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2.1 : Bien utiliser les micropipettes - Biologie

2.1 : Bien utiliser les micropipettes - Biologie


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On peut soutenir que l'équipement scientifique le plus important que vous utiliserez dans cette classe sont des micropipettes réglables, que vous utiliserez dans presque toutes les expériences. Les micropipettes sont des instruments de précision conçus pour avec précision et précisément volumes de transfert de l'ordre du microlitre. Rappelez-vous les relations entre les unités de volume :

Exactitude et précision

La précision dépend de la micropipette délivrant le volume correct. Résultats précis
sont reproductibles. Utilisons une analogie cible pour démontrer la différence entre des résultats exacts et précis. Imaginez que quatre élèves essaient de frapper cinq fois dans le mille. Les élèves A et B sont précis, tandis que les élèves A et C sont précis.

Les fabricants déterminent l'exactitude et la précision des micropipettes en les utilisant pour transférer des volumes définis d'eau distillée dans une goutte qui est ensuite pesée sur une balance analytique. La densité de l'eau est de 1,0 gramme par ml à 25 °C. Le processus est répété plusieurs fois au cours du processus d'étalonnage, et les données sont utilisées pour calculer l'exactitude et la précision d'une micropipette.

La précision fait référence à la performance de la micropipette par rapport à une valeur standard (la valeur prévue). La précision est calculée à partir de la différence entre le volume réel distribué par la micropipette et le volume prévu. Notez que cela peut être négatif ou positif
valeur. Lorsque les micropipettes sont calibrées, la précision est normalement exprimée en pourcentage de
la valeur sélectionnée. Les micropipettes sont conçues pour fonctionner avec une précision de quelques pour cent (généralement <3 %) de la valeur prévue. La précision d'une micropipette diminue quelque peu lorsque les micropipettes sont réglées pour délivrer des volumes proches des valeurs les plus basses de leur gamme.

La précision fournit des informations sur la reproductibilité, sans aucune référence à une norme. La précision reflète des erreurs aléatoires qui ne peuvent jamais être entièrement éliminées d'une procédure. Ainsi, une série de mesures répétées devrait générer une distribution normale ou binomiale (ci-contre). La précision est exprimée par l'écart-type (s) de l'ensemble de mesures. Dans une distribution normale, environ 2/3 des mesures se situeront à moins d'un écart type de la moyenne ou de la moyenne (x), et 95 % des mesures se situeront à moins de deux écarts types de la moyenne. L'écart type pour un ensemble de m mesures sont calculées à l'aide de la formule ci-dessous.

Choisir la micropipette

L'écart type décrit la distribution des mesures par rapport à la valeur moyenne

Nous utilisons trois tailles différentes de micropipettes au laboratoire, les P20, P200 et P1000. Nos micropipettes ont été achetées auprès de plusieurs fabricants différents, mais les principes de fonctionnement sont les mêmes. Les chiffres après le « P » se réfèrent au nombre maximum de microlitres que la micropipette est conçue pour transférer. Notez qu'il y a un certain chevauchement dans les gammes des différentes micropipettes. Par exemple, le P200 et le P20 peuvent être utilisés pour transférer 15 l, mais le P20 est plus précis dans cette plage. En règle générale, sélectionnez toujours la pipette de plus petit volume qui transférera le volume.

Spécification du volume de transfert

Il y a trois chiffres sur l'indicateur de volume. Avec chacune des micropipettes, vous spécifierez un volume à trois chiffres en tournant le bouton de réglage du volume. Vous pourrez également extrapoler entre les chiffres les plus bas grâce aux repères du vernier sur le cadran inférieur. La plupart des mesures que vous ferez avec les micropipettes seront précises à quatre chiffres significatifs !

avertir

JAMAIS tournez le cadran indicateur au-delà des limites de volume supérieure ou inférieure de la micropipette ! Cela pourrait endommager le piston.

