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9.11 : Buvardage - Biologie

9.11 : Buvardage - Biologie


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Le transfert fournit un moyen d'identifier des molécules spécifiques à partir d'un mélange. Le mélange pourrait être de l'ADN (Southern Blot), de l'ARN (Northern Blot) ou une protéine (Western Blot) et le gel pourrait être de l'agarose (pour l'ADN/ARN) ou du polyacrylamide (pour la protéine). Ce "blot", comme on l'appelle, a une empreinte des bandes d'acide nucléique ou de protéine qui étaient dans le gel (voir figure à gauche). Si la molécule d'intérêt est dans le mélange d'origine, elle "s'allumera" et se révèle.


Modification haute fréquence et précise du génome de la tomate

L'utilisation de la recombinaison homologue pour modifier avec précision les génomes des plantes a été difficile, en raison du manque de méthodes efficaces pour fournir des matrices de réparation d'ADN aux cellules végétales. Même avec l'avènement des nucléases spécifiques à une séquence, qui stimulent la recombinaison homologue sur des sites génomiques prédéfinis en créant des cassures double brin ciblées de l'ADN, seules quelques études rapportent une édition précise des gènes endogènes dans les plantes cultivées. Des méthodes plus efficaces sont nécessaires pour modifier les génomes des plantes par recombinaison homologue, idéalement sans intégrer de manière aléatoire l'ADN étranger.

Résultats

Ici, nous utilisons des réplicons de géminivirus pour créer des modifications héréditaires du génome de la tomate à des fréquences dix fois plus élevées que les méthodes traditionnelles de livraison d'ADN (c'est-à-dire, Agrobactérie). Un puissant promoteur a été inséré en amont d'un gène contrôlant la biosynthèse des anthocyanes, entraînant une surexpression et une accumulation ectopique de pigments dans les tissus de la tomate. Plus des deux tiers des insertions étaient précises et n'avaient aucune modification de séquence imprévue. TALENs et CRISPR/Cas9 ont tous deux atteint un ciblage génique avec des efficacités similaires. De plus, la modification ciblée a été transmise à la descendance d'une manière mendélienne. Même si les molécules donneuses ont été répliquées dans les vecteurs, aucune preuve n'a été trouvée de réplicons extra-chromosomiques persistants ou d'intégration hors cible d'ADN-T ou de séquences de réplicons.

Conclusion

Une modification précise à haute fréquence du génome de la tomate a été réalisée à l'aide de réplicons de géminivirus, ce qui suggère que ces vecteurs peuvent surmonter la barrière d'efficacité qui a rendu difficile le ciblage des gènes dans les plantes. Ce travail fournit une base pour une édition efficace du génome des génomes des cultures sans intégration aléatoire d'ADN étranger.


Résumé

Depuis 2010, les étudiants de deuxième année d'un programme de formation de huit ans menant à un doctorat en médecine ou à un doctorat en philosophie du Centre universitaire des sciences de la santé de Pékin (PKUHSC) sont tenus de participer au « projet de formation des talents innovants ». Pendant ce temps, les étudiants ont rejoint un laboratoire de recherche et ont participé à des travaux de recherche originaux. Il existe un besoin éducatif critique pour préparer ces étudiants à l'accessibilité croissante de l'expérience de recherche. Le programme expérimental repensé de biochimie et de biologie moléculaire a été développé pour répondre à une telle exigence, qui conserve deux expériences de biochimie originales (filtration sur gel et cinétique enzymatique) et ajoute un nouveau composant à deux expériences appelé "Analyse de l'apoptose induite par des médicaments anti-tumoraux". Le composant supplémentaire, également appelé « expérience orientée projet » ou « expérience globale », consiste en un transfert de Western et un test d'échelonnage de l'ADN pour évaluer les effets de l'étoposide (VP16) sur les voies de signalisation de l'apoptose. Ce système d'enseignement en laboratoire réformé vise à améliorer la compréhension globale des étudiants participants des techniques de recherche biologique importantes et de l'instrumentation impliquée, et à favoriser une meilleure compréhension du processus de recherche, le tout dans une salle de classe. Les commentaires des étudiants ont indiqué que le programme mis à jour les a aidés à améliorer leur capacité opérationnelle et d'auto-apprentissage, et a contribué à accroître leur compréhension des connaissances théoriques et des processus de recherche réels, ce qui a jeté les bases de leurs futurs travaux de recherche. © 2015 par l'Union internationale de biochimie et de biologie moléculaire, 43:428-433, 2015.


DISCUSSION

GRP78, la protéine clé du RE, est impliquée dans diverses maladies, telles que les tumeurs et les maladies neurodégénératives (Hebert-Schuster et al., 2018 Casas, 2017). Dans la présente étude, nous avons constaté que le GRP78 était fortement exprimé dans l'adénocarcinome pulmonaire et le carcinome épidermoïde pulmonaire, et était associé à un mauvais pronostic. De plus, l'inhibition de GRP78 par HA15 a significativement diminué la viabilité des cellules A549, H460 et H1975 d'une manière dépendante de la dose et du temps. HA15 a inhibé la prolifération des cellules A549, H460 et H1975 et favorisé l'apoptose. Le stress du RE et l'autophagie ont été déclenchés par HA15 dans les cellules A549 et ces processus ont été impliqués dans l'apoptose induite par HA15.

Il a été rapporté qu'une expression élevée de GRP78 pourrait favoriser la tumorigenèse et la résistance aux médicaments, et que l'inhibition de GRP78 pourrait améliorer l'efficacité des médicaments de chimiothérapie (Huang et al., 2016 Dauer et al., 2018 Cook et Clarke, 2015). Une étude clinique, incluant 163 échantillons de sang périphérique provenant de patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules, a révélé que le GRP78 est hautement enrichi aux stades avancés, significativement plus élevé que celui observé chez les patients à un stade précoce, ce qui peut être important dans la cancérogenèse des non-petites -le cancer du poumon à cellules, et est associé à un mauvais pronostic (Ma et al., 2015). Notre analyse bioinformatique a montré que le GRP78 était également plus élevé chez les patients atteints d'un cancer du poumon que chez les personnes en bonne santé au niveau transcriptomique, indiquant que le GRP78 peut être associé à la tumorigenèse et au développement du poumon.

