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Citrate de sodium 0,1 M dans 10 % d'éthanol et solubilité de l'ADN

Citrate de sodium 0,1 M dans 10 % d'éthanol et solubilité de l'ADN


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Je comprends comment fonctionne la précipitation de l'ADN en présence de sel (tel que 0,3 M d'acétate de sodium ou 0,2 M de chlorure de sodium) et d'alcool (30 ~ 50 % d'isopropanol ou 60 ~ 75 % d'éthanol)

Cependant, dans le manuel du kit Trizol, l'ADN pouvait être lavé et précipité dans0,1 M de citrate de sodium dans 10 % d'éthanol

Avec seulement 10 % d'éthanol et 0,1 M d'ions sodium, comment l'ADN peut-il être sous une forme « compacte/insoluble » afin qu'il puisse être précipité par une centrifugation à basse vitesse (2000 x g pendant 5 minutes) ?


Les ions sodium se lieront et neutraliseront la charge (-) sur le squelette phospho de l'ADN. Cela réduit les sites de liaison hydrogène pour l'eau, ce qui entraîne alors une moindre solubilité.

Edité pour plus de clarté et parce que je n'ai pas répondu à la question la première fois. Désolé pour ça.

L'extraction de l'ADN se fait à partir de la couche d'interphase, qui est une très petite fraction de l'échantillon d'origine. L'extraction de la couche d'interphase est ensuite mélangée avec 100 % d'EtOH (300 ul pour 1,0 Trizol utilisé dans cet échantillon). Cela devrait en fait être de 60 % ou plus d'EtOH d'après mon expérience avec cette méthode.

C'est l'étape de précipitation.

Le fait que le moût n'ait que 10 % d'EtOH et 0,1 M de citrate de sodium et qu'il soit encore suffisant pour maintenir l'ADN précipité tourne autour de 0,1 M de citrate de sodium qui contient généralement 0,3 M d'ions sodium (le citrate de sodium peut être mono-, di- ou tri-sodique , mais sauf indication contraire… le citrate de sodium implique tri-). Rappelez-vous pour le lavage, vous n'avez pas besoin de faire une précipitation rapide, il vous suffit d'éviter qu'il ne se solubilise à nouveau.

Je supprime mes commentaires qui contenaient les mêmes informations.


La méthode en une seule étape d'isolement de l'ARN par extraction acide de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme : une vingtaine d'années plus tard

Depuis son introduction, la méthode «en une seule étape» est devenue largement utilisée pour isoler l'ARN total à partir d'échantillons biologiques de différentes sources. Le principe à la base de la méthode est que l'ARN est séparé de l'ADN après extraction avec une solution acide contenant du thiocyanate de guanidinium, de l'acétate de sodium, du phénol et du chloroforme, suivie d'une centrifugation. Dans des conditions acides, l'ARN total reste dans la phase aqueuse supérieure, tandis que la plupart de l'ADN et des protéines restent soit dans l'interphase, soit dans la phase organique inférieure. L'ARN total est ensuite récupéré par précipitation à l'isopropanol et peut être utilisé pour plusieurs applications. Le protocole original, permettant l'isolement de l'ARN des cellules et des tissus en moins de 4 heures, a considérablement avancé l'analyse de l'expression des gènes dans les modèles végétaux et animaux ainsi que dans les échantillons pathologiques, comme le démontre le nombre écrasant de citations que l'article a gagnées. 20 ans.


Protocole - Isolement de l'ADN du réactif TRI

L'ADN est précipité à partir de la phase phénolique et de l'interphase des échantillons qui ont été homogénéisés (ou lysés) dans 1 ml de réactif TRI (étape 5 du protocole d'isolement de l'ARN). Après une série de lavages pour éliminer le phénol résiduel, le culot d'ADN est solubilisé dans une solution alcaline douce et le pH est ajusté. Cette technique fonctionne bien avec des échantillons contenant >10 g d'ADN.

  • 100 % éthanol, qualité ACS ou mieux
  • Eau sans nucléase
  • Citrate trisodique
  • NaOH
  • HEPES (acide libre)
  • Tubes à centrifuger sans nucléase de taille appropriée avec des fermetures sécurisées, compatibles avec le phénol/chloroforme et capables de résister à des forces centrifuges de 12 000 x g.
  • Solution de lavage d'ADN: Citrate trisodique 0,1 M dans de l'éthanol à 10 % (aucun ajustement du pH requis), 2 à 3 ml pour 1 ml de TRI Réactif utilisé lors de l'homogénéisation initiale :
  • 75% d'éthanol, 1,5 à 2 ml pour 1 ml de réactif TRI utilisé lors de l'homogénéisation initiale
  • 8 mM de NaOH,300-600 l par 50-70 mg de tissu ou 10 7 cellules
  • 0,1 M ou 1 M HEPES (acide libre), voir tableau 1
  • Sauf indication contraire, effectuez la procédure à température ambiante.
  • Le poids moléculaire de l'ADN récupéré dépend des forces de cisaillement appliquées lors de l'homogénéisation. Si la récupération d'ADN de poids moléculaire élevé est souhaitée, utilisez un homogénéisateur à ajustement lâche dans l'étape d'homogénéisation initiale du protocole d'isolement de l'ARN. Évitez d'utiliser un homogénéisateur Polytron.
  • Si l'ADN est isolé uniquement à des fins quantitatives : a) les échantillons peuvent être homogénéisés plus vigoureusement, y compris l'utilisation d'un Polytron b) la phase phénolique et l'interphase peuvent être conservées à 4°C pendant quelques jours ou à -70°C pendant quelques mois c) l'ADN peut être solubilisé en utilisant NaOH 40 mM au lieu d'une solution 8 mM, et en vortexant le culot d'ADN au lieu de pipeter.

Le matériau de départ de cette procédure contient le réactif TRI, qui contient un poison (phénol) et un irritant (thiocyanate de guanidine). Le contact avec le réactif TRI provoquera des brûlures et peut être fatal. Utilisez des gants et d'autres protections personnelles lorsque vous travaillez avec le réactif TRI.


