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Pourquoi le milieu SOC est-il recommandé pour les transformations ?

Pourquoi le milieu SOC est-il recommandé pour les transformations ?


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Dans à peu près tous les protocoles de transformation que j'ai vus, le milieu SOC est utilisé pour faire croître les bactéries pendant une courte période après la transformation et avant le placage.

J'ai généralement substitué le support LB à cette étape pour des retransformations faciles, mais je suppose que le support SOC est censé faire une différence d'efficacité, sinon le support LB plus simple serait recommandé dans les protocoles.

Pourquoi le support SOC est-il utilisé pour les transformations ? Quelle différence la substitution par le milieu LB provoque-t-elle pour l'efficacité de la transformation ?


Pour résumer à partir de l'article de Hanahan (voir ci-dessous pour référence), il a effectué une revue systématique des conditions nécessaires pour améliorer l'efficacité de la transfection. Parmi les conditions testées figuraient la présence de divers cations (Ca2+, Cs+, Mn2+, K+, mg2+), le DMSO et les températures de croissance (et quelques autres conditions moins couramment utilisées de nos jours). Il a travaillé avec une souche dont il a par la suite isolé un dérivé, appelé DH1, qui est maintenant disponible dans le commerce sous le nom de DH1-alpha et d'autres dérivés de souche.

Il a défini l'efficacité de transformation comme étant le nombre de colonies transformées sur une plaque, une mesure encore utilisée aujourd'hui. Il a trouvé quand le milieu de transformation contenait : certains cations, spécifiquement Mn2+, Californie2+, Rb+; ainsi que le DTT, l'hexamine cobalt (III) et le DMSO ; grandement amélioré l'efficacité de la transfection par rapport au Ca standard2+ traitement. Il a également constaté que le saccharose et K+ étaient utiles, mais pas strictement nécessaires pour sa souche expérimentale. Il a été indiqué dans cet article, bien que non expliqué, que le saccharose a agi comme un stabilisant, peut-être pour se prémunir contre son utilisation initiale d'une incubation à 0°C et/ou d'un cycle de congélation/décongélation. Pour le reste de son travail, il n'a pas utilisé de saccharose.

Parmi ses conclusions, il affirme que le DTT est nécessaire, ainsi que les cations divalents et monovalents, mais qu'ils semblent être non spécifiques. En d'autres termes, il n'y a pas d'exigence stricte pour avoir Ca2+, puisque Mg2+ et Mn2+ fonctionnent aussi bien, et il n'y a pas non plus d'exigence pour K+, bien qu'il soit certes plus facile à utiliser que Rb+.

Il existe aujourd'hui un certain nombre de bouillons "riches" médias qui sont disponibles : SOB, SOC (SOB + MgCl2 et saccharose), 2xYT, NZY+, TB, etc. Tous sont supérieurs à LB à des fins de transformation en raison de l'équilibre salin raffiné et en particulier de l'inclusion de ces cations divalents et monovalents. Le saccharose semble être inclus pour la facilité du métabolisme et la stabilité du processus de choc thermique (bien que je ne trouve pas d'article expliquant explicitement pourquoi il est utilisé, autre que la tradition).

Les deux façons les plus courantes de transformer les bactéries sont de les avoir chimiquement compétentes (E. coli déjà dans un bouillon riche en milieu) ou de les transformer électriquement (électroporation). Le but des deux est d'induire des trous dans la membrane cellulaire d'E. coli (la transformation chimique repose sur le processus de choc thermique pour cela). Une fois ces trous réalisés, l'ADN est libre d'entrer dans la bactérie. Naturellement, ce processus est très traumatisant pour E. coli, d'autant plus que la transformation chimique s'accompagne en plus du choc thermique (0°C à 42°C puis redescend à 0°C).

La substitution de LB à tout bouillon riche, tel que SOC, améliorera considérablement le rendement de transformation. Si un protocole requiert un média SOC et que vous n'en avez pas, vous pouvez le remplacer par un autre média riche. J'ai utilisé 2xYT pour le SOC plusieurs fois avec succès, et comme je l'ai dit plus tôt, seul le nombre de valence des différents ions semble avoir de l'importance, alors assurez-vous simplement qu'ils sont présents.