Il a été rapporté que HA15, un nouvel inhibiteur ciblant GRP78, pourrait réguler à la hausse les niveaux de stress du RE dans les cellules de mésothéliome pleural malin, induire l'UPR et l'autophagie pro-apoptotique, et induire la mort cellulaire (Xu et al., 2019). De même, l'apoptose des cellules cancéreuses du poumon induite par HA15 était concomitante avec le stress du RE. Dans cette étude, nous avons constaté qu'après le traitement par HA15, la signalisation UPR pro-apoptotique était activée, entraînant une augmentation significative de l'expression de CHOP. Les images de microscopie électronique de cellules A549 exposées à HA15 ont montré des citernes du RE dilatées typiques, ce qui est une caractéristique classique du stress du RE, indiquant que le stress du RE est également impliqué dans l'apoptose induite par HA15 dans les cellules cancéreuses du poumon. Il semble étrange que HA15 puisse inhiber le GRP78 et déclencher le stress du RE en même temps. Cerezo et al., (2016) ont démontré que tandis que HA15 induisait la dissociation du GRP78, de la protéine kinase ARN (PER)-like ER kinase (PERK), IRE1α et ATF6, induisant ainsi un stress ER, GRP78 se lie à l'ATP avec une affinité élevée et son activité ATPase, stimulée par la liaison à la protéine dépliée, catalyse le repliement. HA15 est capable d'inhiber l'activité ATPase de GRP78 de manière dose-dépendante, entraînant l'accumulation de protéines dépliées et aggravant le stress du RE.

L'apoptose induite par HA15 est non seulement étroitement liée au stress du RE mais aussi à l'autophagie (Cerezo et al., 2016 Xu et al., 2019). De manière analogue, nous avons constaté que le traitement par HA15 de la lignée cellulaire de cancer du poumon, A549, activait l'autophagie et déclenchait la formation d'autophagosomes. Étant donné que l'autophagie est considérée comme une arme à double tranchant liée à la mort cellulaire, nous avons utilisé de la chloroquine pour bloquer le processus d'autophagie et avons constaté que la viabilité cellulaire de HA15 avec le traitement CHQ a été restaurée par rapport au traitement HA15 seul, ce qui a élucidé cette autophagie régulée à la hausse dans cette condition favorisait la mort cellulaire programmée. Il a été rapporté que les facteurs de transcription ATF4 et CHOP pourraient augmenter la transcription du gène de l'autophagie MAP1LC3B, qui code pour LC3B, et ATG5, l'expansion phagocytaire et la formation d'autophagosome (Rouschop et al., 2010). Fait intéressant, nous avons constaté que l'ATF4 et le CHOP étaient régulés à la hausse après le traitement par HA15, ce qui peut augmenter l'autophagie. Les ATG Les gènes contrôlant la formation des autophagosomes via les complexes Atg12-Atg5 et LC3B ont été régulés à la hausse après le traitement par HA15.

En résumé, GRP78 est fortement exprimé chez les patients atteints de cancer du poumon et est associé à un mauvais pronostic. L'inhibition ciblée de GRP78 par HA15 a favorisé l'apoptose des cellules cancéreuses du poumon, par l'implication du stress du RE et de l'autophagie. Cibler l'inhibition de GRP78 avec HA15 peut devenir une nouvelle cible pour le traitement clinique et le développement de médicaments à l'avenir.


Résumé

Pédiatrique MLL-la leucémie aiguë monoblastique réarrangée avec t(911)(p22q23) a un bon résultat par rapport aux autres MLL-LBA réarrangée. Le contexte biologique de cette différence est inconnu. Par conséquent, nous avons comparé les profils d'expression génique (GEP) des patients -t(911)(p22q23) avec d'autres MLL-réarranger les patients atteints de LAM pour identifier les gènes différentiellement exprimés.

Nous avons effectué une GEP (Affymetrix HG U133 plus 2.0) chez 245 patients pédiatriques atteints de LAM (237 de novo et 8 patients de LAM secondaire) et avons utilisé la RT-qPCR et le Western Blot pour valider l'expression. La PCR spécifique à la méthylation a été utilisée pour étudier la régulation épigénétique. Nous avons testé l'effet de l'agent déméthylant décitabine et l'effet du knock-down par l'ARNsi sur la prolifération et la sensibilité aux médicaments dans les lignées cellulaires AML.

IGSF4, une molécule d'adhésion cellule-cellule, était fortement exprimée dans AML-t(911). L'expression au sein de l'AML-t(911) était 18,5 fois plus élevée dans le FAB-M5 par rapport aux autres types de FAB (p = 0,013). La RT-qPCR et le Western Blot l'ont confirmé. L'enquête sur l'état de méthylation a montré que les patients à haute IGSF4 exprimant la LMA-t(911) avec FAB-M5 n'ont pas d'hyperméthylation du promoteur, alors que tous les autres cas en ont. Cela a également été observé dans les lignées cellulaires. L'incubation de lignées cellulaires avec de la décitabine a entraîné une déméthylation du promoteur et une expression accrue de IGSF4. Régulation à la baisse de IGSF4 par siRNA n'a pas affecté la prolifération ni la sensibilité aux médicaments en culture en suspension.

En conclusion, nous avons identifié IGSF4 la surexpression est discriminante pour AML-t(911) avec FAB-M5, régulée partiellement par la méthylation du promoteur.


Analyse moléculaire et cytogénétique

Anomalies 11q23

Réarrangements impliquant la méthyltransférase 2A spécifique de la lysine (K) ( KMT2A , auparavant connu sous le nom de lymphome leucémique mixte, MLL ou ALL1, HRX ou Htrx1) sur le chromosome 11q23 et des gènes partenaires multiples sont retrouvés dans les précurseurs B-ALL, T-ALL, AML, MDS et dans la leucémie secondaire. La présence de KMT2A réarrangements est généralement associée à un mauvais pronostic.

Dans ALL, le partenaire de translocation le plus courant de KMT2A est la famille AF4/FMR2, membre 1 (AFF1) sur le chromosome 4q21 bien que d'autres chromosomes partenaires aient été décrits. 68 Environ 50 à 70 % des cas de LAL infantile et environ 5 % des cas de LAL pédiatriques et adultes sont positifs pour le KMT2A-AFF1 gène de fusion, celui-ci étant associé à un phénotype pro-B-ALL (« null ») (CD19+, CD34+, terminal désoxynucléotidyl transférase+, cytoplasmique CD79a+, CD10-). Il existe également une expression fréquente d'antigènes myéloïdes (CD15 et/ou CD65).