Neurobiologie des cytokines

Dan Lindholm, . Eero Ċastrén , dans Méthodes en neurosciences , 1993

Solutions

Tampon D (tampon dénaturant) :

Thiocyanate de guanidium (4 M)

Citrate de sodium (25 mM), pH 7

Sarkosyl lauryl sulfate (0,5%)

Mélanger le guanidium, le citrate de sodium et le sarkosyl et conserver dans des tubes Falcon de 50 ml.

Avant utilisation, ajouter 360 l de 2-mercaptoéthanol/50 ml.

Alcool chloroforme-isoamylique, 49:1

ComposantStockerPour 300 lPour 600 l
NaHPO4 (100 mètresM), pH 7100 mètresM30 l60 l
Glyoxal déionisé 70 ul140 l
Diméthylsulfoxyde 200 l400 l
ComposantStockerPour 20 mlPour 40 ml
Formamide déionisé (50%)100%10 ml20 ml
NaHPO4 tampon (50 mM), pH 71 M1 ml2 ml
CSS (3×)20×6 ml12 ml
FDS (0,5%)10%1 ml2 ml
N / A2EDTA (5 mM)0.5 M200 l400 l
ADNsb (250 g/ml)10 mg/ml500 l1 ml
Solution Denhardt's (5×)50×2 ml4 ml

Bioconversion enzymatique de l'hespéridine d'agrumes par Aspergillus sojae naringinase : Solubilité accrue de l'hespérétine-7-O-glucoside avec in vitro inhibition de la maltase intestinale humaine, de la HMG-CoA réductase et de la croissance de Helicobacter pylori

Hespérétine-7-O-glucoside (Hes-7-G) a été produit par la conversion enzymatique de l'hespéridine par Aspergillus sojae naringinase en raison de la suppression du rhamnose terminal. Les extraits de jus et de zeste d'orange contenant l'hespéridine ont été traités de telle manière par cette enzyme que l'hespéridine a également pu être convertie en Hes-7-G. La solubilité de Hes-7-G dans 10 % d'éthanol a été augmentée de 55 et 88 fois par rapport à celles de l'hespéridine et de l'hespérétine, respectivement, ce qui peut rendre Hes-7-G plus biodisponible. Hes-7-G était 1,7 et 2,4 fois meilleur que l'hespéridine et l'hespérétine, respectivement, dans l'inhibition de la maltase intestinale humaine. Hes-7-G était 2 et 4 fois plus puissant que l'hespéridine dans l'inhibition de la HMG-CoA réductase humaine. De plus, Hes-7-G présentait une inhibition plus efficace de la croissance de Helicobacter pylori que l'hespéretine, alors que son efficacité était similaire à celle de l'hespéridine. Par conséquent, les résultats suggèrent que le Hes-7-G bioconverti est plus efficace et biodisponible que l'hespéridine, car il possède des propriétés inhibitrices et de solubilité améliorées.

Points forts

► Hes-7-G pourrait être converti de l'hespéridine par Aspergillus sojae naringinase. ► Hes-7-G était hautement plus soluble que l'hespéridine et l'hespérétine. ► Hes-7-G était plus puissant que l'hespéridine dans l'inhibition de la maltase intestinale. ► Hes-7-G était plus puissant que l'hespéridine dans l'inhibition de la HMG-CoA réductase.


Méthodes

Déclaration d'éthique

Cette étude a été réalisée conformément aux directives approuvées par le Comité sur les soins et l'utilisation des humains par le Conseil d'examen éthique de la NASA et de la JAXA et le Conseil d'examen multilatéral de la recherche humaine (HRMRB). Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit.

Préparation des échantillons de cheveux

Dix astronautes de la Station spatiale internationale (ISS) ont participé à l'étude. Ils étaient à l'ISS pour une mission de 6 mois. Au cours de chaque mission, cinq mèches de cheveux ont été prélevées six fois sur chaque astronaute. Les 6 différents temps d'échantillonnage étaient les suivants (Fig. 1) : premier Preflight (Launch (L)-180

3 mois avant le lancement), deuxième contrôle en amont (L-60

14 : de 2 mois à 2 semaines avant le lancement), premier Inflight (L + 20

37 : de 20 à 37 jours après le lancement), deuxième Inflight (Return (R)-20

7 : du 20 117 à 7 jours avant le retour), premier Postflight (R+2

7 : de 2 à 7 jours après retour), et deuxième Postflight (R+30

90 : de 1 à 3 mois après le retour). Les jours d'échantillonnage différaient pour chaque astronaute en raison d'horaires différents. Dans chaque mission, deux astronautes ont été jumelés et des échantillons de cheveux individuels ont été collectés. Pour chaque échantillon individuel, cinq mèches de cheveux ont été saisies au plus près du cuir chevelu et arrachées à l'aide de pincettes dans le sens de la pousse des cheveux sans endommager les racines des cheveux. Les échantillons Preflight et Postflight ont été conservés à -80 °C jusqu'à l'analyse. Les échantillons en vol ont été stockés dans le congélateur de laboratoire Minus Eighty Degree sur l'ISS (MELFI) dès que possible après la collecte jusqu'à leur retour pour analyse.

Extraction d'ARN

Les racines des cheveux (environ 2 à 3 mm) ont été utilisées comme source d'ARNm extrait. Les racines ont été coupées en environ 15 fragments (0,1-0,2 mm chacun) à l'aide d'un couteau microchirurgical sous un microscope stéréoscopique. Les fragments collectés ont été immergés dans 800 µl de réactif ISOGEN (Nippon Gene Toyama, Japon) dans des tubes et agités (15 sec × 2 fois) à l'aide d'un appareil de sonication Bioruptor UCD-250 (Cosmo Bio Tokyo, Japon). Ensuite, l'ARN a été purifié à partir de lysats capillaires à l'aide d'un kit ISOGEN selon les instructions du fabricant. Brièvement, les tubes ont été maintenus à température ambiante pendant 5 min, suivi de l'ajout de 200 µl de chloroforme. Le processus ultérieur de purification de l'ARN a été effectué conformément aux instructions du fabricant. Après isolement, les culots d'ARN ont été lavés avec de l'éthanol à 70 %, séchés à l'air et remis en suspension dans 10 pi d'eau sans ARN (Gibco-BRL Gaithersburg, MD). L'ARN total a été quantifié à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc. Wilmington, DE). La qualité de l'ARN a été déterminée à l'aide d'un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Palo Alto, CA). Le rapport ARNr 28S:18S et le nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) ont été calculés à l'aide des logiciels 2100 Expert et RIN Beta Version (Agilent Technologies), respectivement.