J'avais cru comprendre que le saccharose/glucose avait été ajouté comme source de nutriments supplémentaire pour E. coli afin d'accélérer leur récupération après le protocole de transformation. Je suppose que c'est le cas. Hanahan fait référence au saccharose comme stabilisant mais ne définit pas ce qu'il stabilise. Je suppose qu'il agit comme une aide à la cryoconservation et empêche la formation de cristaux de glace lors du refroidissement sur glace dans la méthode du choc thermique. Compte tenu de la question précédente de bio.SE sur le déplacement des matières premières d'E. coli, il semble peu probable que le saccharose soit utilisé comme source de nutriments au cours de la période de croissance d'une heure immédiatement après la transformation, car cet article cite 4 à 12 heures comme plage de temps commune pour le déplacement. métabolisme des acides aminés aux glucides.

Sources:


(Super Optimal bouillon avec catabolite Répression) Les milieux SOC contiennent du glucose alors que Bouillon Luria (LB) non. SOB a également un équilibre salin plus délicat.

Naturellement, le glucose aidera les cellules à récupérer et à croître plus rapidement après le choc thermique. Votre efficacité de transformation devrait s'améliorer car moins de cellules mourront.

D'un autre côté, la raison pour laquelle les médias SOC ne sont pas toujours utilisés est due aux effets néfastes d'une trop grande quantité de glucose. Le glucose sera consommé dans le cycle de Krebs et produira beaucoup d'acétate qui peut être assez agressif pour les cellules.


Bouillon SOC ( MB28001 )

La description: Le bouillon SOC est un mélange de SOB et de glucose. Recommandé pour une utilisation dans l'étape de récupération de Escherichia coli transformations cellulaires compétentes. Le bouillon SOC est un milieu riche en nutriments pour la préparation et la transformation de cellules compétentes.
La transformation nécessite une perforation de la bactérie pour permettre l'introduction d'ADN étranger à l'intérieur de la cellule. Pour survivre à ce processus, les cellules compétentes ont besoin d'un milieu riche en isotonique. La peptone fournit de l'azote, des vitamines, des minéraux et des acides aminés essentiels à la croissance.
L'extrait de levure est une source de vitamines, en particulier du groupe B. Le chlorure de sodium et le chlorure de potassium fournissent des électrolytes essentiels pour le transport et l'équilibre osmotique. Le sulfate de magnésium est une source d'ions magnésium. Le glucose est utilisé comme source de carbone et d'énergie qui E. coli utilise pour réparer la perforation ainsi que pour la réplication.

Mode d'emploi: Dissoudre 30,2 g du milieu dans un litre d'eau distillée. Bien mélanger et dissoudre en chauffant avec agitation fréquente. Faire bouillir pendant une minute jusqu'à dissolution complète. Distribuer dans des récipients appropriés et stériliser en autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. Le milieu préparé doit être conservé entre 2 et 8 °C. La couleur du milieu préparé est ambrée, légèrement opalescente. Le milieu déshydraté doit être homogène, fluide et de couleur beige.

Composition:
– Tryptone : 20 g/L
– Extrait de levure : 5 g/L
– Glycémie : 3,6 g/L
– Chlorure de potassium : 0,186 g/L
– Chlorure de sodium : 0,5 g/L
– Chlorure de magnésium : 0,96 g/L
– pH final 7,0 ± 0,2 à 25 ºC

Test microbien : Les résultats suivants ont été obtenus dans les performances du milieu à partir de cultures types après incubation à une température de 35 ± 2 °C et observés après 18-24 heures :

Croissance des micro-organismes
Escherichia coli ATCC 23724 Bon
Escherichia coli ATCC 53868 Bon
Escherichia coli ATCC 33694 Bon
Escherichia coli ATCC 33849 Bon

Soluble dans : l'eau

Espace de rangement: Ranger à température ambiante. Une fois ouvert, gardez le milieu en poudre fermé pour éviter l'hydratation.


Transformation

Nos rédacteurs examineront ce que vous avez soumis et détermineront s'il faut réviser l'article.

Transformation, en biologie, l'un des nombreux processus par lesquels le matériel génétique sous forme d'acide désoxyribonucléique (ADN) « nu » est transféré entre les cellules microbiennes. Sa découverte et son élucidation constituent l'une des pierres angulaires importantes de la génétique moléculaire. Le terme fait également référence à la modification d'une cellule animale envahie par un virus inducteur de tumeurs.