Les KMT2A et AFF1 les gènes sont composés de 37 et 20 exons, respectivement, et au moins 10 transcrits de fusion différents ont été identifiés en raison de points de rupture de translocation se produisant dans différents introns des deux gènes. Points d'arrêt en aval de la KMT2A exon 9 dans la LAL adulte et pédiatrique mais en aval de l'exon 11 dans la LAL infantile et en amont de l'exon 4 de la LAL AFF1 gène sont couramment détectés par PCR. L'épissage variable est une constatation courante conduisant à plus d'un transcrit de fusion chez certains patients. Tous les cas t(411)-positifs transcrivent le KMT2A-AFF1 gène de fusion alors que seulement 70 % des cas transcrivent la réciproque, AFF1-KMT2A produit. Fait intéressant, les faibles niveaux de KMT2A-AFF1 transcrits ont été détectés dans certains cas de LAL sans t(411) cytogénétiquement détectable et dans les tissus hématopoïétiques d'individus sains.

En utilisant une stratégie PCR imbriquée, les différents KMT2A-AFF1 les transcrits peuvent être identifiés avec une limite de détection de 1 sur 10 4 –10 5 . Pour une description complète de la méthodologie utilisée pour la détection et la surveillance moléculaire de cette translocation et d'autres dans cette section, nous renvoyons à un rapport très complet. 42 Des études MRD ont montré qu'une conversion précoce et une négativité MRD persistante sont systématiquement associées à la CCR.


Matériaux et méthodes

Marquage épitopique de gènes et isolement de complexes protéiques

Les transformations pour les deux levures ont été effectuées comme décrit [7, 9]. Les gènes d'intérêt ont été marqués par fusion dans le cadre des ORF avec une cassette de ciblage générée par PCR codant pour l'étiquette TAP et un marqueur sélectionnable. Les intégrations correctes des cassettes ont été confirmées par PCR et analyse Western blot. Deux S. cerevisiae les souches avec les gènes marqués par TAP YGR099W et YJR136C ont été obtenues auprès d'Euroscarf (Francfort am Main, Allemagne). Le cassage et l'extraction des cellules de levure ont été effectués comme décrit [7] avec des modifications [10]. Les protéines purifiées ont été concentrées selon Wessel et Fluegge [93] et chargées sur des gels de polyacrylamide à gradient unidimensionnel (6-18%).

Séparation des protéines et digestion en gel

Les bandes de protéines ont été visualisées par coloration au Coomassie. Des voies complètes ont été découpées en environ 30 à 40 tranches pour améliorer la plage dynamique de détection, les bandes visibles ont toujours été découpées séparément. Les bouchons de gel excisés ont été coupés en cubes d'environ 1 mm × 1 mm × 1 mm et digérés dans le gel avec de la trypsine porcine modifiée de qualité séquençage (numéro de catalogue V5111, Promega, Mannheim, Allemagne) comme décrit dans [94]. Ensuite, des aliquotes de 1 ul ont été prélevées directement des digestions en gel pour l'identification des protéines par cartographie peptidique MALDI. Le reste du matériau peptidique a été extrait des morceaux de gel avec de l'acide formique à 5 % et de l'acétonitrile et les peptides récupérés ont été séchés dans une centrifugeuse sous vide.

Identification des protéines par cartographie de masse peptidique MALDI

Lorsque spécifié, des aliquotes de 1 l de digestions en gel ont été analysées sur un spectromètre de masse REFLEX IV (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne) en utilisant des sondes AnchorChip (Bruker Daltonics) comme décrit dans [95, 96]. Les pics ont été sélectionnés manuellement et leur m/z recherché dans la base de données de protéines MSDB de S. cerevisiae ou S. pombe espèces à l'aide du logiciel MASCOT 2.0 (Matrix Science Ltd, Londres, Royaume-Uni), installé sur un serveur local à deux processeurs. La tolérance de masse a été fixée à 50 ppm de modifications variables : méthionines oxydées, un faux clivage par séquence de peptide tryptique a été autorisé. Les spectres ont été calibrés en externe en utilisant m/z de produits connus d'autolyse de la trypsine abondante comme références. Les hits protéiques dont le score MOWSE dépasse la valeur de 51 (le score de confiance seuil suggéré par MASCOT pour p < 0,05 et la base de données spécifique à l'espèce correspondante) ont été considérés comme significatifs, mais n'ont été acceptés qu'après une inspection manuelle supplémentaire, qui a permis de s'assurer que le m/z de tous les pics majeurs du spectre correspondaient aux masses de peptides des séquences protéiques correspondantes ou des produits d'autolyse trypsique connus.

Identification des protéines par LC-MS/MS

Les extraits peptidiques séchés ont été redissous dans 20 l d'acide trifluoroacétique à 0,05 % (v/v) et 4 l ont été injectés à l'aide d'un passeur d'échantillons FAMOS dans un système nanoLC-MS/MS Ultimate (Dionex, Amsterdam, Pays-Bas) interfacé en ligne à un spectromètre de masse LTQ à piège à ions linéaire (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). La phase mobile était de 95:5 H2O:acétonitrile (v/v) avec 0,1% d'acide formique (solvant A) et 20:80 H2O:acétonitrile (v/v) avec 0,1% d'acide formique (solvant B, Lichrosolv classe). Les peptides ont d'abord été chargés sur une microcolonne de piégeage C18 PepMAP100 (1 mm × 300 mm ID, 5 mm, Dionex) dans 0,05 % d'acide trifluoroacétique à un débit de 20 ml/minute. Après 4 minutes, ils ont été élués par rétro-rinçage et séparés sur une nanocolonne C18 PepMAP100 (15 cm × 75 m ID, 3 m, Dionex, Sunnyville, CA, USA) à un débit de 200 nl/minute dans le gradient de phase mobile : de 5 à 20 % de solvant B en 20 minutes, 20 à 50 % de B en 16 minutes, 50 à 100 % de B en 5 minutes, 100 % de B pendant 10 minutes, et retour à 5 % de B en 5 minutes %B se réfère à la teneur en solvant B (v/v) dans le mélange A+B. Les peptides ont été infusés dans le spectromètre de masse via une sonde nanospray dynamique (Thermo Fisher Scientific) et analysés en mode positif. Des aiguilles non revêtues Silicatip, 20 m de DI, 10 m de pointe (New Objective, Woburn, MA, USA) ont été utilisées avec une tension de pulvérisation de 1,8 kV, et la température de transfert capillaire a été réglée à 200°C. Dans un cycle d'acquisition typique dépendant des données contrôlé par le logiciel Xcalibur 1.4 (Thermo Fisher Scientific), les quatre ions précurseurs les plus abondants détectés dans le balayage complet de l'enquête MS (m/z allant de 350 à 1 500) ont été isolés dans une fenêtre de 4,0 amu et fragmentés. La fragmentation MS/MS a été déclenchée par un seuil d'intensité de signal minimum de 500 comptes et réalisée à l'énergie de collision normalisée de 35%. Les spectres ont été acquis sous contrôle automatique de gain dans un microbalayage pour les spectres d'étude et dans trois microscans pour les spectres MS/MS avec un temps d'injection d'ions maximal de 100 ms pour chaque microbalayage. M/z des précurseurs fragmentés ont ensuite été exclus dynamiquement pendant 60 s supplémentaires. Aucune liste d'exclusion précompilée n'a été appliquée.