Amplification d'ARN

Comme l'échantillon d'ARN extrait des échantillons de cheveux était petit, une double étape d'amplification d'ARN a été incorporée avant l'hybridation des puces à ADN. L'ARN total a été amplifié en utilisant un kit Ambion MessageAmp aRNA (Thermo Fisher Scientific Waltham MA, USA). Brièvement, des ADNc de premier et deuxième brins ont été synthétisés. L'ARNa non marqué a été généré par in vitro transcription avec des NTP non biotinylés. Pour la préparation de la sonde, l'ARN a été rétro-transcrit avec des amorces de second tour. L'ADNc du second brin a été synthétisé avec des amorces oligo(dT) T7 et purifié. L'ARNc marqué à la biotine a été généré via in vitro transcription et purifié à l'aide d'un kit RNeasy (Qiagen Venlo, Pays-Bas).

Extraction d'ADN à partir d'échantillons d'ARN de cheveux

Des échantillons d'ADN des racines des cheveux des astronautes ont été extraits à l'aide d'ISOGEN (Nippon Gene Toyama, Japon) du reste des échantillons d'ARN extraits conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, 0,3 ml d'éthanol à 100 % ont été ajoutés à chaque échantillon, suivi d'une incubation de 3 minutes à température ambiante. Après centrifugation à l'aide d'une microcentrifugeuse réfrigérée (Kubota modèle 3500 KUBOTA Tokyo, Japon) à 2000 g et 4°C pendant 5 minutes, le précipité dans les tubes a été lavé avec 1 ml de citrate de sodium 0,1 M dans de l'éthanol à 10 % pendant 30 minutes. Après une nouvelle centrifugation à 2000 g et 4°C pendant 5 minutes, les précipités ont été à nouveau lavés avec 1 ml de citrate de sodium 0,1 M dans de l'éthanol à 10 % pendant 30 minutes supplémentaires. Les culots d'ADN isolés ont été lavés avec 1 ml d'éthanol puis centrifugés à 2000 g et 4°C pendant 5 minutes. Les échantillons d'ADN rincés ont été séchés à l'air et remis en suspension dans 50 ul de solution tampon d'acide tris-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (solution TE). Pour quantifier la quantité d'ADN, les taux d'absorbance à 260 nm ont été mesurés à l'aide d'un spectrophotomètre U-1900 (Hitachi High-Tech Science Tokyo, Japon). Le rapport d'absorbance 260 nm/280 nm des échantillons d'ADN a également été mesuré pour déterminer la qualité de l'ADN.

Mesure des ratios ADNmt/ADNn, ARNm/ARNn et ARNm/ADNmt

Le rapport d'ADN mitochondrial (mt) et nucléaire (n) et le rapport d'ARNm et d'ARNn des racines des cheveux des astronautes ont été analysés via une PCR quantitative basée sur SYBR Green (qPCR). Les échantillons d'ADN et d'ARN décrits ci-dessus ont été utilisés pour la qPCR. Dix nanogrammes d'ADN ont été utilisés pour détecter mt ou ADNn, et 2 ng d'ARN ont été utilisés pour détecter mt ou ARNn. Les réactions qPCR ont été réalisées avec le système de détection de séquence ABI Prism 7000 (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) en utilisant un kit QuantiTect SYBR Green PCR (QIAGEN Valencia, CA, USA) tel que recommandé par le fabricant, à l'exception des modifications suivantes. Pour ND1 et GAPDH amplification, la température de dénaturation était de 95 °C, le temps de dénaturation était de 15 secondes, la température de recuit était de 55 °C, le temps de recuit était de 30 secondes, la température d'allongement était de 72 °C et le temps d'allongement était de 40 secondes.

NADH déshydrogénase sous-unité 1 (ND1) des amorces ont été utilisées pour détecter l'ADNmt ou l'ARNmt, et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) des amorces ont été utilisées pour détecter l'ADNn ou l'ARNn. Ces séquences d'amorces sont les suivantes.

ND1 F : 5′-ACCCCCGATTCCGCTACGACCAAC-3′,

ND1 R : 5′-GGTTTGAGGGGGAATGCTGGAGAT-3′,

GAPDH F : 5′-GGGCAAAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3′,

GAPDH R : 5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′.

Calcul des ratios ADNmt/ADNn, ARNm/ARNn et ARNm/ADNmt

Les rapports ADNmt/ADNn, ARNm/ARNn et ARNm/ADNmt ont été calculés en utilisant les équations ci-dessous. Le cycle de seuil (Ct) est défini comme "le nombre de cycle fractionnaire auquel la fluorescence générée par SYBR Green passe au-dessus d'un seuil fixe".

Rapport ADNmt/ADNn et rapport ARNm/ARNn = 2^(GAPDH Ct- ND1 Ct).

Ratio ARNm/ADNmt = (ARNm/ARNn)/(ADNmt/ADNn).

Mesures des expressions des gènes MnSOD, CuZnSOD, Nrf2, Keap1, GPx4 et Catalase

Les réactions qPCR ont été réalisées avec le système de détection de séquence ABI Prism 7000 (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) en utilisant un kit QuantiTect SYBR Green PCR (QIAGEN Valencia, CA, USA). GAPDH a été utilisé pour le contrôle. Les conditions de PCR étaient les suivantes : Pour MnSOD, Nrf2, Keap1, GPx4 amplification, la température de dénaturation était de 95°C, le temps de dénaturation était de 15 secondes, la température de recuit et d'allongement était de 60°C, le temps de recuit et d'allongement était de 1 minute. Pour CuZnSDO amplification, la température de dénaturation était de 95 °C, le temps de dénaturation était de 30 secondes, la température de recuit était de 55 °C, le temps de recuit était de 30 secondes, la température d'allongement était de 72 °C et le temps d'allongement était de 30 secondes. Pour catalase amplification, la température de dénaturation était de 95 °C, le temps de dénaturation était de 10 secondes, la température de recuit était de 55 °C, le temps de recuit était de 30 secondes, la température d'allongement était de 72 °C et le temps d'allongement était de 40 secondes. GAPDH a été utilisé comme amplification témoin. Ces séquences d'amorces sont les suivantes.

