde bien avec le mécanisme de substitution nucléophile décrit ci-dessus au niveau de l'atome de phosphore tétraédrique (c'est la molécule d'eau qui est le groupe partant en milieu acide).

        Les glycéro-1 et glycéro-2 phosphates ne sont pas capables d'interconversion en milieu alcalin. Par conséquent, aucun phosphate cyclique n'est formé dans ce cas. La raison en est l'absence d'un groupe de départ approprié. Il est très probable que bien qu'une structure cyclique similaire à celle émergeant à l'état de transition soit formée, elle ne soit pas capable de subir des pseudorotations, ce qui exclut également la possibilité d'isomérisation.

        4.4.5 b -Réactions d'élimination

        Les phosphates d'alkyle contenant des substituants électronégatifs tels que C=-N, COOH, COOR et d'autres en position b dans le groupe alkyle subissent facilement une b-élimination du groupe phosphate dans un milieu alcalin. Si le phosphate d'éthyle ne se décompose pratiquement pas lors d'une hydrolyse alcaline douce, le phosphate de b-cyanéthyle et ses esters le font facilement dans les mêmes conditions.

        b - L'élimination du groupe phosphate s'accompagne toujours d'un clivage de la liaison C-O et de la formation du composé insaturé correspondant. Ce dernier subit des transformations ultérieures dans certains cas. Par exemple, lors de la b-élimination du groupe phosphate, le phosphate de sérine est converti en acide pyruvique :


        AP Sample Lab 2 Catalyse 2

        Les enzymes sont des protéines produites par des cellules vivantes. Ce sont des catalyseurs biochimiques, ce qui signifie qu'ils réduisent l'énergie d'activation nécessaire pour qu'une réaction biochimique se produise. En raison de l'activité enzymatique, les cellules peuvent effectuer des activités chimiques complexes à des températures relativement basses. Le substrat est la substance sur laquelle agit une réaction catalysée par une enzyme, et il peut se lier de manière réversible au site actif de l'enzyme. Le site actif est la partie de l'enzyme qui interagit avec le substrat de sorte que tout substrat qui bloque ou modifie la forme du siège actif affecte l'activité de l'enzyme. Le résultat de cette union temporaire est une réduction de la quantité d'énergie nécessaire pour activer la réaction de la molécule de substrat afin que des produits se forment. L'équation suivante démontre ce processus : E + S ES E + P Les enzymes suivent la loi de la réaction de masse. Par conséquent, l'enzyme n'est pas modifiée dans la réaction et peut être recyclée pour décomposer des molécules de substrat supplémentaires.

        Plusieurs facteurs peuvent affecter l'action d'une enzyme : concentration en sel, pH de l'environnement, température, activations et inhibiteurs. Si la concentration en sel est proche de zéro, les chaînes latérales d'acides aminés modifiées des molécules d'enzyme s'attireront les unes les autres. L'enzyme va alors se dénaturer et former un précipité inactif. La dénaturation se produit lorsqu'un excès de chaleur détruit la structure tertiaire des protéines. Cela se produit généralement à 40 à 50 º Celsius. Si la concentration en sel est élevée, l'interaction normale des groupes chargés sera bloquée. Une concentration en sel intermédiaire est normalement l'optimum pour l'activité enzymatique. La concentration en sel du sang et du cytoplasme sont de bons exemples de concentrations intermédiaires. L'échelle de pH est une échelle logarithmique qui mesure l'acidité ou la concentration de H+ dans une solution et va de 0 à 14, 0 étant le plus élevé en acidité et 14 le plus bas. Les chaînes latérales d'acides aminés contiennent des groupes tels que -COOH qui gagnent ou perdent facilement des ions H+. Lorsque le pH est abaissé, une enzyme aura tendance à gagner des ions H+, perturbant la forme de l'enzyme. Si le pH est élevé, l'enzyme perdra des ions H+ et finira par perdre sa forme active. Les réactions fonctionnent généralement de manière optimale dans des environnements neutres. Les réactions chimiques s'accélèrent généralement lorsque la température augmente. De plus en plus de molécules en réaction ont suffisamment d'énergie cinétique pour subir la réaction à mesure que la température augmente. Cependant, si la température dépasse l'optimum de température, la conformation des molécules enzymatiques est perturbée. Un activateur est une coenzyme qui augmente la vitesse de la réaction et peut réguler la vitesse d'action de l'enzyme. Il rend également le site actif un meilleur ajustement pour le substrat. Un inhibiteur a le même pouvoir de régulation activateur mais diminue la vitesse de réaction. Un inhibiteur réduit également le nombre de ponts S-S et réagit avec les chaînes latérales à proximité des sites d'activation, les bloquant.

        L'enzyme utilisée dans ce laboratoire est la catalase. Il possède quatre chaînes polypeptidiques composées chacune de plus de 500 acides aminés. Une fonction de la catalase est d'empêcher l'accumulation de niveaux toxiques de peroxyde d'hydrogène formé comme sous-produit des processus métaboliques. De nombreuses réactions d'oxydation qui se produisent dans les cellules impliquent la catalase. Ce qui suit est la réaction primaire catalysée par la catalase, la décomposition du peroxyde d'hydrogène pour former de l'eau et de l'oxygène :

        2 H2O2 → 2 H2O + O2 (gaz) Sans catalase, cette réaction se produit spontanément mais très lentement. La catalase accélère notablement la réaction.