Les spectres MS/MS ont été exportés sous forme de fichiers dta (format texte) à l'aide du logiciel BioWorks 3.1 (Thermo Fisher Scientific) sous les paramètres suivants : plage de masse peptidique, seuil minimal d'intensité ionique totale de 500 à 3 500 Da, 1 000 nombre minimal d'ions fragments, 15 précurseurs tolérance de masse, 1,4 analyse de groupe amu, 1 nombre de groupes minimum, 1.

Traitement des spectres MS/MS et recherches dans les bases de données

Les fichiers Dta ont été fusionnés en un seul fichier au format générique MASCOT (mgf) et recherchés dans une base de données de S. cerevisiae ou S. pombe protéines utilisant MASCOT v.2.2 installé sur un serveur local à deux CPU. La tolérance pour les masses de précurseurs et de fragments était de 2,0 et 0,5 Da, respectivement, profil de l'instrument, modification de la variable ESI-Trap, oxydation (méthionine) permis nombre de faux clivages, 1 seuil d'ion peptidique, 15.

Les résultats étaient considérés comme sûrs si deux spectres MS/MS ou plus correspondaient aux séquences de la base de données et que leurs scores d'ions peptidiques dépassaient la valeur de 31 (le score seuil suggéré par MASCOT pour une correspondance sûre d'une seule séquence peptidique à p < 0.05). Pour chaque protéine identifiée, le nombre de peptides appariés et de spectres MS/MS a été exporté de la sortie MASCOT vers des feuilles de calcul Excel à l'aide d'un script développé en interne, qui a en outre créé une liste non redondante de protéines détectées dans toutes les bandes analysées de la même expérience IP. Si la même protéine était séquencée dans plusieurs bandes, seule l'analyse qui produisait le plus grand nombre de peptides et de spectres appariés était rapportée.

Identification des protéines dans le S. pombebase de données du génome

Lorsque spécifié, les peptides trypsiques récupérés ont été séquencés de novo par spectrométrie de masse en tandem nanoélectrospray sur un QSTAR Pulsar je spectromètre de masse quadripolaire à temps de vol (MDS Sciex, Concord, Canada) tel que décrit [97]. Les spectres MS/MS ont été interprétés manuellement à l'aide du logiciel BioAnalyst QS v.1.1 et les séquences candidates ont été recherchées par rapport à la séquence génomique de S. pombe par le tblastn programme sur le serveur NCBI BLAST. La recherche a trouvé, avec plusieurs peptides appariés, un segment non annoté sur le chromosome 1. Par la suite, la séquence complète du gène a été produite par 5'-RACE et déterminée à l'installation de séquençage d'ADN du MPI CBG, Dresde.

Identification bioinformatique de gènes orthologues

Les recherches dans la base de données de séquences protéiques ont été effectuées en utilisant une version autonome de NCBI-BLAST et l'interface PSI-BLAST (position-specific iterated BLAST) au NCBI [98]. Pour identifier les gènes orthologues dans S. cerevisiae et S. pombe, nous avons effectué des recherches BLAST automatisées en utilisant des séquences de toutes les sous-unités de tous les complexes identifiés. Les orthologues potentiels ont été évalués plus avant par des recherches BLAST réciproques en utilisant tous les résultats dont E-les valeurs étaient moins de 10 fois plus élevées que les E-valeur du meilleur coup. Les meilleurs résultats dans les recherches réciproques ont été considérés comme des orthologues. Si aucune paire de meilleurs résultats réciproques n'a été identifiée, des recherches PSI-BLAST ont été effectuées contre toutes les séquences fongiques dans la base de données de protéines non redondantes. ELes valeurs et les itérations PSI-BLAST pour les orthologues très divergents sont illustrées à la figure S3 dans le fichier de données supplémentaires 2. Les alignements de séquences multiples également illustrés à la figure S3 dans le fichier de données supplémentaires 2 ont été effectués manuellement en utilisant des alignements par paires produits par BLAST comme modèle . Les résidus qui ont été conservés dans au moins 75 % des séquences sont mis en évidence. L'identification des domaines de séquences protéiques a été réalisée à l'aide d'une version autonome du logiciel InterproScan [99] par rapport aux bases de données Superfamily et HMM-Pfam en utilisant les paramètres par défaut.

Interactions génétiques

Profils d'interaction génétique quantitatifs dans S. cerevisiae et S. pombe ont été générés comme décrit [51, 100]. Les coefficients de corrélation de Pearson ont été calculés entre toutes les paires possibles de profils génétiques pour un ensemble de gènes qui se chevauchent chez les deux espèces et les données correspondant à Set3 et Hos2 (Hda1) sont présentées sous forme de nuages ​​de points sur la figure 5.