MnSOD F : 5′-TTCTGGACAAACCTCAGCCCTAACGGT-3′

MnSOD R : 5′-AACAGATGCAGCCGTCAGCTTCTCCTTAAA-3′

CuZnSOD F : 5′-CATTGCATCATTGGCCGCACACTG-3′

CuZnSOD R : 5′-ACCACAAGCCAAACGACTTCCAGC-3′

Nrf2 F : 5′-GTGGCTGCTCAGAATTGCAGAAAAAGAAAA-3′

Nrf2 R : 5′-TGTTTTTTCAGTAGGTGAAGGCTTTTGTCA-3′

Keap1 F : 5′-CCATGAAGCACCGGCGAAGTGCC-3′

Keap1 R : 5′-GTCTGTATCTGGGTCGTAACACTCCAC-3′

GPx4F : 5′-GAGCCAGGGGAGTAACGAAGAGATCAAA-3′

GPx4R : 5′-TCACGCAGATCTTGCTGAACATATCGAATT-3′

catalase F : 5′-TGACTACGGGAGCCACATCCAGGC-3′

catalase R : 5′-TCACAGATTTGCCTTCTCCCTTGC-3′

GAPDH F : 5′-GGGCAAAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3′,

GAPDH R : 5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′.

Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du test F de Scheffe. Tous p les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.


Note de l'éditeur : Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Figure supplémentaire 1 Structures à rayons X de TIRR-53BP1 et NUDT16TI-53BP1.

une, Les quatre molécules TIRR et deux 53BP1-Tudor dans l'unité asymétrique sont représentées. b, Les deux molécules NUDT16TI et les deux 53BP1-Tudor dans l'unité asymétrique sont montrées

Figure supplémentaire 2 Conformations de la boucle de liaison TIRR 53BP1 et de la région de boucle correspondante dans NUDT16.

À gauche : alignement de la séquence d'acides aminés de la boucle de liaison TIRR 53BP1 avec la région correspondante de NUDT16. À droite : superposition structurelle des régions de boucle dans TIRR (bleu) et NUDT16 (gris). Sont mis en évidence Pro104 et Arg105 dans NUDT16 et les résidus clés d'interaction avec 53BP1 Pro105 et Arg107 dans TIRR. Les résidus 53BP1 interagissant avec TIRR Pro105 et Arg107 sont également présentés.

Figure supplémentaire 3 Une boucle flexible dans TIRR (résidus 101-107) est hautement spécifique pour l'interaction 53BP1.

Gel teinté à l'argent (une) et immunoblot (b) de protéines partenaires TIRR-FH et TIRR-Loop-FH purifiées à partir de l'extrait nucléaire soluble de cellules U2OS pour une analyse par spectrométrie de masse. TIRR-Loop-FH correspond à TIRR-FH muté pour abriter la région de boucle de NUDT16 (voir Fig. 2 supplémentaire). Les données de spectrométrie de masse sont dans le tableau supplémentaire 1

Figure supplémentaire 4 Recombinaison de commutateur de classe dans les cellules B stimulées.

Montré sont des parcelles de cytométrie en flux représentatives des données présentées dans la figure 5h

Figure supplémentaire 5 Comparaison des structures aux rayons X de TIRR-53BP1 et NUDT16TI-53BP1.

une, Superposition des structures TIRR-53BP1 et NUDT16TI-53BP1 avec TIRR en bleu, NUDT16TI en bleu clair et 53BP1 en orange. Les hélices C-terminales dans l'homodimère TIRR (affichées en gris) n'existent pas dans NUDT16TI. b, Détails des interfaces de liaison TIRR-53BP1 et NUDT16TI-53BP1 illustrant la similitude remarquable entre les deux complexes. Même code couleur que dans une.


Hydrolyse enzymatique et saccharification et fermentation simultanées des intermédiaires de transformation du soja pour la production d'éthanol et la concentration de protéines et de lipides

Les glucides dans le soja sont généralement indésirables en raison de leur faible digestibilité et parce qu'ils « diluent » des composants plus précieux (protéines, lipides). Pour éliminer ces glucides et augmenter le titre de composants plus précieux, la production d'éthanol a été étudiée. Enzymes commerciales (Novozyme cellulase, ??-glucosidase et pectinase) ont été ajoutés au soja broyé (SB), au tourteau de soja (SBM), aux coques de soja (SH) et aux flocons blancs de soja (WF) à un taux de charge de 10 % en solides pour quantifier le glucane hydrolysé. La saccharification a entraîné des réductions de glucanes de 28 %, 45 %, 76 % et 80 % (SBM, SB, SH, WF, resp.). Des essais de saccharification et fermentation simultanées (SSF) ont été menés à 5 %, 10 %, 15 % et 20 % de charge solide avec Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034 et Stipite de Scheffersomyces NRRL Y-7124, avec des protéines, des fibres et des lipides analysés lors d'essais de solides et de saccharification SSF à 10 %. S. cerevisiae et S. stipitis produit

2,5 à 8,6 g/L d'éthanol, respectivement, sur SB, SBM et WF sur tous les taux de charge solide. SH a entraîné des titres d'éthanol plus élevés pour les deux S. cerevisiae (

9–23 g/L) et S. stipitis (

9,5 à 14,5 g/l). Les concentrations de protéines ont diminué de 2,5 à 10 % pour le SB, le SBM et le WF, mais ont augmenté de 53 à 55 % pour le SH. Les concentrations d'huile ont augmenté de

1. Introduction

Le soja est l'une des cultures les plus précieuses au monde en raison de sa teneur élevée en huile et en protéines, ce qui permet une grande variété d'utilisations. L'huile de soja est utilisée comme ingrédient pour l'alimentation humaine et animale ainsi que dans les produits cosmétiques [1–4] et la production de biodiesel [5]. La protéine de soja est hautement digestible et a été utilisée dans l'alimentation du bétail et de l'aquaculture, ainsi que dans de nombreux aliments humains [6-10]. Les suppléments de protéines de soja sont promus dans l'alimentation humaine en raison de leurs nombreux avantages pour la santé [9, 11-15].