L'étude de la transformation remonte à la fin des années 1920, lorsqu'un médecin anglais, F. Griffith, a découvert que les cellules pneumococciques ( Streptococcus pneumoniae) pourrait passer d'une forme inoffensive à une forme pathogène. Il a remarqué que les pneumocoques peuvent ou non avoir une enveloppe capsulaire. Ces cellules avec une capsule (formant des colonies lisses) ont causé une maladie chez les souris, celles sans capsule (et formant des colonies à surface rugueuse) étaient inoffensives. Un mélange de cellules vivantes non encapsulées et de cellules encapsulées tuées par la chaleur, lorsqu'il était inoculé à des souris, provoquait la maladie. Des cellules vivantes encapsulées (pathogènes) ont été créées par un « principe transformateur » libéré des cellules mortes vers les cellules vivantes. La transformation était héréditaire. En 1943, un groupe d'enquêteurs du Rockefeller Institute, à New York, identifia ce « principe transformateur » comme étant l'ADN.


Pourquoi le milieu SOC est-il recommandé pour les transformations ? - La biologie

Il existe deux méthodes pour transformer E. coli cellules avec ADN plasmidique - transformation chimique et électroporation. Pour la transformation chimique, les cellules sont cultivées jusqu'à la phase mi-log, récoltées et traitées avec des cations divalents tels que CaCl2. Les cellules ainsi traitées sont dites compétentes. Pour transformer chimiquement les cellules, les cellules compétentes sont mélangées à l'ADN, sur de la glace, suivie d'un bref choc thermique. Ensuite, les cellules sont incubées avec un milieu riche et laissées exprimer le gène de résistance aux antibiotiques pendant 30 à 60 minutes avant l'étalement. Pour l'électroporation, les cellules sont également cultivées jusqu'à la phase mi-log mais sont ensuite lavées abondamment avec de l'eau pour éliminer tous les sels. Habituellement, du glycérol est ajouté à l'eau à une concentration finale de 10 % afin que les cellules puissent être conservées congelées et conservées pour de futures expériences. Pour électroporer l'ADN dans les cellules, lavées E. coli sont mélangés à l'ADN à transformer puis pipetés dans une cuvette en plastique contenant des électrodes. Une courte impulsion électrique, d'environ 2400 volts/cm, est appliquée aux cellules provoquant de petits trous dans la membrane à travers lesquels l'ADN pénètre. Les cellules sont ensuite incubées avec du bouillon comme ci-dessus avant l'étalement.

Pour la transformation chimique, il n'est pas nécessaire de pré-traiter l'ADN. Pour l'électroporation, l'ADN doit être exempt de tout sel, de sorte que les ligatures sont d'abord précipitées avec de l'alcool avant d'être utilisées.

Conception expérimentale :

Pour déterminer l'efficacité de la transformation, une transformation de contrôle positif doit être effectuée en utilisant 1 ng d'ADN plasmidique non coupé, par ex. pUC19. L'efficacité de la transformation est calculée comme le nombre de transformants/g d'ADN d'entrée. Un contrôle négatif doit également être inclus qui contient des cellules sans ADN ajouté.

Un contrôle négatif avec des cellules uniquement (pas d'ADN ajouté) doit également être inclus.

Pour la plupart des applications de clonage, nous utilisons des cellules hôtes DH5&alpha. Ces cellules sont compatibles avec lacZ les procédures de sélection bleu/blanc sont facilement transformées et un ADN plasmidique de bonne qualité peut être récupéré à partir des transformants. Une exception notable est lors de la transformation avec des constructions plasmidiques contenant des gènes recombinants sous le contrôle de la polymérase T7. Ces constructions sont typiquement transformées en DH5&alpha pour la phase de clonage, mais doivent être transformées en une souche bactérienne différente, BL21(DE3) pour l'expression de la protéine recombinante (les souches BL21 portent le gène d'expression de la polymérase T7).

Électroporation de E. coli:

  • Flacons centrifuges stériles & ndash 250 ml pour rotor GSA
  • SOB moyen
  • E. coli souche hôte telle que DH5&alpha
  • WB (10 % de glycérol redistillé, 90 % d'eau distillée, v/v) réfrigéré à 4°C&ndash a besoin de 500 ml de WB pour chaque 250 ml de culture
  • ARNt (5-10 µg/ml &ndash utilisé comme vecteur de masse pour augmenter l'efficacité de la précipitation)
  • Acétate d'ammonium 5 M
  • 100% éthanol
  • 70% d'éthanol
  • 0,5X TE ou EB (Tris 10 mM, pH 8,3)
  • Milieu SOC
  • plaques de transformation

I. Préparation de E. coli cellules pour l'électroporation.

1. Utiliser une nouvelle colonie de DH5&alpha (ou une autre souche hôte appropriée) pour ensemencer 5 ml de milieu SOB (sans magnésium) dans un tube conique stérile de 50 ml. Cultivez les cellules avec une aération vigoureuse pendant la nuit à 37°C.