​​​​Transférer des volumes avec précision

Les micropipettes fonctionnent par déplacement d'air. L'opérateur appuie sur un piston qui déplace un piston interne vers l'une des deux positions différentes. La première butée est utilisée pour remplir la pointe de la micropipette, et la deuxième butée est utilisée pour distribuer le contenu de la pointe. Lorsque l'opérateur enfonce le piston jusqu'à la première butée, un piston interne déplace un volume d'air égal au volume indiqué sur le cadran indicateur de volume. La deuxième butée sert uniquement à distribuer le contenu de l'embout.

Remplissage de la micropipette

  • Retirez le couvercle de la boîte contenant les pointes de micropipette de la bonne taille. Les pointes P-1000 peuvent être bleues ou transparentes, tandis que les pointes P-20 et P-200 sont jaunes ou transparentes.
  • Fixez la pointe en insérant la tige de la micropipette dans la pointe et en appuyant fermement (figure à droite). Cela devrait produire un joint étanche à l'air entre la pointe et l'arbre de la micropipette.
  • Remettez le couvercle de la boîte à embouts pour garder les embouts restants stériles. Évitez de toucher la pointe (en particulier l'extrémité la plus fine), car les pointes sont stériles.
  • Appuyez sur le piston de la micropipette jusqu'au PREMIER arrêt.
  • Immerger l'embout à quelques millimètres sous la surface de la solution aspirée dans le

    pipette. Le pipetage est plus précis lorsque la pipette est tenue verticalement. Gardez l'angle moins

    à 20 ̊ de la verticale pour de meilleurs résultats.

  • Relâchez le piston LENTEMENT, permettant à la pointe de se remplir en douceur. Faites une brève pause pour vous assurer

    que le plein volume d'échantillon est entré dans la pointe. Ne laissez PAS le piston se casser. Ceci est particulièrement important lors du transfert de volumes plus importants, car une éclaboussure pourrait contaminer la tige de la micropipette. Si vous contaminez l'arbre par inadvertance, nettoyez-le immédiatement avec un Kimwipe humide.

avertir

NE JAMAIS poser une micropipette avec du liquide dans son embout sur la paillasse !

Distribution du contenu de la micropipette

  • Placer la pointe de la micropipette contre le côté du tube à essai de réception. La tension superficielle aidera à distribuer le contenu de la micropipette. N'essayez PAS d'éjecter le contenu de la micropipette dans « l'air fin ».
  • Appuyez doucement sur le piston jusqu'au premier arrêt. Faites une pause, puis appuyez sur le piston jusqu'au deuxième arrêt. Le contenu de la pipette doit avoir été largement libéré au premier arrêt. Le deuxième arrêt garantit que vous avez libéré la "dernière goutte".
  • Utilisez l'éjecteur de pointe pour jeter la pointe.

Attention


Adapter les techniques de laboratoire à l'enseignement à distance

Pablo Perez-Pinera, à gauche, et Karin Jensen ont développé des exercices de laboratoire à distance pour aider les étudiants à apprendre des techniques de laboratoire courantes. Crédit : Karin Jensen

La pandémie de COVID-19 a obligé les instructeurs à adapter leurs cours pour l'apprentissage en ligne. Les cours en laboratoire étaient particulièrement difficiles en raison du manque d'accès à des équipements spécialisés pour les apprenants à distance. Pour surmonter ce défi, des chercheurs de l'Université de l'Illinois Urbana-Champaign ont conçu un exercice de laboratoire pour apprendre aux étudiants à utiliser des micropipettes, grâce à l'apprentissage à distance, en utilisant des kits à domicile.

Les micropipettes sont des instruments de laboratoire courants et essentiels et sont utilisées dans plusieurs domaines, notamment la biologie moléculaire, la microbiologie et la biochimie. Ils sont utilisés pour transférer avec précision de très petits volumes de liquide. Pour enseigner aux élèves comment utiliser ces instruments, les chercheurs ont développé des kits, coûtant 135 $ par élève, ce qui représente une fraction du coût de l'équipement pédagogique normalement utilisé pour les cours en personne.