Contrairement à l'huile et aux protéines, les glucides présents dans le soja, (

10% poids sec), sont largement indésirables en raison de leur faible digestibilité [16]. Le stachyose et le raffinose, deux des principaux glucides du soja, sont indigestes par les humains et les autres monogastriques, mais peuvent être fermentés par la flore naturelle du tractus intestinal, provoquant une accumulation de gaz inconfortable [17-19]. Le stachyose et le raffinose peuvent également diminuer la digestibilité des aliments qui en contiennent [17]. La présence de ces glucides dilue également efficacement la concentration de protéines et d'huile dans le soja.

Dans de nombreux pays, le soja est « broyé » puis extrait avec de l'hexane ou d'autres solvants pour séparer l'huile de soja des solides (c'est-à-dire le tourteau de soja, SBM). Le SBM a une teneur en protéines d'environ 45 % et est largement utilisé comme aliment pour le bétail. Le soja peut être transformé davantage par extraction à l'éthanol pour éliminer les glucides, ce qui donne un concentré de protéines de soja (SPC) contenant au moins 65% de protéines [18]. C'est un processus coûteux et les sucres retirés ont peu d'utilité, mais le SPC est beaucoup plus digeste et coûte 2 à 2,5 fois celui du SBM.

Comme alternative au lavage à l'éthanol, nous avons évalué la saccharification et la bioconversion des glucides du soja en éthanol. Cela créerait un produit supplémentaire pour aider à compenser les coûts de traitement, tout en utilisant une matière sous-utilisée (les glucides de soja). Des enzymes hydrolytiques commerciales et de la levure ont été testées sur le soja et trois fractions de l'installation d'extraction d'huile de soja. Nous avons émis l'hypothèse qu'une grande partie des protéines ou des lipides utilisés par la levure comme nutriments resteraient dans les solides finaux sous forme de masse cellulaire de levure. De plus, nous nous attendions à une augmentation de la teneur en protéines due à la conversion des glucides en protéines cellulaires.

2. Matériels et méthodes

2.1. Substrats

Les substrats testés comprenaient du soja entier, des coques de soja, des flocons blancs et de la farine de soja dégraissée. Ceux-ci ont été obtenus en cadeau de South Dakota Soybean Processors, Volga, SD, États-Unis. La figure 1 montre un organigramme simplifié du traitement du soja par solvant organique pour désigner la source des substrats. Les substrats ont été broyés à l'aide d'un tamis Wiley Mill (2 mm) et conservés à température ambiante. Ces substrats ont été soumis à une analyse immédiate par Olson Agricultural Analytical Laboratories de la South Dakota State University à Brookings, SD, États-Unis et les résultats sont présentés dans le tableau 1.


2.2. Enzymes

Les enzymes ont été obtenues en cadeau de Novozymes (Franklinton, NC, USA). NS 50013 (Celluclast 1.5 L) est un cocktail de cellulase avec une activité de 70 FPU/g. NS 50010 (Novozyme 188) est un ??-glucosidase avec une activité de 250 CBU/g. NS 22016 est un cocktail de pectinase avec une activité de 3800 U/mL. Les enzymes ont été stockées à 4°C avant utilisation.

2.3. Levure

Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2034 et Stipite de Scheffersomyces NRRL Y-7124 ont été obtenus auprès de l'USDA ARS Culture Collection (Peoria, IL, USA). Pour l'entretien à court terme, les cultures ont été cultivées sur des plaques et des plaques inclinées Potato Dextrose Agar (PDA) pendant 72 h à 35°C, puis stockées à 4°C, avec repiquage des organismes toutes les 4 semaines. La lyophilisation dans une solution de saccharose à 20 % a été utilisée pour le stockage à long terme.

L'inoculum pour tous les essais a été préparé en inoculant de manière aseptique un bouillon stérile à 5 % de glucose et 0,5 % d'extrait de levure (100 ml dans des flacons Erlenmeyer de 250 ml) avec une aliquote de 1 % (v/v) pour S. cerevisiae, ou 5% (v/v) pour S. stipitis, à partir de cultures de graines en bouillon conservées à 4°C. Les flacons d'inoculum ont été incubés pendant 24 h à 35°C dans un agitateur rotatif à 250 tr/min. Les cultures de graines en bouillon ont été cultivées pendant 24 h à 250 tr/min avant réfrigération et utilisées dans les 60 jours pour ensemencer des flacons pour l'inoculum.

2.4. Tampons et antibiotiques

Les essais de saccharification et de SSF ont été menés dans un tampon stérile de citrate de sodium 0,1 M avec le pH ajusté à 4,8 en utilisant H concentré2DONC4. Une solution mère de 10 mg/mL de tétracycline HCl (70 % d'éthanol et stérilisée par filtre) a été préparée et stockée à -20°C, à partir de laquelle 0,4 mL/100 mL de volume d'essai total ont été utilisés pour éviter la contamination bactérienne. Une solution mère de 10 mg/mL de cycloheximide (stérilisée par filtration) a été préparée et stockée à 4°C, à partir de laquelle 0,3 mL/100 mL de volume d'essai total ont été utilisés pour le contrôle de la contamination dans les essais de saccharification uniquement.

2.5. Saccharification des fractions de soja

Des essais de saccharification ont été réalisés en mélangeant 15 g de substrat broyé avec 75 ml de tampon citrate de sodium 0,1 M stérile, ainsi que des solutions de tétracycline et de cycloheximide dans des erlenmeyers de 250 ml munis de bouchons en caoutchouc. Le pH des solutions a été ajusté à 5,0 en utilisant H concentré2DONC4 ou NaOH 12 M. Les bouchons ont été percés avec des aiguilles de seringue de calibre 21 et Whatman 0,2 ??m filtres à seringue. Les dosages d'enzymes par gramme de glucane comprenaient 23,2 FPU de NS 50013, 41 CBU de NS50010 et 500 U NS 22016. Le tableau 2 présente un résumé des niveaux de glucane trouvés dans la littérature pour chaque fraction de soja, et ceux-ci ont été moyennés pour calculer le dosage enzymatique. Le tableau 3 montre le volume d'enzymes utilisé pour chaque substrat. De l'eau déminéralisée stérile a été ajoutée à chaque flacon pour amener le volume total à 150 ml, résultant en un taux de charge solide de 10 %. Des essais de saccharification ont été effectués pendant 96 h dans un agitateur alternatif à 50°C réglé à 250 tr/min. Des flacons dépourvus d'enzymes ont été utilisés comme témoins pour déterminer le type et la quantité de glucides qui seraient libérés par solubilisation.