2. Diluer 2,5 ml de cellules dans 250 ml de SOB (sans magnésium) dans un flacon de 1 litre. Cultiver pendant 2 à 3 heures avec une aération vigoureuse à 37°C jusqu'à ce que les cellules atteignent une DO550 = 0.8.

3. Récolter les cellules par centrifugation à 5000 tr/min dans un rotor GSA pendant 10 min dans des flacons à centrifuger stériles. (Assurez-vous d'utiliser des bouteilles autoclavées !).

4. Laver le culot cellulaire dans 250 ml de WB glacé comme suit. Tout d'abord, ajoutez une petite quantité de WB au culot cellulaire, pipetez de haut en bas ou vortexez doucement jusqu'à ce que les cellules soient remises en suspension. Ensuite, remplissez le flacon à centrifuger de WB glacé et mélangez doucement. REMARQUE - le volume absolu de WB ajouté à ce stade n'est pas important.

5. Centrifuger la suspension cellulaire à 5 000 tr/min pendant 15 min et retirer soigneusement le surnageant dès que le rotor s'arrête. Les cellules lavées dans WB ne culottent pas bien. Si le surnageant est trouble, augmentez le temps de centrifugation.

6. Laver le culot cellulaire une deuxième fois en le remettant en suspension dans 250 ml de WB glacé stérile en utilisant la même technique que celle décrite ci-dessus. Centrifuger la suspension cellulaire à 5000 tr/min pendant 15 min.

7. Versez doucement le surnageant en laissant une petite quantité de WB au fond de la bouteille. Remettre en suspension le culot cellulaire dans le WB - aucun WB supplémentaire ne doit être ajouté &ndash et le volume final doit être d'environ 1 ml. Les cellules peuvent être utilisées immédiatement ou peuvent être congelées en aliquotes de 0,2 ml dans des flacons de congélation à l'aide d'un bain de glace sèche et d'éthanol. Conserver les cellules congelées à -70°C.

II. Préparation de l'ADN pour l'électroporation

L'ADN pour l'électroporation doit avoir une force ionique très faible et une résistance élevée. L'ADN peut être purifié par dilution, précipitation ou dialyse.

  • Pour la transformation de l'ADN plasmidique purifié, diluer l'ADN dans 10 mM Tris pH 8-8,3 à environ 1-50 ng/µl (ne pas utiliser TE). Utiliser 1 µl pour la transformation.
  • Pour les réactions de ligature, utilisez la procédure suivante.

Purification de l'ADN par précipitation :

1. Ajouter 5 à 10 µg d'ARNt à une réaction de ligation de 20 µ dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 22 &mul 5M d'acétate d'ammonium (ou un volume égal de réaction de ligature avec l'ARNt ajouté). Bien mélanger.

2. Ajouter 100 &mul d'éthanol absolu (ou 2,5 volumes de réaction de ligature, ARNt et sel). Glace 15 min.

3. Centrifuger à >12 000 x g pendant 15 min à 4°C. Décanter soigneusement le surnageant.

4. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 70 %. Centrifuger à >12 000 x g pendant 15 min à température ambiante. Retirez le surnageant.

5. Séchez le pellet à l'air (speed vac ok mais ne pas trop sécher).

6. Remettre en suspension l'ADN dans du tampon EB (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3) ou du tampon TE 0,5X [Tris-HCl 5 mM, EDTA 0,5 mM (pH 7,5)] à une concentration de 10 ng/ul d'ADN. Pour les réactions de ligature, il est pratique de remettre en suspension dans 10 µl. Utiliser 1 &mul par transformation de 20 &mul de suspension cellulaire.

III. Électroporation.

1. Marquez le nombre requis de microtubes à centrifuger. Placer le nombre requis de chambres de micro-électroporation sur de la glace. Remplissez le compartiment de contrôle de la température du Chamber Safe avec

250 ml de suspension d'eau glacée et placez le rack de la chambre dans le coffre-fort de la chambre.