"Bien que des kits de laboratoire aient été développés précédemment, ils ne se sont pas concentrés sur les compétences de micropipetage", a déclaré Karin Jensen, professeure adjointe d'enseignement en bio-ingénierie, qui a travaillé avec le professeur agrégé de bio-ingénierie Pablo Perez-Pinera (ACPP) pour développer le projet. « Dans un effort pour offrir aux étudiants à distance une expérience de laboratoire, nous avons développé et expédié des kits aux étudiants. Ces kits contenaient du matériel et des réactifs leur permettant de pratiquer leur technique et d'effectuer des expériences à distance.

Chaque kit contenait une mini-balance, un glucomètre, un pipet-aid et un jeu de micropipettes. Chaque étudiant a reçu le kit, une vidéo d'instruction et un manuel de laboratoire. Il leur a été demandé de suivre le protocole étape par étape dans le but d'apprendre à diluer correctement les solutions de glucose et de vérifier leur exactitude à l'aide du glucomètre. Ils ont également partagé leurs données avec les instructeurs pour les commentaires et la notation.

Les étudiants ont également rempli des sondages et des formulaires de commentaires sur l'efficacité de ces cours en ligne. "Nous avons constaté que la plupart des étudiants étaient enthousiastes à l'idée d'utiliser du matériel de laboratoire malgré le fait qu'ils se trouvent dans une section en ligne", a déclaré Jensen.

Les chercheurs travaillent maintenant à améliorer l'exercice. « Au-delà de COVID-19, il est toujours nécessaire de développer des opportunités d'apprentissage en laboratoire à distance pour les étudiants qui ne peuvent pas assister aux laboratoires en personne », a déclaré Jensen. "Les activités de laboratoire à distance, similaires à ce que nous décrivons, seront importantes pour accroître l'accès à l'éducation STEM."


2.1 : Bien utiliser les micropipettes - Biologie

Dans ce laboratoire, nous avons appris à utiliser correctement les micropipettes et la technique de l'électrophorèse sur gel. En cela, nous pourrions expliquer l'importance de ces deux outils et ce qu'ils font. Enfin, nous avons appris comment le génie génétique peut être utilisé pour traiter certaines maladies.

  1. Il est important d'utiliser des valeurs petites et exactes, car vous pouvez ainsi être sûr de savoir exactement ce que vous mettez et d'être plus précis. C'est bien parce que ce avec quoi vous travaillez en génie génétique est microscopique.

  1. Il est important de voir la solution entrer et sortir du pourboire car vous savez alors que vous transférez à coup sûr la solution.
  2. Les précautions avec la pointe de pipette sont importantes car les bactéries de votre corps pourraient potentiellement désériliser la pointe et altérer vos résultats.
  1. Il est important d'utiliser l'électrophorèse sur gel car les brins d'ADN les plus gros et les plus petits se sépareront au cours du processus, ce qui rendra l'ADN plus facile à manipuler.

1. Ils doivent avoir une charge négative car ils sont attirés par les charges positives.


Extraction des lipides en une seule étape des denrées alimentaires

L'extraction des lipides totaux à partir d'échantillons biologiques est une technique couramment utilisée pour évaluer les lipides individuels qui composent un tissu. L'une des méthodologies les mieux décrites pour les extractions lipidiques reste l'extraction de Folch, du nom de l'auteur du protocole, Jordi Folch, qui a décrit cette procédure dans un article fondateur publié en 1957. Elle est très vite devenue l'un des protocoles les plus utilisés de son époque, et est toujours l'étalon-or par rapport auquel tous les autres protocoles d'extraction de lipides sont jugés.

Le principe de cette technique est de suspendre d'abord les tissus homogénéisés en une seule phase (système monophasique) par l'ajout d'un mélange chloroforme:méthanol (2:1, v/v). Ce mélange de solvants est choisi car il est modérément polaire (voir l'indice polaire ci-dessous), ce qui est utile car les cellules qui composent le tissu sont principalement constituées d'eau - vous voulez pouvoir maximiser la quantité de polaire et composants non polaires qui peuvent être dissous (alias perturbation des forces intermoléculaires).