2.6. Saccharification et fermentation simultanées de fractions de soja

Les substrats broyés (15, 30, 45 ou 60 g) ont été mélangés avec 150 ml de tampon stérile au citrate de sodium 0,1 M, ainsi qu'une quantité appropriée de solution de tétracycline dans des flacons Erlenmeyer de 500 ml munis de bouchons en caoutchouc percés avec une seringue de calibre 21 aiguilles et attaché à Whatman 0.2 ??m filtres à seringue. Le pH a été ajusté à 5,0 en utilisant H concentré2DONC4 ou NaOH 12 M. Les substrats n'ont pas été autoclavés dans le but de préserver l'intégrité des protéines et des glucides en empêchant la réaction de Maillard [25] ainsi qu'en conservant les paramètres les plus probables pour les applications industrielles. Les dosages d'enzymes par gramme de glucane comprenaient 23,2 FPU de NS 50013, 41 CBU de NS 50010 et 500 U de NS 22016. Le tableau 2 montre la quantité de substrat, de fibres et d'enzymes utilisées au taux de charge de 5 % pour chaque substrat. Les quantités de ces composants ont augmenté proportionnellement aux niveaux de charge solides plus élevés. De l'eau déminéralisée stérile a été ajoutée pour amener le volume total à 297 ml, puis 3 ml d'une culture de 24 h de l'un ou l'autre S. cerevisiae ou S. stipitis était ajouté. Les flacons ont été incubés pendant 96 h dans un agitateur alternatif à 35°C réglé à 250 tr/min. Des flacons témoins sans enzymes ont également été inclus pour évaluer la production d'éthanol à partir des glucides libres libérés par les substrats. Ces contrôles ont été préparés de la même manière que décrit ci-dessus, sauf que les volumes d'enzymes ont été remplacés par de l'eau désionisée stérile.

2.7. Méthodes analytiques

Des échantillons (5 à 10 ml) ont été prélevés aseptiquement des flacons à 0, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 et 96 h. Les échantillons ont été bouillis pendant 5 minutes pour inactiver les enzymes, puis centrifugés à 2400 xg pendant 10 minutes. Après 24 h de congélation à -20°C, les échantillons ont été décongelés, centrifugés à nouveau à 13 000 rpm pendant 15 min, et le surnageant a été filtré sur 0,2 ??m filtre à seringue dans des flacons d'échantillonneur automatique HPLC.

Les glucides ont été analysés en utilisant une HPLC Waters 1200 avec une colonne Waters Sugar-pak I et un détecteur d'indice de réfraction. La phase mobile pour la colonne Sugar-pak I était de l'EDTA de calcium 0,0001 M circulant à un débit de 0,5 ml/min, avec la colonne à 65°C. Les concentrations d'éthanol ont été déterminées en utilisant une HPLC Waters 717 avec une colonne Aminex HPX-87H et un détecteur d'indice de réfraction (RID) Waters 2410. La phase mobile était de 0,005 M H2DONC4 circulant à un débit de 0,6 mL/min, avec la colonne à 65°C.

À la fin des essais de saccharification et de SSF, dans les expériences de taux de charge solide de 10 %, les suspensions de toutes les répétitions d'un essai ont été combinées et évaporées à sec dans un four à 80 °C pendant 96 h. Une analyse immédiate a été réalisée sur les solides par Olson Agricultural Analytical Laboratory Services (South Dakota State University, Brookings, SD, USA).

2.8. L'analyse des données

Les essais de saccharification ont été effectués en réplicats de six, tandis que les essais SSF ont été effectués en triple. Les paramètres analysés comprenaient la concentration maximale en éthanol, la productivité en éthanol et les glucides résiduels. La différence en pourcentage de la teneur en fibres, protéines et lipides par rapport au substrat d'origine a été calculée à l'aide des formules énumérées ci-dessous. Les glucides résiduels ont été corrigés en soustrayant les résultats de glucides supplémentaires résultant d'enzymes ou d'un tampon dénaturés. Les graphiques et les calculs ont été réalisés dans Microsoft Excel 2007. (i) Productivité en éthanol (g/L/h) = (concentration maximale nette en éthanol)/temps. (ii) Différence en pourcentage des composants (%) = ((% de suspension séchée après essai) - (% de substrat d'origine))/% de substrat d'origine.

3. Résultats et discussion

3.1. Saccharification des fractions de soja

Le tableau 4 montre la composition des quatre substrats de soja après 96 h de saccharification. Les essais (six répétitions) ont été menés à un taux de charge solide de 10 %, avec et sans enzymes. Les niveaux de glucides solubles dans le bouillon saccharifié ont été déterminés par HPLC pour chaque réplication individuelle. Après la saccharification, les solides des six réplications de chaque traitement ont été combinés, séchés et analysés pour les niveaux de fibres, de protéines et de lipides. La différence en pourcentage pour les concentrations de fibres, de protéines et de lipides, par rapport au substrat avant la saccharification, a été calculée.

Comme prévu, la présence d'enzymes a entraîné des niveaux de glucides solubles plus élevés pour chacun des substrats, par rapport aux essais témoins dépourvus d'enzymes. Cette différence était statistiquement significative pour tous les substrats à l'exception des flocons blancs et était également corrélée à la réduction de la teneur en fibres. Les haricots entiers contenaient la plus faible concentration de fibres, en raison de la présence à la fois de lipides et de protéines. Par conséquent, les glucides solubles étaient les plus faibles et seule une réduction modérée du pourcentage de fibres a été observée. L'efficacité de la saccharification enzymatique dans les fèves crues peut avoir été réduite par l'absence de tout effet de prétraitement fourni par l'opération typique de transformation du soja. D'autre part, les coques contenaient le niveau le plus élevé de fibres et ont donc répondu le plus significativement à l'hydrolyse enzymatique, produisant le niveau le plus élevé de glucides et le plus grand pourcentage de réduction de fibres.