2. Décongeler une aliquote de cellules préparées comme dans la section I et aliquoter 20 µl de cellules au nombre requis de tubes à centrifuger sur de la glace. Ajouter 1 µ l de l'ADN (ou de la réaction de ligature) préparé comme dans la section II.

3. À l'aide d'une micro pipette, pipeter 20 µ l du mélange cellule-ADN entre les bosses dans une chambre de micro-électroporation. Ne laissez pas de bulle d'air dans la gouttelette des cellules, la pression d'une bulle peut provoquer un arc électrique et une perte de l'échantillon. Placez la chambre dans une fente du support de chambre et notez sa position. Répétez le processus si plus d'un échantillon doit être pulsé. Jusqu'à 4 échantillons peuvent être placés dans le Chamber Rack en même temps. Manipulez les chambres avec précaution pour éviter de déplacer accidentellement l'échantillon entre les bossages.

4. Fermez le couvercle du coffre-fort de la chambre et fixez-le avec le loquet de tirage.

5. Branchez le câble d'impulsion sur le côté droit du coffre-fort Chamber.

6. Tournez le bouton de sélection de chambre sur le dessus du coffre-fort de chambre pour diriger l'impulsion électrique vers la chambre de micro-électroporation souhaitée.

7. Réglez la résistance de l'amplificateur de tension sur 4 k&Omega, réglez l'unité de contrôle d'impulsion sur LOW et 330 µ F vérifiez les connexions.

8. Chargez l'unité de contrôle d'impulsion en réglant le commutateur CHARGE ARM de l'unité de contrôle d'impulsion sur CHARGE, puis en appuyant sur le bouton de contrôle de tension UP jusqu'à ce que la lecture de tension soit de 5 à 10 volts supérieure à la tension de décharge souhaitée. Pour E. coli, les conditions standard sont de 2,4 kv, ce qui signifie que l'unité Pulse Control doit être réglée sur 405 volts (400 volts est la tension de décharge souhaitée + 5). L'amplificateur de tension amplifie les volts en

6 fois de telle sorte que la tension de décharge totale soit de 2400 volts, soit 2,4 kv. La tension de crête réelle délivrée à l'échantillon sera affichée sur le compteur Voltage Booster après le pouls est délivré.

9. Réglez le commutateur CHARGE/ARM sur la position ARM. Le voyant vert indique que l'unité est prête à délivrer une impulsion CC. Appuyez sur le bouton TRIGGER de décharge par impulsion et maintenez-le enfoncé pendant 1 seconde.

REMARQUE : L'affichage de la tension CC sur l'unité de contrôle d'impulsion doit indiquer <10 volts après qu'une impulsion a été délivrée. Sinon, déchargez le condensateur à l'aide du bouton DOWN.

10. Pour des échantillons supplémentaires, tournez le bouton de sélection de la chambre sur la prochaine position souhaitée et répétez les étapes 8 et 9 jusqu'à ce que tous les échantillons soient pulsés.

11. Pour la sélection d'ampicilline, inoculer les échantillons dans 2 ml de milieu SOC et agiter pendant 30 minutes (pour amp), 60 minutes (pour Kan) pour permettre l'expression du gène antibiotique. Plaquer les cellules sur du milieu LB avec un antibiotique ou un réactif de dépistage approprié (par exemple 100 µg/ml d'ampicilline, et/ou 40 &mul de 20 mg/ml de X-Gal, XP et 40 &mul de 100 mM d'IPTG).

Cette page Web est maintenue par Julie B. Wolf, UMBC
Dernière mise à jour le 3/2/2010

est conçu pour les étudiants intéressés par des carrières dans les sciences industrielles et biomédicales.


Milieu d'excroissance SOC

Ajouter du SOC au fraîchement transformé E. coli cellules et incuber jusqu'à 1 heure avant d'étaler sur des milieux sélectifs.

Pour NEB 10-beta et NEB Stable Compétent E. coli, veuillez utiliser NEB 10-beta/Stable Outgrowth Medium (NEB # B9035).

Ajouter du SOC au fraîchement transformé E. coli cellules et incuber jusqu'à 1 heure avant d'étaler sur des milieux sélectifs.