A ce stade de l'extraction, l'échantillon lipidique n'est pas pur. De nombreux lipides sont encore fortement associés à des composants non lipidiques tels que les protéines et les glucides (polysaccharides), reflétant leurs rôles biologiques dans les cellules. Ces « contaminants » peuvent être éliminés par l'ajout d'une solution aqueuse (NaCl ou KCl par exemple), ce qui aide le mélange à se répartir en 2 phases (système biphasique). Les lipides sont aspirés dans la partie chloroformique, la moins polaire et la plus dense, et représente environ 60 % du volume total. La phase supérieure, qui est principalement du méthanol et de l'eau, contient principalement des contaminants non lipidiques (bien qu'une quantité résiduelle de lipides plus polaires puisse être présente).

Dans ce protocole, nous avons adapté l'extraction Folch pour isoler les lipides des aliments riches en lipides courants : avocats, œufs et mayonnaise. Ces lipides peuvent ensuite être séparés par chromatographie sur couche mince, ce qui nous donne un aperçu des lipides présents dans chaque ingrédient.

Composant de réaction Densité Indice de polarité*
Chloroforme 1,49 g/cm3 4.1
Méthanol 0,79 g/cm3 5.1
0,73% NaCl (H2 O) 1.01. g/cm3 10.2

* L'indice de polarité est une mesure de la réactivité du solvant avec divers solutés de test polaires. Plus l'indice de polarité est élevé, plus le solvant est polaire.


2 réponses 2

Cela fonctionne pour EF Core 2.1, mais si vous utilisez EF Core 3.0 ou des versions supérieures, veuillez vous référer à cette réponse complète.

Je peux voir que l'extension SqlQuery a été changée en FromSql

Mais la nouvelle méthode FromSql est plus restrictive que SqlQuery . La documentation de cette méthode explique qu'il existe des limitations telles que :

Les requêtes SQL ne peuvent être utilisées que pour renvoyer types d'entités qui font partie de votre modèle. Il y a une amélioration sur notre backlog pour permettre le retour de types ad-hoc à partir de requêtes SQL brutes.
La requête SQL doit renvoyer des données pour toutes les propriétés du type d'entité ou de requête.

[. ]
Mise à jour : discussion GitHub dotnet/efcore plus récente Prise en charge des requêtes SQL brutes sans définir de type d'entité pour le résultat #10753

Donc, dans votre cas, la requête SQL que vous utilisez est la suivante :

Comme le dit la documentation, vous ne pouvez utiliser FromSql qu'avec type d'entité ou de requête. Votre requête SQL ne renvoie pas toutes les données de votre entité définie dans votre modèle mais elle ne renvoie qu'une colonne de votre entité. Au fait, une nouvelle fonctionnalité est introduite dans EF Core 2.1 qui est en version Release Candidate depuis le 7 mai 2018. Microsoft déclare :

EF Core 2.1 RC1 est une version « démarrée », ce qui signifie qu'une fois que vous avez testé que votre application fonctionne correctement avec RC1, vous pouvez l'utiliser en production et obtenir le support de Microsoft, mais vous devez toujours mettre à jour vers la version stable finale une fois qu'elle est disponible .

##Utilisation de FromSql sur le type de requête##

Un modèle EF Core peut désormais inclure des types de requêtes. Contrairement aux types d'entité, les types de requête n'ont pas de clés définies sur eux et ne peuvent pas être insérés, supprimés ou mis à jour (c'est-à-dire qu'ils sont en lecture seule), mais ils peuvent être renvoyés directement par des requêtes. Certains des scénarios d'utilisation des types de requêtes sont : mappage vers des vues sans clés primaires, mappage vers des tables sans clés primaires, mappage vers des requêtes définies dans le modèle, servant de type de retour pour les requêtes FromSql()

Si vous souhaitez utiliser la fonctionnalité de type de requête avec votre texte SQL, vous définissez d'abord une classe, appelons-la MySuperClass :

Ensuite, dans votre classe DbContext, définissez une propriété de type DbQuery<MySuperClass> comme ci-dessous :

Enfin, vous pouvez utiliser FromSql dessus comme ci-dessous :

##Je ne veux pas utiliser DbQuery<T> ## Si vous ne voulez pas utiliser DbQuery<T> et que vous ne voulez pas définir une classe contenant une seule propriété, vous pouvez utiliser ExecuteSqlCommandAsync comme @vivek nuna fait dans sa réponse (sa réponse est partiellement correcte). Mais vous devez savoir que la valeur renvoyée par cette méthode est le nombre de lignes affectées par votre requête. Vous devez également mettre votre titre en paramètre de sortie afin de faire de votre requête une procédure stockée. Utilisez ExecuteSqlCommandAsync ou ExecuteSqlCommand et après cela, lisez le paramètre de sortie que vous avez passé lors de l'appel de la méthode.