Introduction

D'un point de vue métabolique, la caractéristique la plus frappante et la plus commune des cellules cancéreuses est la production, malgré la disponibilité d'oxygène, d'une grande quantité d'acide lactique, résultant de l'augmentation de la glycolyse, qui est positivement corrélée à la régulation positive du transporteur de glucose. -1 (Glut1) et donc une augmentation de la captation du glucose [1,2,3,4,5]. Bien que Warburg ait été le premier à observer ce phénomène dans les années 1920, sa base moléculaire et sa relation avec la génétique du cancer sont encore incomplètement comprises. Il existe différents facteurs de transcription, notamment les gènes/proto-oncogènes Myc ou les facteurs inductibles par l'hypoxie HIF-1 et HIF-2, qui sont connus pour réguler la glycolyse en se liant à un élément de réponse glucidique hautement conservé (ChoRE) avec la séquence consensus CACGTG ou des éléments sensibles à l'hypoxie (HRE) situés dans les promoteurs de gènes codant pour des enzymes glycolytiques telles que LDHA. Ces facteurs sont activés en réponse à des changements de saturation en oxygène et de tension ou d'accès au glucose et se sont avérés étroitement associés à la croissance et à la progression du cancer [6,7,8,9,10]. Il est connu que la glycolyse est nécessaire pour la transition de phase G1 à S dans le cycle cellulaire et la régulation négative de la glycolyse arrête la cellule dans la phase G1 du cycle cellulaire, indiquant que le métabolisme du glucose joue un rôle important dans la régulation de la prolifération cellulaire [6 , 9, 11]. Il est également connu qu'en présence d'oxygène la glycolyse est inhibée dans les cellules normales [12]. Cependant, la raison d'échapper à « l'effet Pasteur » dans les cellules cancéreuses et la préférence pour les procédés à basse énergie basés sur la conversion du glucose en lactate, même en présence d'oxygène, reste inexpliquée.


Comment un scientifique aux yeux perçants est devenu le détective d'images de la biologie

En utilisant uniquement ses yeux et sa mémoire, Elisabeth Bik a identifié à elle seule des milliers d'études contenant des images scientifiques potentiellement falsifiées.

En juin 2013, Elisabeth Bik, microbiologiste, s'est intéressée au sujet du plagiat. Elle avait lu que la malhonnêteté scientifique était un problème croissant, et elle se demandait paresseusement si son travail n'avait pas été volé par d'autres. Un jour, elle a collé une phrase d'un de ses articles scientifiques dans le moteur de recherche Google Scholar. Elle a découvert que plusieurs de ses phrases avaient été copiées, sans autorisation, dans un livre en ligne obscur. Elle a collé quelques phrases supplémentaires du même chapitre de livre dans le champ de recherche et a découvert que certaines d'entre elles avaient été volées dans les écrits d'autres scientifiques.

Bik a une disposition méthodique et approfondie, et elle a analysé le chapitre au cours du week-end. Elle a découvert qu'il contenait du texte plagié provenant de dix-huit sources non créditées, qu'elle a catégorisées à l'aide de surlignages codés par couleur. La recherche de plagiat est devenue une sorte de passe-temps pour Bik, elle a commencé à rechercher plus de cas sur Google Scholar pendant ses heures creuses, alors qu'elle ne travaillait pas comme chercheuse à Stanford. Elle a rapidement identifié trente faux papiers biomédicaux, certains dans des revues très respectées. Elle a envoyé un courrier électronique aux éditeurs des publications et, en quelques mois, certains des articles ont été retirés.

En janvier 2014, Bik parcourait une thèse suspecte lorsqu'elle a également commencé à jeter un coup d'œil aux images. Ils comprenaient des photographies connues sous le nom de Western blots, dans lesquelles les protéines apparaissent sous forme de bandes sombres. Bik pensait qu'elle avait déjà vu une bande de protéines en particulier – elle avait un gros petit point noir à une extrémité. Ailleurs dans la thèse, elle a trouvé la même bande retournée et présentée comme s'il s'agissait des données d'une expérience différente. Elle a continué à chercher et a repéré une douzaine de taches occidentales supplémentaires qui semblaient copiées ou subtilement trafiquées. Elle a appris que la thèse, écrite par un étudiant diplômé de l'Université Case Western Reserve, avait été publiée sous forme de deux articles de revue en 2010.

La présence d'une image défectueuse dans une étude scientifique n'invalide pas nécessairement ses observations centrales. Mais cela peut être un signe que quelque chose ne va pas. En science, les images sont extrêmement importantes : chaque image et chaque graphique d'un article scientifique sont censés représenter des données étayant les conclusions des auteurs. Les images photographiques, en particulier, ne sont pas des illustrations mais la preuve elle-même. Il semblait à Bik que les images dupliquées ou falsifiées pouvaient être plus dommageables pour la science que le plagiat.

Bik a décidé de parcourir certaines études récemment publiées dans PLOS Un, une revue « open access » dans laquelle les articles sont mis gratuitement à la disposition du public. (L'éditeur à but non lucratif de la revue facture des frais de traitement des articles aux auteurs.) Elle a ouvert quinze articles, chacun dans son propre onglet de navigateur, et a commencé à regarder les images sans lire le texte. En quelques heures, elle avait regardé une centaine d'études et repéré quelques images en double. "C'est très vite devenu addictif", m'a dit Bik, avec un accent hollandais marqué. Nuit après nuit, elle a collecté des articles problématiques, certains avec des Western blots en double, d'autres avec des images copiées de cellules ou de tissus. Tous étaient passés par un examen par les pairs avant d'être acceptés. Quelques duplications auraient pu être innocentes – peut-être une confusion par un scientifique avec un dossier plein de fichiers. Mais d'autres images avaient été clonées, étirées, agrandies, tournées ou inversées. Les formes et les modèles en biologie sont infiniment uniques Bik savait que ces duplications ne pouvaient pas se produire par accident. Pourtant, elle ne voulait pas impliquer à tort un collègue scientifique dans des actes répréhensibles. Elle a envoyé des e-mails polis aux revues qui avaient publié les deux études Case Western. Les éditeurs ont finalement répondu, promettant de se pencher sur ses préoccupations. Puis six mois passèrent sans autre mot. Bik a été bloqué.

En 2012, trois scientifiques avaient créé un site Web appelé PubPeer, où les chercheurs pouvaient discuter des travaux publiés les uns des autres. Les critiques se sont opposées au fait que le site autorisait les commentaires anonymes. Pourtant, PubPeer a été modéré pour interdire les accusations non fondées et, dans plusieurs cas, des dénonciateurs anonymes l'avaient utilisé pour attirer l'attention sur des manipulations d'images ou des erreurs statistiques, provoquant des corrections et des rétractations majeures. Il a semblé à Bik que publier ses découvertes en ligne impliquait de franchir une frontière : la façon traditionnelle de soulever des questions sur l'intégrité d'un article était la communication privée avec les auteurs, les revues ou les universités. Elle a quand même créé un compte anonyme. « Je suis préoccupée par certains chiffres de cet article », a-t-elle écrit, pour chaque étude de Case Western. Elle a téléchargé des captures d'écran des duplications d'images, avec les zones clés clairement délimitées par des cases bleues ou rouges, et a cliqué sur le bouton pour soumettre.