Dans le processus de broyage du soja, après l'extraction de l'huile, les solides sont appelés flocons blancs. Ce matériau est ensuite chauffé pour chasser tout hexane résiduel et inactiver certains facteurs antinutritionnels. De faibles niveaux de coques peuvent ensuite être ajoutés aux flocons blancs pour réduire la teneur en protéines à

45%. Cette matière est alors appelée tourteau de soja. Ainsi, les flocons blancs et le tourteau de soja sont de composition relativement similaire et nous anticipions des résultats similaires lors de la saccharification. Comme on peut le voir dans le tableau 4, le tourteau de soja a entraîné des glucides solubles plus élevés et un effet plus important de l'ajout d'enzymes. Cela était peut-être dû au traitement thermique supplémentaire et/ou à la présence de certaines coques.

Les niveaux de protéines et de lipides dans les échantillons ne devraient pas changer de manière significative, car seules de petites quantités d'enzymes, de tampons et d'autres composants ont été ajoutées et les solides totaux ont été récupérés. Le seul changement significatif attendu était la conversion des fibres en sucres solubles comme décrit ci-dessus. Les changements dans les niveaux relatifs de protéines variaient de -14% à +11% et n'ont montré aucune tendance significative. Les niveaux de lipides dans les fèves entières ont augmenté de 4,5% à 12,9%, encore une fois probablement en raison d'une plus grande solubilisation pendant le processus de saccharification. Les niveaux de lipides dans les autres matériaux étaient très faibles et, par conséquent, une légère variabilité des valeurs a entraîné d'importants changements en pourcentage.

3.2. Substrat de soja SSF

Each substrate was subjected to SSF treatment using four different concentrations of substrate (5%, 10%, 15%, or 20% solid loading rate (SLR)) as well as either S. cerevisiae ou S. stipitis. Enzyme dosages were normalized based on glucan levels and control trials lacking enzymes were also performed. Carbohydrate and ethanol titers were monitored throughout each 96 h SSF. After SSF, the replicates from the 10% solid loading rate treatments were combined and dehydrated for fiber, protein, and lipid analysis by Olson Agricultural Analytical Laboratory Services.

Figure 2 shows that the maximum ethanol titer of both yeasts increased as the SLR of soybeans was increased from 5% to 20%, as was expected. In most treatments, S. cerevisiae produced more ethanol than S. stipitis (maxima of 12.357 g/L ± 5.213 for S. cerevisiae with enzymes, 7.726 g/L ± 1.167 for S. stipitis). However, the difference was only significant in the 15% SLR trial with enzymes and the 20% SLR trial without enzymes. The presence of enzymes enhanced ethanol levels, but was only statistically significant in the 5% SLR trials. The high degree of variability in the 15% and 20% SLR trials was likely due to the high viscosity of these trials, which reduced mixing efficiency.


Maximum ethanol titer from soybeans after 96 h SSF or fermentation 1 . 1 Error bars represent one standard deviation.

Figure 3 shows the corresponding ethanol productivities for the soybean SSF or fermentation trials, which were calculated at the time of maximum ethanol concentration. As expected, ethanol productivities also increased as SLRs increased from 5% to 20%. In most comparisons, S. cerevisiae had significantly higher productivities compared to S. stipitis. Ethanol productivities were actually higher in many of the enzyme-free trials (maxima of 0.397 g/L/h ± 0.127 for S. cerevisiae and 0.134 g/L/h ± 0.107 for S. stipitis, both 15% SLR without enzymes), suggesting that enzymatic hydrolysis of the nonpretreated soybean was the rate limiting factor.


Ethanol productivity from soybeans after 96 h SSF or fermentation 1 . 1 Error bars represent one standard deviation.

Figure 4 shows the total residual carbohydrate levels after 96 h SSF or fermentation. The levels of residual carbohydrates increased as the SLR increased, reflecting an accumulation of stachyose, raffinose, or partial hydrolysis products of the oligosaccharides. This was due to the inability of either yeast to fully catabolize the oligosaccharides [26]. S. cerevisiae can hydrolyze the fructose residue from both stachyose and raffinose by use of invertase [27, 28], but cannot hydrolyze the other bonds. S. stipitis does not produce invertase and cannot catabolize either oligosaccharide. In most treatments, total residual carbohydrate levels were similar between yeasts however, at the 10% and 20% SLR trials with enzymes, S. stipitis accumulated significantly higher carbohydrate levels than S. cerevisiae. Also expected were the higher carbohydrate levels in enzyme-hydrolyzed trials compared to enzyme-free trials. The highest carbohydrate concentration was 20% SLR with enzymes and S. stipitis (18.76 g/L ± 5.501), and the lowest was 5% SLR without enzymes with S. cerevisiae (1.96 g/L ± 0.661).


Residual carbohydrates from soybeans after 96 h SSF or fermentation 1 . 1 Error bars represent one standard deviation.

Figures 5–7 show the maximum ethanol titers, ethanol productivities, and residual carbohydrate levels for SSF and fermentation trials with hulls. Since the hulls contain primarily fiber, and lower levels of oligosaccharides than the other soybean fractions, we anticipated that ethanol production would be enhanced. Figure 5 shows a statistically significant difference in ethanol production between SSF trials with versus without enzymes as well as increased ethanol production as the SLR increased (except between 15% and 20% SLR). S. cerevisiae outperformed S. stipitis at the higher SLRs, perhaps due to increased ethanol tolerance. Maximum concentrations obtained were 23.177 g/L ± 10.148 for S. cerevisiae and 14.501 g/L ± 6.748 for S. stipitis. As with the beans, the hulls were highly viscous at the higher SLRs, making proper mixing of the slurry very difficult, adding to the variability of the trials.


IHC Troubleshooting Guide

The following image provides an example of IHC staining.