Un moyen plus simple sans créer de procédure stockée et donc sans utiliser ExecuteSqlCommandAsync ou ExecuteSqlCommand consiste à utiliser le code suivant :


Preuve

Nous montrons que chaque élément est compté une fois.

Dire qu'un élément est dans ensembles. Sans perte de généralité, ces ensembles sont

On procède par induction. Ceci est évident pour

Si cela est vrai pour nous prouvons que c'est vrai pour Pour chaque ensemble d'ensembles ne contenant pas avec la taille il existe un ensemble d'ensembles contenant avec la taille Dans PIE, la somme du nombre de fois que ces ensembles sont comptés est Il y a aussi un ensemble supplémentaire d'ensembles donc est compté exactement une fois.


Bienvenue au Goldberg Lab

Depuis 1973, le laboratoire Goldberg étudie les processus moléculaires contrôlant le développement de cellules spécialisées chez les plantes supérieures. Notre objectif à long terme est de comprendre les gènes et les réseaux de régulation nécessaires à la fabrication d'une graine. Nos projets de recherche sont soutenus par le programme du génome végétal de la National Science Foundation (NSF).

Les principales questions auxquelles notre recherche s'attaque sont (1) comment les gènes sont organisés dans le génome, (2) quels sont les mécanismes qui contrôlent la régulation de l'expression des gènes des plantes, (3) quelles sont les séquences qui programment l'expression des gènes des plantes au cours du développement, ( 4) quels sont les gènes qui contrôlent la différenciation de types de cellules végétales spécifiques, et (5) quels événements amènent une cellule indifférenciée à adopter un état spécialisé. Nous utilisons une variété d'approches génomiques et de plantes modèles pour répondre à ces questions &mdash avec un accent particulier sur l'identification et l'utilisation de l'approche la mieux adaptée pour répondre à chaque question spécifique.

Le professeur Goldberg est entièrement dévoué à l'enseignement et à l'éducation du public. Il a créé et enseigne actuellement un nouveau cours parrainé par la NSF qui utilise l'apprentissage à distance pour enseigner simultanément aux étudiants de l'UCLA, de l'UC Davis et de l'Université Tuskegee.


Professeur
Membre de l'Académie nationale des sciences
Professeur à l'Institut médical Howard Hughes
Fondateur de Cellule de plante Journal


2.1 : Bien utiliser les micropipettes - Biologie

Les binaires compilés (pour Mac, Windows et Linux) sont disponibles à partir du référentiel FigTree GitHub.

Figuier

FigTree est conçu comme un visualiseur graphique d'arbres phylogénétiques et comme un programme de production de figures prêtes à être publiées. Comme pour la plupart de mes programmes, il a été écrit pour mes propres besoins, il n'est donc peut-être pas aussi raffiné et complet qu'un programme commercial. En particulier, il est conçu pour afficher des arbres résumés et annotés produits par BEAST.

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Historique des versions

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Informations sur l'auteur

Affiliations

Département de chimie et de biologie chimique, Université Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Yoav Adam, Jeong J. Kim, Shan Lou, Michael E. Xie, Daan Brinks, Hao Wu, Simon Kheifets, Vicente Parot, Katherine J. Williams, Benjamin Gmeiner, Samouil L. Farhi & Adam E. Cohen

Département de chimie, Université de l'Alberta, Edmonton, Alberta, Canada

Yongxin Zhao et Robert E. Campbell

Département de cellules souches et de biologie régénérative, Université Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Mohammed A. Mostajo-Radji & Paola Arlotta

Département de neurobiologie, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Selmaan Chettih et Christopher D. Harvey