L'édition scientifique est une industrie de plusieurs milliards de dollars. Rien qu'en biomédecine, plus de 1,3 million d'articles sont publiés chaque année dans l'ensemble de la science, il existe plus de douze mille revues réputées. Des milliers d'autres revues Web publient même les manuscrits les plus fragiles après une fausse évaluation par les pairs, en échange de frais de traitement. En Chine, des chercheurs pressés de respecter des quotas de publication irréalistes achètent des articles écrits par des fantômes sur un marché noir. Pendant ce temps, comme le Web a facilité la prolifération des revues, l'avancement professionnel de la science dépend de plus en plus de la publication d'autant d'études que possible.

Il y a environ une décennie, les scientifiques ont commencé à prendre en compte les effets de ce système de publication ou de destruction suralimenté. Quelques cas de fraude pure et simple - y compris l'étude britannique qui a faussement lié les vaccins à l'autisme - ont troublé des disciplines scientifiques spécifiques en psychologie, en recherche sur le cancer et dans d'autres domaines, il a été reconnu qu'une proportion significative d'études avaient fait des affirmations excessives et ne pouvaient pas être répliqué. Des réformes ont été introduites. Des sites Web de surveillance tels que PubPeer et Retraction Watch ont vu le jour, et un certain nombre de détectives indépendants de l'intégrité de la recherche ont commencé à découvrir des cas d'inconduite et à les partager via des blogs, PubPeer et sur Twitter.

En mars 2019, alors qu'elle avait cinquante-trois ans, Bik a décidé de quitter son travail pour faire ce travail de détective à temps plein, en lançant un blog appelé Science Integrity Digest. Au cours des six dernières années et demie, tout en gagnant un peu de revenus en consultant et en parlant, et en recevant un financement participatif, elle a identifié plus de 49 200 articles contenant des duplications d'images suspectes, les documentant dans une feuille de calcul principale. Sur Twitter, plus de cent mille personnes suivent désormais ses exposés.

Bik a grandi avec deux frères et sœurs à Gouda, aux Pays-Bas, où sa mère et son père médecin dirigeaient un cabinet médical dans leur maison en briques rouges, sur un canal bordé d'arbres. À l'âge de huit ans, Bik voulait devenir ornithologue et a passé des heures avec des jumelles, à scruter le jardin à la recherche d'oiseaux et à enregistrer toutes les espèces qu'elle a aperçues. Elle a découvert la science, a obtenu un doctorat. en microbiologie, et a déménagé aux États-Unis juste après le 11 septembre, lorsque son mari, Gerard, un ingénieur en optique, a obtenu un emploi dans la Silicon Valley. Elle a passé quinze ans à étudier le microbiome dans un laboratoire de Stanford avant de passer à l'industrie des biotechnologies.

Lorsque Bik est tombé sur le problème de la duplication d'images pour la première fois, quelques éditeurs de journaux avaient écrit à ce sujet, mais personne n'avait déterminé l'ampleur du problème. She e-mailed two prominent microbiologists, Ferric Fang and Arturo Casadevall, who had studied retractions in science publishing, introducing herself along with image duplications she’d found in Infection et immunité et mBio—journals for which Fang and Casadevall were the editors-in-chief, respectively. The three agreed to a systematic study. Bik would screen papers in forty different journals, and Fang and Casadevall would review her findings.

In 2016, the team published their results in mBio. When journal editors examine questionable images, they typically use Photoshop tools that magnify, invert, stretch, or overlay pictures, but Bik does the same work mostly with her eyes and memory alone. Working at a speed of a few minutes per article, she had screened a jaw-dropping 20,621 studies. The team concluded that she was right ninety per cent of the time the remaining ten per cent of images included some that were too low-resolution to allow for a clear determination. They reported “inappropriate” image duplications in seven hundred and eighty-two, or four per cent, of the papers around a third of the flagged images involved simple copies, which could have been inadvertent errors, but at least half of the cases were sophisticated duplications which had likely been doctored. “Sometimes it seems almost like magic that the brain can do this,” Fang told me, of Bik’s abilities.

The trio estimated that, of the millions of published biomedical studies, tens of thousands ought to be retracted for unreliable or faked images. But adjusting the scientific record can be maddeningly slow, especially when research is lower-profile. In total, it took journal editors more than thirty months to retract the two Case Western papers that Bik had reported. In addition to contacting editors, Bik sometimes reaches out to research institutions, or to the Office of Research Integrity (O.R.I.), a government agency responsible for investigating misconduct in federally funded science. But the O.R.I. and institutions have protocols—they must obtain lab notebooks, conduct interviews, and so on—which take time to unfold.

By 2016, Bik had reported all seven hundred and eighty-two papers in the mBio study to journal editors (including at PLOS Un). As of this June, two hundred and twenty-five had been corrected, twelve had been tagged with “expressions of concern,” and eighty-nine had been retracted. (Among them were five discredited studies by a cancer researcher at Pfizer, who was fired.) As far as Bik knows, fifty-eight per cent of the studies remain at large. In the past five years, she has reported problematic images in another 4,132 studies only around fifteen per cent have been addressed so far. (Three hundred and eighty-two have been retracted.) In only five or ten cases has she been told that authors proved her image concerns to be unfounded, she said.

Frustrated by these long timetables, Bik has transitioned to sharing more of her findings online, where journal readers can encounter them. On PubPeer, where she is the most prolific poster who uses her real name, her comments are circumspect—she writes that images are “remarkably similar” or “more similar than expected.” On Twitter, she is more performative, and often plays to a live audience. “#ImageForensics Middle of the Night edition. Level: easy to advanced,” Bik tweeted, at 2:41 UN M. one night. She posted an array of colorful photographs that resembled abstract paintings, including a striated vista of pink and white brushstrokes (a slice of heart tissue) and a fine-grained splattering of ruby-red and white flecks (a slice of kidney). Six minutes later, a biologist in the U.K. responded: two kidney photos appeared identical, she wrote. A minute later, another user flagged the same pair, along with three lung images that looked like the same tissue sample, shifted slightly. Answers continued trickling in from others they drew Bik-style color-coded boxes around the cloned image parts. At 3:06 UN M., Bik awarded the second user an emoji trophy for the best reply.