Immunohistochemistry of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cancer tissue. Analysis was performed to compare Connexin 43 membrane staining in FFPE sections of human lung adenocarcinoma (right) compared to a negative control without primary antibody (left). To expose target proteins, heat-induced epitope retrieval (HIER) was performed using 10 mM sodium citrate (pH 6.0), followed by heating in a microwave for 8 to 15 minutes. After HIER, tissues were blocked in 3% H2O2 in methanol for 15 minutes at room temperature, washed with distilled H2O and PBS, and then probed overnight at 4°C in a humid environment with an Invitrogen Connexin 43 monoclonal antibody (Cat. # 13-8300), diluted 1:20 in PBS/3% (w/v) BSA. Tissues were washed extensively in PBS buffer containing 0.05% (v/v) Tween-20 (PBST). Detection was performed using an HRP-conjugated secondary antibody followed by chromogenic detection using DAB as the substrate. The sections were counterstained with hematoxylin and dehydrated with ethanol and xylene prior to mounting.

The following points are provided to help identify the cause of high background staining, which results in a poor signal-to-noise ratio. See also the additional notes sections at the bottom of this page for more information.

Cause: Endogenous enzymes

Incubate a test tissue sample with the detection substrate alone for a length of time equal to that of the antibody incubation. A strong background signal suggests interference from endogenous peroxidases or phosphatases.

  • Solution: Quench endogenous peroxidases with 3% H2O2 in methanol or water or use a commercial kit, such as Thermo Scientific Peroxidase Suppressor.

Endogenous phosphatases can be inhibited with the endogenous alkaline phosphatase inhibitor, levamisole.

Cause: Endogenous biotin or lectins

High background can occur when endogenous biotin is not blocked prior to adding the avidin–biotin–enzyme complex.

If the ABC complex is made with avidin, the highly-glycosylated protein can bind to lectins in the tissue sample.

  • Solution: Block endogenous lectins with 0.2 M alpha-methyl mannoside in dilution buffer. Alternatively, use streptavidin or Thermo Scientific NeutrAvidin Protein instead of avidin, because both are not glycosylated and won't bind to lectins.

Cause: Secondary antibody cross-reactivity or nonspecific binding

The secondary antibody may show a strong or moderate affinity for identical or similar epitopes on non-target antigens.

  • Solution: If normal serum from the source species for the secondary antibody is used to block the tissue, then increase the serum concentration to as high as 10% (v/v), if necessary. If you are blocking with another reagent (BSA, nonfat dry milk), then add 2% (v/v) or more normal serum from the source species for the secondary antibody. Alternatively, reduce the concentration of the biotinylated secondary antibody.

Egg white, which contains avidin, was often used to coat slides, dilute antibodies or block tissue samples because it is a readily available and inexpensive source of carrier proteins. It is used very rarely nowadays.

  • Solution: Avoid using egg whites to prevent egg white–based avidin from binding biotinylated secondary antibody during IHC staining. Synthetic tissue adhesives as well as avidin-free antibody diluents and blocking buffers are readily available.

Cause: Issues with the primary antibody

Nonspecific interactions between the primary antibody and non-target epitopes in the tissue sample occur regularly during incubation but at a level that does not influence background staining. A high primary antibody concentration will increase these interactions and thus increase nonspecific binding and background staining.

The primary antibody may also show a strong or moderate affinity for identical or similar epitopes on non-target antigens.

  • Solution: Increase the blocking buffer composition and/or concentration, or use a different primary antibody.

The primary antibody diluent may contain little or no NaCl, which helps to reduce ionic interactions.

  • Solution: Add NaCl to the blocking buffer/antibody diluent so that the final concentration is between 0.15 M and 0.6 M NaCl. The best NaCl concentration to use will have to be determined empirically.

Apprendre encore plus

Sélectionnez des produits

See also the additional notes sections at the bottom of this page for more information.

Cause: Enzyme–substrate reactivity

Even when the tissue sample is properly prepared and labeled, the enzyme–substrate reaction must occur for the chromogenic precipitate to form. Deionized water can sometimes contain peroxidase inhibitors that can significantly impair enzyme activity. Additionally, buffers containing sodium azide should not be used in the presence of HRP. Finally the pH of the substrate buffer must be appropriate for that specific substrate.

A simple test to verify that the enzyme and substrate are reacting properly is to place a drop of the enzyme onto a piece of nitrocellulose and then immediately dip it into the prepared substrate. If the enzyme and substrate are reacting properly, a colored spot should form on the nitrocellulose.

Solution: Change the enzyme diluent and/or prepare substrate at the proper pH and repeat the test.

Cause: Primary antibody potency

Primary antibodies generally lose affinity for the target antigen over time, either due to protein degradation or denaturation caused by long-term storage, microbial contamination, changes in pH or harsh treatments (e.g., freeze/thaw cycles).

Test the primary antibody for potency by staining tissue samples known to contain the target antigen with various concentrations of the primary antibody do the test concurrently with the test sample. If the positive control is not positive for the target antigen at all, then this suggests that the primary antibody has lost potency. In fact, it is good laboratory practice to always run a positive control sample through your staining protocol along with the experimental samples.

Solution: Ensure that the antibody diluent pH is within the specified range for optimum antibody binding (7.0 to 8.2) and that the antibody is stored according to the manufacturer's instructions. To prevent contamination of your antibody solutions, wear gloves when dispensing antibodies, and use sterile pipette tips, if appropriate. Even if you store your antibodies in a refrigerator, always divide them into separate small aliquots. This prevents contamination or loss of the whole vial of antibody if a problem arises.

Cause: Secondary antibody inhibition

While high concentrations of the secondary antibody can increase background staining, extremely high concentrations can have the opposite effect and reduce antigen detection.

To test if the secondary antibody concentration is inhibitory, stain positive control samples using decreasing concentrations of the secondary antibody. An increase in signal as the concentration decreases suggests that antibody concentration is too high.

Solution: Reduce the concentration of the secondary antibody.

If the diluent and/or blocking solution contains antigen-neutralizing antibodies, such as those found in serum, then the antibodies will block secondary antibody binding.

Solution: Remove the neutralizing antibodies or change to a different diluent and/or blocking solution.


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Voir la vidéo: Réaction du sodium sur léthanol (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Dagen

    Désolé de ne pas pouvoir participer à la discussion pour le moment - il n'y a pas de temps libre. Je reviendrai - j'exprimerai certainement mon opinion sur cette question.

  2. Nam

    Vous n'êtes pas correcte. Je suis sûr. Je peux le prouver.

  3. Thaddeus

    Je peux à peine croire celui-là.



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