Allen Institute for Brain Science, Seattle, WA, États-Unis

Linda Madisen et Hongkui Zeng

Département de statistique, Columbia University, New York, NY, États-Unis

E. Kelly Buchanan, Ian Kinsella, Ding Zhou et Liam Paninski

Institut médical Howard Hughes, Chevy Chase, MD, États-Unis

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Contributions

Y.A. ont réalisé les expériences de patch-clamp et d'imagerie dans des tranches aiguës, des neurones en culture et in vivo. J.J.K. effectué des mesures de patch-clamp dans des cellules HEK293T. Y.A. et Y.Z. réalisé l'ingénierie des protéines, sous la supervision de l'A.E.C. et R.E.C., respectivement. Y.A. et D.B. réalisé des expériences de spectroscopie. Y.A. a développé le système d'imagerie avec l'aide de H.W., J.J.K., S.K. et V.P. S.L., L.M. et H.Z. développé et caractérisé les souris Ai155 Optopatch3. M.A.M.-R. électroporation in utero, supervisée par P.A. M.E.X. optimisé et validé l'algorithme de décomposition matricielle pénalisée – factorisation matricielle non négative en collaboration avec E.K.B., I.K., D.Z et L.P. S.C. et C.D.H. réactifs partagés non publiés pour le ciblage soma des opsines. K.J.W. aidé en biologie moléculaire. B.G. a effectué la simulation de chauffage. S.L.F. conçu la construction CheRiff-HA. Y.A. et A.E.C. conçu le projet, analysé les données et rédigé le manuscrit. A.E.C. supervisé tous les aspects du projet.

Auteur correspondant


Figure supplémentaire 1 La migration des cellules Blebbing Walker est indépendante de l'adhérence focale mais dépend d'un gradient de contractilité de la myosine vers l'arrière.

une, Instantané et kymographe d'une cellule de Walker blebbing dans un microcanal (8 × 8 m) recouvert de 50 g ml -1 de β-Lactoglobuline. Barres d'échelle : horizontale : 10 m, verticale : 50 s. b, Le tracé montre la vitesse instantanée des cellules de Walker dans des microcanaux recouverts de 50 g ml -1 de BSA ou de -lactoglobuline. P-value: Welch's recto-verso t-test, m: nombre de cellules analysées dans 2 (BSA) et 3 (β-Lactoglobuline) expériences indépendantes. Les boîtes dans les boîtes à moustaches s'étendent du 25e au 75e centiles, avec une ligne à la médiane. Les moustaches s'étendent jusqu'à 1,5 × IQR (plage interquartile) ou les points de données max/min. c, les cellules Blebbing Walker exprimant GFP-FAK ne forment pas d'adhérences focales détectables lors de la migration sous agarose, tandis que les cellules Walker adhérentes montrent des adhérences focales lors de la migration 2D sur verre. Les flèches indiquent la direction de la migration. Barres d'échelle : 10 m. , Pistes de migration des cellules de Walker blebbing sous agarose sur verre, verre revêtu de PEG et surfaces à faible attachement disponibles dans le commerce. Les cellules ont été suivies manuellement pendant 52 min. Barres d'échelle : 50 m. e, Vitesse de migration sous agarose des cellules avec des niveaux d'expression de Talin réduits (voir également Fig. 5 supplémentaire). P-value: Welch's recto-verso t-test, m: nombre de cellules analysées dans 2 expériences indépendantes. Les boîtes dans les boîtes à moustaches s'étendent du 25e au 75e centiles, avec une ligne à la médiane. Les moustaches s'étendent jusqu'à 1,5 × IQR (plage interquartile) ou les points de données max/min. F, La double ablation laser du cortex d'actomyosine à l'arrière du corps cellulaire (intensités de myosine et d'actine F les plus élevées) a provoqué une forte diminution instantanée de la vitesse cellulaire par rapport à une double ablation à l'avant de la cellule. Barres d'échelle : horizontale : 10 m, verticale : 50 s. Le graphique montre la réduction de la vitesse cellulaire en % par rapport à la vitesse de pré-ablation. Barres horizontales : valeurs moyennes. P-value: Welch's recto-verso t-test m: nombre de cellules analysées dans 3 (arrière) et 2 (avant) expériences indépendantes. g, Images confocales de cellules de Walker marquées avec MRLC-GFP : panneau supérieur : section corticale, panneau inférieur : section médiane. Barre d'échelle : 10 m. Les rectangles blancs mettent en évidence le ROI choisi pour l'analyse de l'intensité de la myosine II. h, Pour obtenir des profils d'intensité de la myosine corticale (panneau i), nous avons soustrait le profil d'intensité de fluorescence normalisé dans la section cellulaire du milieu (fond cytoplasmique, gris) du profil d'intensité de la myosine acquis à la surface cellulaire (noir). m = 33 cellules de 5 expériences indépendantes. (je), Profils relatifs d'intensité de fluorescence de la myosine au cortex pour différentes conditions de friction. n : nombre de cellules analysées dans 5 (BSA), 3 (BSA/F127) et 5 (F127) expériences indépendantes Toutes les barres d'erreur : SEM