In Silicon Valley, Bik and her husband live in an elegant mid-century-modern ranch house with a cheerful, orange front door and a low-angled pitched roof. In the neighborhood, the residence is one of many duplicate copies sporting varying color schemes. I visited Bik just before the pandemic began. Tall, with stylish blue tortoiseshell eyeglasses and shoulder-length chestnut hair, she wore a blouse with a recurring sky-blue-and-orange floral pattern and had a penetrating, blue-eyed gaze. While Bik made tea, her husband, clad in a red fleece jacket, toasted some frozen stroopwafel cookies, from Gouda.

Playing tour guide, Bik showed off the original features of their kitchen, including its white Formica countertop, flecked with gold and black spots. “It’s random!” she assured me—no duplications. The same could not be said of the textured gray porcelain floor tiles. When workers installed them, Bik explained, she’d asked them to rotate the pieces that were identical, so that repeats would be less noticeable. A few duplicate tiles had ended up side-by-side anyway. I couldn’t see the duplication until she traced an identical wavy ridge in each tile with both of her index fingers. “Sorry—I’m, like, weird,” she said, and laughed.

In her bedroom closet, Bik’s shirts hung in a color gradient progressing from blacks and browns to greens and blues. Not long ago, she helped arrange her sister-in-law’s enormous shoe collection by color on new storage racks when some friends complained about the messy boxes of nuts, screws, and nails that littered their garage, Bik sorted them into little drawers. “Nothing makes me more happy,” she told me. Since childhood, she has collected tortoise figurines and toys around two thousand of them are arranged in four glass cabinets next to a blond-wood dining table. She keeps a spreadsheet tracking her turtle menagerie: there are turtles made from cowrie seashells, brass turtles, Delft blue porcelain turtles, bobble-headed turtles, turtle-shaped wood boxes with lids, and “functional” turtles (key chains, pencil sharpeners). She showed me a small stuffed animal with an eye missing: Turtle No. 1. (She has stopped adding to her collection. “I don’t want it to overtake my house,” she said.)

That afternoon, Bik settled at her dining table, which serves as her desk. Floor-to-ceiling windows offered a tranquil view of backyard foliage. On her curved widescreen monitor, Bik checked her Twitter account—her bio featured a photo of a cactus garden “That’s me—prickly,” she said—and then pulled up her master spreadsheet of problematic papers, which she doesn’t share publicly. Each of its thousands of entries has more than twenty columns of details. She removed her glasses, set them next to a cup of chamomile tea, sat up straight, and began rapidly scanning papers from PLOS Un with her face close to the monitor. Starting with the first study—about “leucine zipper transcription factor-like 1”—she peered at an array of Western-blot images. She took screenshots and scrutinized them in Preview, zooming in and adjusting the contrast and brightness. (Occasionally, she uses Forensically and ImageTwin, tools that do some semi-automated photo-forensics analysis.) She moved on to a study with pink and purple cross-sections of mouse-gut tissue, then stopped on a figure with a dozen photos of translucent clumps of cells. She chuckled. “It looks like a flying rabbit,” she said, pointing at one blob.

Bik found no problems. PLOS Un has “cleaned up their act a lot,” she said. The journal’s publisher employs a team of three editors who handle matters of publication ethics, including Bik’s cases. Renee Hoch, one of the editors, told me that the process of investigation, which entails obtaining original, raw images from the authors, and, in some cases, requesting input from external reviewers, usually takes four to six months per case. Hoch said that of the first hundred and ninety or so of Bik’s cases that the team had resolved, forty-six per cent required corrections, around forty-three per cent were retracted, and another nine per cent received “expressions of concern.” In only two of the resolved papers was nothing amiss. “In the vast majority of cases, when she raises an issue and we look into it, we agree with her assessment,” Hoch said.

Could Bik be replaced with a computer? There are arguments for the idea that automated image-scanning could be both faster and more accurate, with fewer false positives and false negatives. Hany Farid, a computer scientist and photo-forensic expert at the University of California, Berkeley, agreed that scientific misconduct is a troubling issue, but was uneasy about individual image detectives using their own judgment to publicly identify suspect images. “One wants to tread fairly lightly” when professional reputations are on the line, he told me. Farid’s reservations spring partly from a general skepticism about the accuracy of the human eye. While our visual systems excel at many tasks, such as recognizing faces, they aren’t always good at other kinds of visual discrimination. Farid sometimes provides court testimony in cases involving doctored images his lab has designed algorithms for detecting faked photographs of everyday scenes, and they are eighty-to-ninety-five-per-cent accurate, with false positives in roughly one in a hundred cases. Judging by courtroom standards, he is unimpressed by Bik’s stats and would prefer a more rigorous assessment of her accuracy. “You can audit the algorithms,” Farid said. “You can’t audit her brain.” He would like to see similar systems designed and validated for identifying faked or altered scientific images.

A few commercial services currently offer specialized software for checking scientific images, but the programs aren’t designed for large-scale, automated use. Ideally, a program would extract images from a scientific paper, then rapidly check them against a huge database, detecting copies or manipulations. Last year, several major scientific publishers, including Elsevier, Springer Nature, and EMBO Press, convened a working group to flesh out how editors might use such systems to pre-screen manuscripts. Efforts are under way—some funded by the O.R.I.—to create powerful machine-learning algorithms to do the job. But it’s harder than one might think. Daniel Acuña, a computer scientist at Syracuse University, told me that such programs need to be trained on and tested against large data sets of published scientific images for which the “ground truth” is known: Doctored or not? A group in Berlin, funded by Elsevier, has been slowly building such a database, using images from retracted papers some algorithm developers have also turned to Bik, who has shared her set of flawed papers with them.