        La direction d'une réaction catalysée par une enzyme dépend directement de la concentration de l'enzyme, du substrat et du produit. Par exemple, beaucoup de substrat avec un peu de produit fait plus de produit. Un autre exemple est que beaucoup de produit avec un peu d'enzyme forme plus de substrat. On peut en apprendre beaucoup sur les enzymes en étudiant la cinétique de la réaction catalysée par les enzymes. Il est possible de mesurer la quantité de produit formé, ou la quantité de substrat utilisé, à partir du moment où les réactifs sont réunis jusqu'à l'arrêt de la réaction.

        La catalase enzymatique, lorsqu'elle travaille dans des conditions optimales, augmente sensiblement la vitesse de décomposition du peroxyde d'hydrogène.

        Le matériel nécessaire à l'exercice 2A du laboratoire est : 30 mL de H2O2 à 1,5 % (0,44 M), un bécher en verre de 50 mL, 6 mL de solution de catalase fraîchement préparée, une éprouvette, un bain-marie bouillant, 1 cm³ de foie, un couteau pour la macération, des serviettes en papier, des lunettes de sécurité, un tablier de laboratoire, un crayon, une gomme et du papier pour enregistrer les résultats.

        Le matériel nécessaire pour l'exercice 2B est : 10 ml de 1,5 % H2O2, deux béchers en verre propres, 1 ml de H2O, 10 ml de H2SO4, une feuille de papier blanc, une seringue de 5 ml, environ 5 ml de KMnO4, du papier, un crayon , gomme, lunettes de sécurité et tabliers de laboratoire.

        Le matériel nécessaire à l'exercice 2C du laboratoire est : 20 mL de 1,5% H2O2, deux béchers en verre, 1 mL de H2O, 10 mL de H2SO4, une feuille de papier blanc, une seringue de 5 mL, environ 5 mL de KMnO4, du papier , crayon, gomme, lunettes de sécurité et tabliers de laboratoire.

        Pour cette partie de l'expérience, les matériaux nécessaires sont 12 tasses étiquetées 10, 30, 60, 120, 180 et 360 sur deux chacune, six tasses étiquetées acide, 60 ml de 1,5% H2O2, un bécher propre de 50 ml, 6 ml d'extrait de catalase, deux seringues de 5 ml, KMnO4, une minuterie, du papier, un crayon, un marqueur noir, une gomme, des lunettes de sécurité et des tabliers de laboratoire.

        Transférer 10 ml de H2O2 à 1,5 % dans un bécher en verre de 50 ml et ajouter 1 ml de solution de catalase fraîchement préparée. N'oubliez pas de garder la solution de catalase sur de la glace en tout temps. Enregistrez les résultats. Ensuite, transférez 5 ml d'extrait de catalase purifié dans un tube à essai et placez-le dans un bain d'eau bouillante pendant cinq minutes. Transférer 10 ml de 1,5% H2O2 dans un bécher de 50 ml et ajouter 1 ml de la solution de catalase bouillie refroidie. Enregistrez à nouveau les résultats. Pour démontrer la présence de catalase dans les tissus vivants, coupez 1 cm de foie, faites-le macérer et transférez-le dans un bécher en verre de 50 mL contenant 10 mL de 1,5 % H2O2. Enregistrez ces résultats.

        Mettez 10 ml de H2O2 à 1,5% dans un bécher en verre propre. Ajouter 1 ml de H2O. Ajouter 10 ml de H2SO4 (1,0 M) en faisant preuve d'une extrême prudence. Bien mélanger cette solution. Retirer un échantillon de 5 ml et le placer dans un autre bécher. Doser la quantité de H2O2 comme suit. Placer le bécher contenant l'échantillon sur du papier blanc. Utilisez une seringue de 5 ml pour ajouter une goutte à la fois de KMnO4 à la solution jusqu'à l'obtention d'une couleur rose ou brune persistante. N'oubliez pas de remuer doucement la solution après avoir ajouté chaque goutte. Enregistrez tous les résultats. Vérifiez auprès d'un autre groupe avant de procéder pour voir si les résultats sont similaires.

        Pour déterminer le taux de conversion spontanée de H2O2 en H2O et O2 dans une réaction non catalysée, mettez environ 20 ml de H2O2 à 1,5 % dans un bécher. Conservez-le à découvert à température ambiante pendant environ 24 heures. Répétez les étapes de l'exercice 2B, en utilisant le H2O2 non catalysé, pour déterminer la quantité proportionnelle de H2O2 restant après 24 heures. Enregistrez les résultats.

        Si un jour ou plus s'est écoulé depuis que l'exercice B a été effectué, il est nécessaire de rétablir la ligne de base. Répétez le test et enregistrez les résultats. Comparez avec d'autres groupes pour vérifier que les résultats sont similaires. Pour déterminer le déroulement d'une réaction enzymatique, la quantité de substrat qui disparaît au fil du temps doit être mesurée. Tout d'abord, placez les tasses avec les heures et le mot acid up. Ajouter 10 ml de H2SO4 dans chacune des tasses marquées d'acide. Ensuite, mettez 10 ml de H2O2 à 1,5% dans la tasse marquée 10 sec. Ajouter 1 ml d'extrait de catalase à cette tasse. Agiter doucement pendant 10 secondes. (Calculez le temps à l'aide de la minuterie pour plus de précision.) À 10 secondes, ajoutez le contenu de l'une des tasses remplies d'acide. Retirer 5 ml et placer dans la deuxième tasse marquée 10 sec. Dosez l'échantillon de 5 ml en ajoutant du KMnO4 goutte à goutte jusqu'à ce que la solution prenne une couleur rose ou brune. Répétez les étapes ci-dessus, mais laissez les réactions se dérouler pendant 30, 60, 120, 180 et 360 secondes, respectivement. Utilisez les tasses marquées correspondantes des temps. Enregistrez tous les résultats et observations.


        Voir la vidéo: Les Acides Alpha Aminés (Août 2022).