Figure supplémentaire 2 Variation et mesure du frottement du substrat.

une, Conception de la puce microfluidique utilisée pour les mesures de frottement. 3 ports d'entrée étaient reliés à des réservoirs. L'explosion montre la région avec dérivation (h : 8 m, w : 50 m) et canal d'analyse (h : 8 m, w : 8 m). La micrographie montre une seule cellule entrant dans le canal d'analyse. Barre d'échelle : 10 m. b, Schéma du montage de mesure et principe de régulation de débit. La différence de pression et donc le débit ont été contrôlés en ajustant la hauteur du réservoir E3 par rapport aux autres réservoirs E1 et E2. c, Calibration du débit moyen libre dans le dispositif de friction microfluidique basé sur le suivi de billes fluorescentes. n : nombre de mesures regroupées à partir de plusieurs expériences indépendantes comme indiqué sur la figure. , Projections d'intensité maximale des Z-stacks prélevées au niveau des régions d'entrée des microcanaux recouverts de 50 g ml -1 de BSA-488 fluorescent mélangé à 0 g ml -1 , 30 g ml -1 ou 200 g ml -1 F127. Barres d'échelle : 10 m par exemple, Vitesses cellulaires et ajustements linéaires dans des dispositifs de friction microfluidiques revêtus de F127, BSA-F127 mix ou BSA. Les barres d'erreur représentent les SEM. Pour e m = 9 cellules analysées à partir de 3 expériences indépendantes pour F m = 10 cellules analysées à partir de 2 expériences indépendantes pour g m = 9 cellules analysées à partir de 3 expériences indépendantes. h. Coefficient de frottement du substrat cellulaire mesuré pour les canaux revêtus de F127, BSA-F127-mix et BSA. n : nombre de cellules analysées à partir de 3 (F127), 2 (BSA/F127) et 3 (BSA) expériences indépendantes.

Figure supplémentaire 3 Description mécanique de la migration focale indépendante de l'adhésion.