Bik told me that she would welcome effective automated image-scanning systems, because they could find far more cases than she ever could. Still, even if an automated platform could identify problematic images, they would have to be reviewed by people. A computer can’t recognize when research images have been duplicated for appropriate reasons, such as for reference purposes. And, if bad images are already in the published record, someone must hound journal editors or institutions until they take action. Around forty thousand papers have received comments on PubPeer, and, for the vast majority, “there’s absolutely no response,” Boris Barbour, a neuroscientist in Paris who is a volunteer organizer for PubPeer, told me. “Even when somebody is clearly guilty of a career of cheating, it’s quite hard to see any justice done,” he said. “The scales are clearly tilted in the other direction.” Some journals are actively complicit in generating spurious papers a former journal editor I spoke with described working at a highly profitable, low-tier publication that routinely accepted “unbelievably bad” manuscripts, which were riddled with plagiarism and blatantly faked images. Editors asked authors to supply alternative images, then published the studies after heavy editing. “I think what she’s showing is the tip of the iceberg,” the ex-editor said, of Bik.

Some university research-integrity officers point out, with chagrin, that whistle-blowing about research misconduct on social media can tip off the scientists involved, allowing them to destroy evidence ahead of an investigation. But Bik and other watchdogs find that posting to social media creates more pressure for journals and institutions to respond. Some observers worry that the airing of dirty laundry risks undermining public faith in science. Bik believes that most research is trustworthy, and regards her work as a necessary part of science’s self-correcting mechanism universities, she told me, may be loath to investigate faculty members who bring in grant money, and publishers may hesitate to retract bad articles, since every cited paper increases a journal’s citation ranking. (In recent years, some researchers have also sued journals over retractions.) She is appalled at how editors routinely accept weak excuses for image manipulation—it’s like “the dog ate my homework,” she said. Last year, she tweeted about a study in which she’d found more than ten problematic images the researchers supplied substitute images, and the paper received a correction. “Ugh,” she wrote. “It is like finding doping in the urine of an athlete who just won the race, and then accepting a clean urine sample 2 weeks later.”

Last year, Bik’s friend Jon Cousins, a software entrepreneur, made a computer game called Dupesy, inspired by her work. One night, after Thai takeout, we tried a beta version of the game at her computer. Bik’s husband went first, clicking a link titled “Cat Faces.”

A four-by-four panel of feline mugshots filled the screen. Some cats looked bug-eyed, others peeved. Instructions read, “Click the two unexpectedly similar images.” Gerard easily spotted the duplicates in the first few rounds, then hit a more challenging panel and sighed.

“I see it, I see it,” Bik sang quietly.

Finally, Gerard clicked the winning pair. He tried a few more Dupesy puzzle categories: a grid of rock-studded concrete walls, then “Coarse Fur,” “London Map,” and “Tokyo Buildings.”

When my turn came, I started with “Coffee Beans.” On one panel of dark-roasted beans, it took me thirty-one seconds to find the matching pair on the next, six seconds. A few panels later, I was stuck. My eyes felt crossed. A nearby clock ticked loudly.

“Should I say when I see it?” Bik asked. “Or is that annoying?”

“Just tell me when it’s annoying, because I don’t always know,” she said.

"Absolument. You’re annoying,” he replied.

On her turn, Bik cruised swiftly through several rounds of “Coarse Fur,” then checked out other puzzle links. Some panels were “much harder than my normal work,” she said. The next day, Cousins e-mailed us with results: Bik’s median time for solving the puzzles was twelve seconds, versus about twenty seconds for her husband and me.


Biology: Year 10 Mocks

- It provides medical benefits in the fields of therapeutic cloning and regenerative medicine.
- It provides great potential for discovering treatments and cures to a variety of diseases including Parkinson's disease, schizophrenia, Alzheimer's disease, cancer, spinal cord injuries, diabetes and many more.
- Limbs and organs could be grown in a lab from stem cells and then used in transplants or to help treat illnesses.
- It will help scientists to learn about human growth and cell development.
- Scientists and doctors will be able to test millions of potential drugs and medicine, without the use of animals or human testers. This necessitates a process of simulating the effect the drug has on a specific population of cells. This would tell if the drug is useful or has any problems.
- Stem cell research also benefits the study of development stages that cannot be studied directly in a human embryo, which sometimes are linked with major clinical consequences such as birth defects, pregnancy-loss and infertility. A more comprehensive understanding of normal development will ultimately allow the prevention or treatment of abnormal human development.
- Stem cell research also benefits the study of development stages that cannot be studied directly in a human embryo, which sometimes are linked with major clinical consequences such as birth defects, pregnancy-loss and infertility. A more comprehensive understanding of normal development will ultimately allow the prevention or treatment of abnormal human development.
- An advantage of the usage of adult stem cells to treat disease is that a patient's own cells could be used to treat a patient. Risks would be quite reduced because patients' bodies would not reject their own cells.
- Embryonic stem cells can develop into any cell types of the body, and may then be more versatile than adult stem cells.

- The use of embryonic stem cells for research involves the destruction of blastocysts formed from laboratory-fertilized human eggs. For those people who believe that life begins at conception, the blastocyst is a human life and to destroy it is immoral and unacceptable.
- Like any other new technology, it is also completely unknown what the long-term effects of such an interference with nature could materialize.
- Embryonic stem cells may not be the solution for all ailments.
- According to a new research, stem cell therapy was used on heart disease patients. It was found that it can make their coronary arteries narrower.
- A disadvantage of most adult stem cells is that they are pre-specialized, for instance, blood stem cells make only blood, and brain stem cells make only brain cells.
- These are derived from embryos that are not a patient's own and the patient's body may reject them.

Plasma is the main component of blood and consists mostly of water, with proteins, ions, nutrients, and wastes mixed in.

Red blood cells are responsible for carrying oxygen and carbon dioxide.

Platelets are responsible for blood clotting.

White blood cells are part of the immune system and function in immune response.

Oesophagus (pushed down by peristalsis)

Stomach (churned + mixed with protease and
↓ hydrochloric acid)

Duodenum (continues digestions with proteases,
↓ lipases and carbohydrases)

Ileum (also continues from duodenum, has villi
↓ to allow rapid diffusion)


Voir la vidéo: Plane Crash From Inside. 360-degree VR. 4K. 125 fps (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Meztishicage

    Oui dommage

  2. Devereaux

    la question remarquable

  3. Sharan

    Et que faisons-nous sans vos bonnes idées

  4. Nem

    Cette pensée admirable doit être délibérément

  5. Shawe

    C'est une honte!

  6. Kilabar

    En elle quelque chose est. Merci pour l'information. Je ne le savais pas.



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