Milieu d'excroissance 1X SOC :
2% de peptone végétale
0,5% d'extrait de levure
10 mM de NaCl
2,5 mM de KCl
10 mM de MgCl2
10 mM de MgSO4
Glucose 20 mM

Réactifs fournis

Les réactifs suivants sont fournis avec ce produit :

  • B9020Fiche technique-Lot2191203
  • B9020Fiche technique-Lot2421206
  • B9020Fiche technique-Lot2471210
  • B9020Fiche technique-Lot2581212
  • B9020Datasheet-Lot2801309
  • B9020Fiche technique-Lot2891312
  • B9020Fiche technique-Lot3071404
  • B9020Fiche technique-Lot3141406
  • B9020Fiche technique-Lot3201407
  • B9020Datasheet-Lot3281409
  • B9020Fiche technique-Lot3331411
  • B9020Fiche technique-Lot3381412
  • B9020Fiche technique-Lot3511502
  • B9020Datasheet-Lot3611503
  • B9020Fiche technique-Lot3671504
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  • B9020Fiche technique-Lot4131511
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Outil de citation de produit

Caractéristiques

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Pimpez vos médias et économisez de l'argent !

Mais en ajoutant quelques ingrédients supplémentaires ou en étant plus économique sur d'autres (en particulier l'extrait de levure et le tryptone), vous pourriez obtenir un rendement plasmidique plus élevé, plus rapidement et avec moins d'argent.

Pour contrer les opposants, personne ne veut fabriquer des supports très complexes avec 15 ingrédients nécessitant une stérilisation par filtre, car cela va évidemment à l'encontre de l'objectif d'économie de temps et de budget. En effet, il existe des compromis entre l'optimisation de la biomasse, le rendement en plasmides, la qualité, la stabilité et le coût avec la différence entre la production de protéines et la production de plasmides, car la production de plasmides ne nécessite que la croissance cellulaire, la division et la stabilité des plasmides.

La bonne nouvelle est que Michael Danquah et Gareth Forde de l'université de Monash ont conçu un milieu optimisé sur le plan stoechiométrique pour la production de plasmides. Le PDM, soi-disant donne dans les conditions qu'ils ont testées, deux fois la quantité de plasmide dans les rendements volumétriques et spécifiques par rapport à la TB, et LB est laissé dans la poussière. Mieux encore, parce qu'il utilise moins de tryptone et d'extrait de levure, le coût par mg d'ADN est d'environ un quart du coût du LB.

Les recettes pour LB, TB, SOC et PDM sont présentées ci-dessous. Si vous décidez de rompre avec la tradition et d'essayer le PDM, assurez-vous de nous dire comment cela se passe.

Publié à l'origine le 28 avril 2008, mis à jour et republié le 19 décembre 2014.


Aide à la contamination moyenne SOC - (20 décembre 2007 )

Comment le milieu SOC peut-il être contaminé ? Comment stockez-vous habituellement le support SOC ??

Je viens de découvrir que mon milieu SOC a été contaminé!! Je n'ai jamais vu cela auparavant - je garde généralement le milieu SOC à température ambiante, je travaille près du feu, je stérilise le récipient chaque fois que je l'utilise

Comment le milieu SOC peut-il être contaminé ? Comment stockez-vous habituellement le support SOC ??

Nous préparons 500 ml et avons ensuite des aliquotes de 50 ml. Nous prenons soin de l'ouvrir très brièvement et bien entendu les techniques stériles habituelles. Parfois, un peu moins de concentration en aliquotant le SOC, peut conduire à une contamination.

N'entrez jamais dans des flacons stériles, mais versez-les plutôt. Peut-être que cela aide.

c'est le glucose. il est également utile de conserver un stock séparé de glucose FS et de l'ajouter à l'aliquote que vous utiliserez ce jour-là, juste avant de préparer vos tubes.

Je divise mes médias en petites aliquotes et les conserve à -20c et les décongèle avant utilisation.

Le milieu SOC est un milieu de croissance bactérien utilisé pour maximiser l'efficacité de transformation des cellules, il est donc sujet à la contamination bactérienne (c'est le glucose - les petits l'adorent).


Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Zeliang Chen (Université agricole de Shenyang) pour son généreux don de B. melitensis souche 16 M. Nous remercions également le Dr Jeremy Allen (Liwen Bianji, Edanz Group China) pour la révision critique du texte anglais de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Key Research and Development Program (2016YFD0500105), la Natural Science Foundation of China (31470259 et 31770191), le Technique Innovation Program of Hubei Province (2016ABA124) et le Fundamental Research Funds for the Central Universities (2016PY052) à ZF.L.