une, Contact entre une cellule de Walker et la paroi du canal visualisé en utilisant la microscopie à réflexion interférentielle (IRM). Barre d'échelle : 10 m. b, Panneau supérieur : projection d'intensité maximale moyenne dans le temps (3 min) de la surface d'une cellule exprimant MRLC-GFP. Sur des échelles de temps dépassant le cycle de vie de la bulle, le front cellulaire a une forme moyenne presque hémisphérique. Barre d'échelle : 10 m. Panneau inférieur : Paramétrisation et géométrie de la surface de cellule axisymétrique. c, Coordonnées utilisées dans différentes parties de la cellule. , Panneau supérieur : profil linéaire de la tension active générée par la myosine ??(x) le long de l'axe de la cellule utilisé pour les calculs analytiques. Panneau inférieur : Profils d'écoulement cortical rétrograde le long de la cellule (cadre de référence de la cellule). La vitesse d'écoulement cortical dépend du coefficient de frottement. [vnorme = (?? (r) − ?? (F) )L/??]. e, Vitesse de la cellule et pression externe. Panneau supérieur : Schéma des pressions internes et externes agissant sur la cellule. Panneau inférieur : Relation entre la vitesse de la cellule et la différence de pression externe indiquée pour les valeurs des paramètres dans le tableau 1 (note supplémentaire). La pression de décrochage de -15 Pa est inférieure de trois ordres de grandeur aux valeurs rapportées pour les cellules adhésives dans les micropipettes (environ -2 kPa, note supplémentaire, référence 17). F, Panneau supérieur : Schéma des forces de frottement et de traînée agissant sur la cellule en l'absence d'une différence de pression externe. Dans la région où la cellule entre en contact avec la paroi du canal, l'écoulement relatif du cortex vers la paroi génère une force de friction. Au niveau des régions polaires, les forces de traînée du fluide exercées par le milieu environnant s'opposent aux forces de frottement propulsives. Panneau inférieur : vitesse cellulaire (traits pleins) et vitesse maximale du cortex par rapport à la paroi du canal (traits pointillés) en fonction du coefficient de frottement ?? et le coefficient de traînée ??. Le mouvement cellulaire se produit au-dessus d'un seuil de friction ?? , fixé par le coefficient de traînée du fluide : lorsque le frottement est trop faible, les cellules ne peuvent pas migrer contre la force de traînée exercée par le fluide dans le canal. g, Comparaison entre l'évaluation numérique du point d'inflexion de la vitesse cellulaire U(??) (points) et la relation approximative proposée ?? ∗ = /(2L) (ligne), voir Eq. 49. [??norme = ??/L 2 ]. Point rouge : valeur obtenue à partir de la procédure d'ajustement aux données expérimentales.

Figure supplémentaire 4 Rôle du noyau et frottement interne (a–d), hydraulique du système canal-cellule (e), validation du coefficient de traînée du fluide estimé (f–h) et des forces exercées sur les parois du canal (i).

(une), Quantification de la section efficace nucléaire. Barre d'échelle : 10 m. avant JC, La section transversale nucléaire n'est pas en corrélation avec la vitesse de la cellule dans les canaux à friction intermédiaire (b) ou élevée (c). NExp = 1(b) ou 4(c). (), Schéma du frottement interne provenant du matériel intracellulaire. Dans cette description, la différence de pression intracellulaire entre l'arrière et l'avant de la cellule migrante est compensée par les forces de frottement Fentier exercée par le cortex d'actine (voir SI section 4.2). (e), Une seule cellule migrant dans un canal subit des forces de traînée régies par les résistances à l'écoulement du fluide dans le canal. Un segment de canal contenant une cellule offre une résistance à l'écoulement ?? tandis que le canal rempli de fluide est caractérisé par la résistance ??c. Lorsque plusieurs cellules migrent dans un canal, le coefficient de traînée du fluide dépend principalement de la résistance à l'écoulement des segments de cellule ??. Pour la définition des résistances à l'écoulement du fluide de la partie arrière et avant du canal ??c (r) et ??c (F) voir les équations 51-52. (F), La vitesse moyenne d'écoulement du fluide induite par les cellules en migration a été estimée en suivant des microsphères dans des canaux avec des cellules en migration rapide. Barre d'échelle : 10 m. (g), Kymographe d'une matrice de microcanaux revêtue de BSA avec plusieurs cellules migrantes marquées avec MRLC-GFP. Barres d'échelle : horizontale : 500 m, verticale : 30 min. (h), Histogramme des vitesses cellulaires dans les canaux revêtus de BSA obtenus à partir de kymographes de l'ensemble de microcanaux. Pour permettre la comparaison avec les mesures de débit de fluide dans les canaux avec des cellules à migration rapide, les fenêtres temporelles sans vitesses cellulaires supérieures à 5,45 m min -1 ont été rejetées. Le seuil a été choisi en fonction du quantile 0,1 de la distribution des vitesses des cellules polarisées rapides utilisées pour l'analyse du flux cortical. m = 164 cellules de 2 expériences indépendantes. (je), Répartition des forces exercées par la migration des cellules de Walker sur la paroi du canal dans les canaux de friction grands, intermédiaires et petits. La direction de la migration cellulaire est vers la droite, la force est orientée en moyenne dans la direction opposée au mouvement cellulaire et les amplitudes de contrainte sont dans la plage mPa-Pa.