Milieu S.O.C, Corning®

Avantor ®, une société Fortune 500, est l'un des principaux fournisseurs mondiaux de produits et services essentiels aux clients des secteurs de la biopharmacie, de la santé, de l'éducation et du gouvernement, des technologies de pointe et des matériaux appliqués. Notre portefeuille est utilisé dans pratiquement toutes les étapes des activités de recherche, de développement et de production les plus importantes dans les industries que nous servons. L'une de nos plus grandes forces réside dans le fait d'avoir une infrastructure mondiale stratégiquement située pour répondre aux besoins de nos clients. Notre présence mondiale nous permet de desservir plus de 225 000 sites clients et nous donne un accès étendu aux laboratoires de recherche et aux scientifiques dans plus de 180 pays. Nous mettons la science en mouvement pour créer un monde meilleur. Pour plus d'informations, visitez www.avantorsciences.com et retrouvez-nous sur LinkedIn, Twitter et Facebook.

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Effectuez les étapes 1&ndash7 dans le tube fourni.

  1. (Pour C2527H) Décongeler un tube de BL21(DE3) Compétent E. coli cellules sur glace pendant 10 minutes.
    (Pour C2527I) Décongeler un tube de BL21(DE3) Compétent E. coli cellules sur la glace jusqu'à ce que les derniers cristaux de glace disparaissent. Mélanger doucement et soigneusement pipeter 50 µl de cellules dans un tube de transformation sur glace.
  2. Ajouter 1&ndash5 µl contenant 1 pg&ndash100 ng d'ADN plasmidique au mélange cellulaire. Effleurez soigneusement le tube 4&ndash5 fois pour mélanger les cellules et l'ADN. Ne pas vortexer.
  3. Placer le mélange sur de la glace pendant 30 minutes. Ne pas mélanger.
  4. Choc thermique à exactement 42°C pendant exactement 10 secondes. Ne pas mélanger.
  5. Placer sur la glace pendant 5 minutes. Ne pas mélanger.
  6. Pipeter 950 µl de SOC à température ambiante dans le mélange.
  7. Placer à 37°C pendant 60 minutes. Agiter vigoureusement (250 tr/min) ou tourner.
  8. Plaques de sélection chaudes à 37°C.
  9. Mélangez soigneusement les cellules en effleurant le tube et en inversant, puis effectuez plusieurs dilutions en série 10 fois dans SOC.
  10. Étaler 50&ndash100 µl de chaque dilution sur une plaque de sélection et incuber une nuit à 37°C. Alternativement, incuber à 30°C pendant 24&ndash36 heures ou à 25°C pendant 48 heures.

Incubation d'ADN avec des cellules sur glace : Pour une efficacité de transformation maximale, les cellules et l'ADN doivent être incubés ensemble sur de la glace pendant 30 minutes. Attendez-vous à une perte d'efficacité de transformation multipliée par 2 toutes les 10 minutes de raccourcissement de cette étape.

Choc thermique: La température et le moment de l'étape de choc thermique sont importants et spécifiques au volume de transformation et au récipient. En utilisant le tube de transformation fourni, 10 secondes à 42°C sont optimales.

Excroissance: L'excroissance à 37°C pendant 1 heure est la meilleure pour la récupération cellulaire et pour l'expression de la résistance aux antibiotiques. Attendez-vous à une perte d'efficacité de transformation multipliée par 2 toutes les 15 minutes où vous raccourcissez cette étape. Le SOC donne une efficacité de transformation 2 fois plus élevée que le milieu LB et l'incubation avec agitation ou rotation du tube donne une efficacité de transformation 2 fois plus élevée que l'incubation sans agitation.

Placage: Les plaques de sélection peuvent être utilisées chaudes ou froides, humides ou sèches sans affecter de manière significative l'efficacité de la transformation. Cependant, les plaques chaudes et sèches sont plus faciles à étaler et permettent la formation de colonies la plus rapide.


Voir la vidéo: Sentinel SaaS SOC (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Vudoll

    Le point de vue faisant autorité, cognitivement.

  2. Wolfrik

    Qui te l'a dit?

  3. Cedric

    Je ne comprends absolument pas, qu'est-ce que tu veux dire?

  4. Sherman

    Joyeux Noël, félicitations

  5. Wissian

    Oui, tu as dit correctement

  6. Jordain

    C'est dommage, mais il faut parfois changer de mode de vie. Et écrivez des messages aussi compétents.



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